Regulation of Kif18A by Cdk1 phosphorylation  .1 Cdk1 phosphorylates Kif18A at S674 in vitro and in vivo

There is increasing evidence that molecular motors are temporally and spatially  regulated, for example by phosphorylations, to ensure their specific tasks at the  correct time and at the correct location in the spindle^87‐89. The essential role of Kif18A  in chromosome congression suggests that the activity of Kif18A has to be controlled  in a precisely spatiotemporal manner.  

As the timing of Kif18A phosphorylation correlates with the activity of Cdk1‐

cyclinB1 and of Plk1, these data suggest that Kif18A is a phosphotarget of Cdk1 and  Plk1 in vivo and suggest that the acitivity of Kif18A is regulated by phosphorylation  during mitosis. 

3.2.1.1 Cdk1 and Plk1 phosphorylate the C‐terminus of Kif18A in vitro 

Consistent with the in vivo studies, our in vitro kinase assays, demonstrate that His‐

Kif18A^FL and His‐Kif18A^C593‐898 are substrates of Cdk1 and Plk1 in vitro (Fig 2.3.4A). 

These in vitro kinase assays revealed that the C‐terminus of Kif18A is stongly  phosphorylated by Cdk1‐cyclinB1 (Fig 2.2.4) and by Plk1 (Fig 2.3.4B). 

Taken together, based on our data it is likely that the activity of Kif18A is regulated  by Cdk1 and Plk1 via C‐terminal phosphorylation events. Notably, it has been  published that basic kinetic properties (e.g. motility or binding) of CENP‐E and of  EG5 are regulated by Cdk1 phosphorylation of their C‐termini^87‐88. (discussed in  more detail under 3.2.4) 

3.2.2 Regulation of Kif18A by Cdk1 phosphorylation  3.2.2.1 Cdk1 phosphorylates Kif18A at S674 in vitro and in vivo 

Our data revealed that Kif18A is phosphorylated in vitro at its C‐terminus by Cdk1. 

Moreover, serin to alanine substitutions at S674 and S684 indicate that these both  sites are the major Cdk1 phosphorylation sites in vitro.  

Most importantly, in extracts prepared from HeLa cells stably expressing GFP‐

Kif18A harbouring a serin to alanine substitution at S674 the characteristic mitotic  upshift  of  Kif18A  was  also  significantly  abrogated  compared  to  cells  stably  expressing GFP‐Kif18A^WT. Additionally, sequence analyses revealed that S674 is an  evolutionary  conserved  phosphorylation  site  matching  the  preferred  Cdk1  consensus motif. In summary, these data suggest that S674 is one of the major Cdk1  phosphorylation sites at Kif18A and may Cdk1 phosphorylation regulates Kif18A at  S674 in vitro and in vivo.  

3.2.2.2 Cdk1 phosphorylation of Kif18A and chromosome dynamics  

Our immunofluorescence analyses revealed that in Kif18A RNAi‐background, GFP‐

Kif18A^WT and GFPKif18A^S674D but not GFPKif18A^S674A efficiently accumulated at the  plus tips of kinetochore microtubules. Functional analysis of Kif18A‐RNAi HeLa  cells expressing Kif18A^S674A revealed that these cells were characterized by a slight  increase in the duration from NEBD to anaphase onset compared to Kif18A‐RNAi  cells  expressing  Kif18A^WT or  Kif18A^S674D (Fig  2.2.6B). Moreover,  the stable co‐

expression of HeLa cells with GFP‐Kif18A^S674A and mcherry‐histon2B revealed that  in a subset of these cells, chromosomes moved occasionally out and back into the  metaphase  plates  (Fig2.2.6A).  In  addition,  cells  expressing  GFP‐Kif18A^S674A  displayed broader metaphase plates compared to cells expressing GFP‐Kif18A^WT or  GFP‐Kif18A^S674D (Fig 2.2.6E). Analysis of the interkinetochore distance (IKD) – a  measurement of the distance between kinetochores of the two sisterchromatids –  revealed  that  cells  expressing  GFP‐Kif18A^S674A  displayed  reduced  distances  compared to cells expressing GFP‐Kif18A^WT (data not shown).  

In conclusion, Cdk1 phosphorylation appears to be involved in promoting the  proper localization of Kif18A to the plus tips of kMTs and hence in controlling  mitotic chromosome alignment.  

Is the phosphorylation of S674 by Cdk1 involved in the asymmetric localization of  Kif18A? Does the phosphorylation of Cdk1 increases the affinity of Kif18A for  either the lagging or the leading kinetochore? Attempts to answer these questions  may come  from  previous localization  studies which have  shown  that  Kif18A  distributes asymmetrically to kinetochores²⁴, however experimental evidence for the  selective targeting of Kif18A to either the lagging or the leading kinetochore is  lacking. Based on the in vitro findings it is assumed that the kinesin‐8 motors  preferentially target to the plus tips of longer kMTs. Support for this assumption  comes from studies from Jaqaman et al. who postulated that MCAK depolymerizes  kMTs at the leading kinetochore, while Kif18A promotes depolymerization at the  lagging one⁶⁶. It is tempting to conclude that Cdk1, by phosphorylating Kif18A, may  promote  the  selective  targeting  and  accumulation  of  the  motor  to  the  outer  kinetochore of sisterchromatids stably attached to spindle microtubules.  

It is also interesting to consider whether Cdk1 phosphorylation at S674 is involved  in the dynamic linkage of Kif18A to disassembling kMTs to generate force. 

Cdk1 phosphorylation may promote the association of Kif18A with other plus tip  binding  proteins  and/or  linkerproteins  which  may  stabilizes  kinetochore‐

microtubule interactions to ensure the stable but dynamic linkage of Kif18A to  kinetochores. This idea is might be in line with this report indicating that the Cdk1‐

cyclinB1  complex  functions  in  efficient  attachment  of  microtubules  to  kinetochores¹²⁵. Thus, in consistence with this idea are our time lapse microscopy  studies which indicate that cells expressing GFP‐Kif18A^S674A are partially impaired  to maintain stable attachments allowing a subset of these chromosomes to escape  from  the  metaphase  plate  (Fig  2.2.6A).  Consistent  with  the  impaired  KT‐MT  interactions are the reduced IKD of cells expressing GFP‐Kif18A^S674A as the IKD  reflects the tension acting on attached, bioriented sisterchromatids.  

Thus,  it  is worth  to  test whether cells  expressing  GFP‐Kif18A^S674A display  an  increased  cold‐sensitivity  indicative  of  impaired  kinetochore‐microtubule  interactions compared to cells expressing GFP‐Kif18A^WT and if so, to test whether  components of the spindle assembly checkpoint localize to these kinetochores. It  would be also of interst to investigate whether the phosphorylation of Kif18A at  S674 facilitates the interaction to other plus tip binding factors like CENP‐E or  CENP‐F. 

To conclude, of particular interest is to investigate whether Cdk1 phosphorylation  does directly affect the intrinsic kinetic properties of Kif18A e.g. increase in the  affinity  for  the  plus  tips  or  indirect  by  regulating  the  activity  of  Kif18A  by  facilitating the interaction to other proteins which in turn regulate its activity.  

For example, recent studies demonstrate that the depolymerase activity of MCAK  (kinesin‐13) is coregulated by Aurora B (mitotic kinase) and inner centromere Kin‐I  stimulator ICIS¹²⁶. 

3.2.3 Regulation of Kif18A by Plk1 phosphorylation