Live cell imaging

For the RNAi of cells of a 1 well of a 12 well plate, ½ of the amounts were used. 

After 24 – 35 h cells were fixed and processed for immunofluorescence or lysed for  western blot analysis. 

4.3.7 RNAi rescue experiments  

For livecell rescue experiments HeLa cells stably coexpressing mcherry‐H2B and  GFP‐Kif18A were seeded at a density of 20000 per 12 well 30h before RNAi.  

The RNAi procedure is described above. After 26h the media was replaced by  medium with tetracycline (2.5μg/ml) or without tetracycline. 

For immunofluorescence rescue experiments the RNAi reaction was performed in a  6‐well plate with  40000 cells/ml.  

4.3.8 Immunofluorescence 

Cells were grown on coverslips and fixed and permeabilized for 12 min in fixation  buffer (100 mM Pipes pH 6.8, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 0.2 % Triton X‐100, 4 %  formaldehyde). Samples were washed with TBS + 0.1% Triton X‐100 (TBST) and  incubated for 1 h in TBST + 2 % BSA (Sigma) or o/n. All antibody incubations 

were carried out for 45 min at RT in blocking solution, followed by three washes in  TBST. TBST washed samples were embedded in mounting media (20 mM TrisHCl  pH 8.8; 0.5% phenylendiamine; 90% glycerol) 

4.3.9 Live cell imaging 

For live‐cell imaging, cells were grown in 12 well plates and processed as described  above. Before live cell imaging medium was replaced by CO²   independent medium   (Gibco, supplemented with 10 % FCS, penicillin‐streptomycin (100 U/ml and 100  μg/ml, respectively) and 1x Glutamax (Gibco) and the culture dish was placed onto  a heated sample stage within a heated chamber (37 °C).  

Live cell imaging was performed using a Zeiss Axiovert microscope (Zeiss) with a  Plan Apo 40x/0.95 objective. Images were captured with 60 msec (for mcherry‐H2B)  or 200 msec (for GFP Kif18A variants) exposure times in 5 to 10 minutes intervals  for 18 hours. MetaMorph software was used to collect and to process data. 

4.3.10 Microscopy 

For immunofluorescence studies and live cells studies the following microscopes  were used. 

Table 4.3.10 summarizes all microscopes used in this study. 

NAME  COMPANY 

Imager A.1   Zeiss 

Axiovert   zeiss 

Deltavision  Applied precision 

Inge   Zeiss 

Summary 

Mitosis,  the  process  by  which  identical  copies  of  the  replicated  genome  are  distributed to newly forming daughter cells, depends upon the action of the mitotic  spindle, a protein machine that uses mirotubules and microtubule‐based motor  proteins to assemble itself and to segregate sister chromatids^3; 132. The assembly and  the functions of the spindle apparatus are tightly regulated by the orchestrated  interplay of dynamic microtubules and motor proteins¹³². Members of the kinesin  superfamily are fundamental for the structure and function of the mitotic spindle  by  regulating  microtubule  dynamic  behaviour  to  ensure  the  fast  capture  of  chromosomes and the alignment of chromosomes at the metaphase plate.  

During my PhD thesis I could, by combining RNAi‐depletion experiments with in  vitro biochemical assays, demonstrate that the human kinesin Kif18A is a motile  microtubule depolymerase essential for chromosome congression in mammalian  tissue culture cells and thus identify the human kinesin Kif18A as a dual‐functional  kinesin.  In  vitro,  Kif18A  is  a  slow  plus‐end‐directed  kinesin  that  possesses  microtubule  depolymerizing  activity.  Notably,  Kif18A  depolymerizes  longer  microtubules more quickly than shorter ones. In vivo, Kif18A accumulates in mitosis  where it localizes close to the plus ends of kinetochore microtubules. The depletion  of Kif18A induces aberrantly long mitotic spindles and loss of tension across sister  kinetochores, resulting in the activation of the Mad2‐dependent spindle‐assembly  checkpoint  and  thus accounts  for the  observed  prometaphase  delay.  Live‐cell  microscopy studies revealed that Kif18A‐depleted cells fail to align chromosomes  correctly at the metaphase plate resulting in an elongated phase of chromosome  oscillations and thus in a delay of anaphase onset.  

Moreover, my studies indicate that Cdk1 and Plk1 activities are required for the  observed mitosis‐specific  upshift in  the  electrophoretic  mobility  of  Kif18A.  In  addition, the C‐terminus of Kif18A is phosphorylated by Cdk1 and Plk1 in vitro. 

Serine to alanine substitutions at 674 and 684 indicate that these both sites are the  major Cdk1 phosphorylation sites in vitro. Most importantly, the identified Cdk1  phosphorylation site S674 is one of the Cdk1 target sites in Kif18A in vivo.  

To examine the consequence of Cdk1 or Plk1 phosphorylation of Kif18A in vivo,  stable  cellines  expressing  either  non‐phosphorylatable  or  phosphorylation‐

mimicking  Kif18A  versions  were  generated.  Our  studies  focused  thereby  on  potential phosphorylation sites matching the consensus phosphorylation sequence  of Cdk1 ([Sp/Tp]‐P‐X‐[K/R]) or Plk1 ([D/E]‐X‐[Sp/Tp]). Moreover, these sites in Kif18A  were conserved among different species. The ability of the different Kif18A variants  to complement the loss of endogenous Kif18A was assayed by transfecting HeLa  cells with siRNAs targeting the ORF region of endogenous Kif18A transcripts and  by tetracycline induced expression of siRNA resistant GFP‐Kif18A^FL constructs. 

These studies revealed that HeLa cells expressing,  instead  of  the endogenous  protein, Kif18A with a mutation at the potential Cdk1 phosphorylation site S674,  GFP‐Kif18A^S674A, enter anaphase after a slight delay compared to cells expressing  GFP‐Kif18A^WT or GFP‐Kif18A^S674D. The identical phenotype was observed in cells  expressing GFP‐Kif18A^S859E, a Kif18A variant with a phosphomimic mutation of the  potential Plk1 phosphorylation site S859. Immunofluorescence studies demonstrate  that cells expressing GFP‐Kif18A^S859E do not correctly localize to the plus tips of  kMTs, indicating that the phosphorylation of Kif18A at S859 by Plk1 negatively  influences the localization of Kif18A. In contrast, cells expressing GFP‐Kif18A^S674A  showed reduced levels of Kif18A at the plus ends of kMTs, indicating that Cdk1  phosphorylation at S674 has a positive effect on the tip localization of Kif18A. 

In  addition, these  studies revealed that  Kif18A  harbouring a mutation at the  putative Cdk1 phosphorylation site S674 (S674A) or a mutation at the potential Plk1  phosphorylation site S859 (S859E) have defects in chromosome congression. 

Taken together, the studies presented here, identify Kif18A as a dual‐functional  kinesin  required  for chromosome  congression and timely ordered progression  through mitosis. These studies also indicate that Kif18A is a mitotic phosphoprotein  and a substrate of Cdk1 and Plk1. The data suggest that the phosphorylation of  Kif18A at S859 by Plk1 during prometaphase impairs the localization of Kif18A at  the  plus‐ends  of  kMTs  ensuring  ordered  chromosome  oscillations.  The  phosphorylation of Kif18A at S674 by Cdk1 promotes the accumulation to the plus  tips  of  kMTs  during  metaphase  controllling  chromosome  alignment  at  the  metaphase plate.  

Zusammenfassung 

Bei der Mitose handelt es ich um einen zellulären Prozeß, bei dem die replizierten  Kopien des Genoms auf die neu entstehenden Tochterzellen aufgeteilt werden. Um  diese Aufgabe erfüllen  zu  können, besitzen  die  Zellen  eine spezialisierte, auf  Mikrotubuli und Mikrotubuli assoziierte Proteine basierende zelluläre Struktur, die  mitotische Spindel. Der Aufbau und die Funktion des Spindelapparats werden  durch das genau abgestimmte Zusammenspiel von dynamischen Mikrotubuli und  präzise regulierten Motorproteinen bestimmt. 

Mitglider der Kinesin Superfamilie sind essentiell für die Struktur und Funktion  der mitotischen Spindel indem sie das dynamische Verhalten der Mikrotubuli  regulieren. Somit kommt ihnen eine Schlüsselfunktion bei der schnellen Anheftung  der  Chromosomen  an  die  Spindelmikrotubuli  und  deren  Anordnung  an  die  Metaphasen Platte zu. 

Während  meiner  Doktorarbeit  konnte  ich,  durch  das  Verbinden  der  RNA  Interferenz Methode  in vivo und durch  biochemische in vitro  Untersuchungen  zeigen, dass Kif18A eine motile Mikrotubulidepolymerase ist, die eine wichtige  Funktion bei der Anordnung der Chromosomen in Säugetierzellen ausübt und  somit  Kif18A  als  ein  einzigartiges  Motorprotein  mit  einer  dualen  Funktion  identifizieren. 

Die in vitro Untersuchungen ergaben, dass Kif18A eine langsame, zum Plus‐Ende  der  Mikrotubuli  gerichtete  Motoraktivität  mit  einer  Depolymeraseaktivität  vereinigt. Diese Untersuchungen ergaben auch, dass Kif18A eine längenabhängige  Mikrotubulidepolymerase ist, die längere Mikrotubuli schneller depolymerisiert,  als kürzere. In vivo akkumuliert Kif18A während der Metaphase an den Plus‐Enden  der  Kinetochormikrotubuli.  Die  Depletion  von  Kif18A  führt  zu  längeren  mitotischen  Spindeln  und  zu  erniedrigten  Interkinetochordistanzen,  die  zur  Aktivierung des Mad2 abhängigen Spindelkontrollpunktes  führen.  

Echtzeitaufnahmen ergaben, dass die Chromosomen in Kif18A depletierten Zellen  sich  durch  kontinuierliche  oszillierende  Bewegungen  auszeichnen,  die  eine  geordnetes Anordnen der Chromosomen in der Äquatorialebene verhindern, und  schließlich in einer zeitlichen Verzögerung des Beginns der Anaphase resultieren. 

Darüberhinaus konnten meine Untersuchungen aufzeigen, dass Cdk1 (engl. für  cyclin dependent kinase 1) und Plk1 (engl. für polo like kinase 1) Aktivitäten die  spezifisch  in  der  Mitose  beobachtete  langsamere  elektrophoretische  Wanderungsgeschwindikeit  von  Kif18A  verursachen.  In  vitro  Kinase  Untersuchungen zeigen, dass der C‐terminus von Kif18A ein Substrat der beiden  mitotischen Kinasen Cdk1 und Plk1 ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass es sich  bei S674 und S684 um die hauptsächlichen Cdk1 Phosphorylierungsstellen in vitro  handelt. Zudem deuten Versuche darauf hin, dass es sich bei S674 auch in vivo um  eine der Hauptphosphorylierungstellen von Cdk1 handelt.  

Um die physiologische Bedeutung dieser Phosphorylierungen aufzuklären, wurden  stabile Zellinien hergestellt, die nicht‐phosphorylierbare (Ser/Thr nach Ala) oder so  genannte  phosphorylierungsimitierende  (Ser/Thr  nach  Asp/Glu)  Mutanten  von  Kif18A  exprimieren.  Der  Fokus  lag  hierbei  auf  potentiellen  Phosphorylierungsstellen, die der Konsensus‐Phosphorylierungssequenz von Cdk1  ([Sp/Tp]‐P‐X‐[K/R]) oder Plk1 ([D/E]‐X‐[Sp/Tp]) entsprachen und in Kif18A aus den  verschiedenen  Spezies  konserviert  waren.  Die  Fähigkeit  der  einzelnen  Kif18A  Varianten,  den  Verlust  des  endogenen  Proteins  zu  komplementieren,  wurde  untersucht, indem  das  endogene  Kif18A mittels  der  RNA Interferenz Technik  depletiert wurde und  die Expression der  Kif18A  Varianten  durch  Tetrazyklin  induziert  wurde.  Diese  Studien  ergaben,  dass  Zellen,  welche  anstelle  des  endogenen  Proteins,  Kif18A  mit  einer  Mutation  an  der  potentiellen  Cdk1‐

Phosphorylierungsstelle S674, GFP‐Kif18A^S674A , exprimieren länger für den Eintritt  in die Anaphase benötigen.  

Der  identische  Phänotyp  wurde  in  Zellen  beobachtet,  welche  GFP‐Kif18A^S859E  exprimieren,  eine  Kif18A‐Mutante  mit  einer  phosphorylierungsimitierenden  Mutation  der  potentiellen  Plk1‐Phosphorylierungsstelle  S859.  Mittels  Immunofluoreszenzstudien konnte gezeigt werden, dass S859E nicht korrekt an die  Plus‐Enden der Mikrotubuli lokalisieren kann. Dies deutet darauf hin, dass die  Phosphorylierung  von  Kif18A  an  S859  durch  Plk1  die  Lokalisierung  negativ  beeinflusst. Im Gegensatz dazu ist bei Zellen, welche GFP‐Kif18A^S674A exprimieren,  die Akkumulierung an die Plus‐Enden erniedrigt und lässt vermuten, dass die  Phosphorylaierung durch Cdk1 die korrekte Lokalisierung von Kif18A an die Plus‐

Enden der Kinetochormikrotubuli fördert. Unsere Studien zeigen auch, dass Kif18A  mit einer Mutation an der putativen Cdk1‐Phosphorylierungsstelle S674 (S674A)  oder einer Mutation der potentiellen Plk1‐Phosphorylierungsstelle S859 (S859E)  Defekte in der korrekten Anordnung der Chromosomen an die Äquatorialebene  aufweist. 

Zusammengefasst zeigen die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse, dass es sich  bei  Kif18A  um  ein  Kinesin  mit  einer  dualen  Funktion  handelt  und  eine  entscheidene Rolle bei der Anodnung der Chromosomen an die Äquatorialebene  ausübt. Diese Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass sich bei Kif18A um ein  mitotisches  Phosphoprotein  handelt  und  ein  Substrat  der  beiden  mitotischen  Kinasen Cdk1 und Plk1 ist und deuten darauf hin, dass die Phosphorylierung  durch Plk1 an S859 in der frühen Prometaphase die Lokalisierung von Kif18A an  die  Plus‐Enden  der  Kinetochormikrotubuli  unterdrückt  um  geordnete  Chromosomenoszillierungen zu gewährleisten, wohingegen die Phosphorylierung  durch Cdk1 an S674 die Akkumulierung von Kif18A an die Plus‐Enden fördert, um  die  Etablierung  der  Chromosomenanordnung  in  die  Metaphasenplatte  sicherzustellen.