Kif18A controlls chromosome alignment by suppressing chromosome  oscillations

Length dependent depolymerases like kinesin‐8s could define the set length of  microtubules at which growth is exactly balanced by shrinkage. In this case a  length‐dependent  depolymerase,  by  antagonizing  such  polymerases  (a  MT  stimulating factor like CENP‐E) , would lead to a precisely defined microtubule  length at which the end concentration of the depolymerase equals a threshold, such  that  depolymerization  exactly  balances  growth.  Thus,  a  length‐dependent  depolymerase, together with growth‐promoting proteins, can lead to the precise  control of microtubule length. 

Therefore, and may in line with these ideas, is the most recent finding that Kif18A  interacts with CENP‐E, a microtubule elongation factor¹¹⁴. Thus, these two proteins  could provide the cellular machinery implicated in the coordinated, cooperative  length dependent control with the cell ensures the setting of length and position of  the spindle microtubules. How is this system regulated and controlled? Is this a self  feedback system? 

3.1.8 Kif18A controlls chromosome alignment by suppressing chromosome  oscillations 

Our  siRNA‐based  studies  indicate  that  Kif18A  is  required  for  chromosome  congression (Fig 2.1.5). In line with our results are genetic and siRNA based studies  from  other  organism  demonstrating  that  kinesin‐8s  are  implicated  in  mitotic  chromosome alignment21‐22; 24; 28; 31; 64. 

3.1.8.1 How do kinesin‐8 motors functionally contribute to chromosome congression?  

Studies from Stumpff et al. using high‐resolution live cell imaging combined with  quantitative  measurements  of  kinetochore  movements  revealed  that  Kif18A  controls the persistent movement of chromosomes by both increasing the rate at  which  they  make  directional  switches  and  slowing  the  velocity  of  their  movements²⁴.  

Furthermore, Kif18A’s accumulation on kMTs and its ability to suppress oscillatory  movements are dependent on its motor activity and vary within the spindle. Based  on this data, Stumpff and colleagues proposed a model in which Kif18A utilizes a  combination  of  length‐dependent  plus‐end  accumulation  and  concentration‐

dependent modulation of kMT plus‐end dynamics to affect kinetochore velocity  leading to controlled mitotic chromosome positioning²⁴. A more recent report by  Jaqaman using an automated 4D live cell assay for systematic probing of HeLa  kinetochore dynamics demontrated that, consistent with Stumpff et al., depletion of  Kif18A increased the oscillation speed of aligned kinetochores while depletion of  MCAK increased it^{24;  66}. However, in disagreement with Stumpff et al. Kif18A  depletion  did  not  significantly  changed  the  average  oscillation  and  breathing  periods (the bundles of kinetochore‐bound microtubules alternate between phases  of  growth  and  shrinkage,  making  chromosomes  undergo  regular  oscillatory  movements along the spindle axis. These movements are, in general, accompanied  by  changes  in  the  distance  between  sister‐kinetochores,  which  are  commonly  referred to as breathing). The discrepancy may arise from manual selection of  sisters as opposed to a comprehensive tracking of a large set of sister kinetochore  pairs in 4D. 

Jaqaman and coauthors suggested that Kif18A together with MCAK primarily set  the speed of kinetochore oscillations and breathing with possibly other regulators of  MT stability and turnover. Their data led them propose the following model in  which MCAK and Kif18A have opposing effects on oscillation speed suggesting  that these two kinetochore‐associated MT depolymerases are mutual antagonists in  regulating the speed of sister kinetochore oscillations.  

The speed decrease and increase induced by abrogation of MCAK and Kif18A,  respectively, suggest that MCAK preferentially promotes depolymerization of MTs  at the leading sister, whereas Kif18A preferentially promotes depolymerization at  the lagging sister, generating resistance to the sister pair movement, leading to  processive thinning of the metaphase plate. (as cells progress towards anaphase,  their metaphase plates get thinner, due to a progressive decrease in oscillation  speed). 

Consistent with this conclusion are previous localization studies in fixed spindles  showing unequal distributions of Kif18A localizationand MCAK phosphorylation  between sister kinetochore pairs. Both proteins could affect oscillation speed by  controlling the number of MTs in a k‐fiber that undergo a catastrophe event and/or  the rate of MT depolymerization. 

3.1.8.2 How do the biochemical properties of the kinesin‐8 motor enable them to  regulate mitotic chromosome alignment? 

Consistent with the biochemical properties of Kip3p, Gupta et al. demonstrated that  in vivo, loss of Kip3p reduces the catastrophe frequency. However, loss of Kip3 also 

reduces the rescue frequency of cytoplasmatic and kinetochore microtubules. Thus,  Kip3p can promote both catastrophes and, unexpectedly, rescues of microtubules in  cells.  Moreover, Kip3p  slows the  disassembly  rate of  live  microtubules  in  S. 

cerevesiae.  

Similarly, in mammalian cells, loss of the kinesin‐8 motor Kif18A unexpectedly  increases both the speed of chromosome movement and reduces the frequency with   which chromosomes switch directions (an activity that simultaneously requires  rescue  and  catastrophe  of  kinetochore  fiber  microtubules  attached  to  sister‐

kinetochores)²⁴. To conclude, kinesin‐8 from yeast and human suppress microtubule  dynamics and reduce the shortening velocity in vivo. 

These  acitivities  contrast  with  the  kinetochore‐coupled  depolymerase,  MCAK  (kinesin‐13), which promotes catastrophes and, not unexpectedly, reduces rescues  in pure solutions of dynamic microtubules¹¹⁷.  As mentioned above, expectedly,  MCAK  increases  the  speed  of  chromosome  movement.  Thus,  it  appears  that  kinesin‐8 and kinesin‐13 can both promote catastrophes and in addition to that  activity, kinesin‐8 are able to promote rescues. If kinesin‐8s can promote both  catastrophes  and  rescues  then  this  would  be  consistent  with  the  observed  suppression of chromosome movement shown by Stumpff et al.  

Thus, it appears that kinesin‐8s in vivo possess besides to their well established plus  end  specific  depolymerase  activity,  rescue  promoting  activity  and  thereby  distinguish them from kinesin‐13. Based on these observations some interesting  questions arise. 

How could we explain the antagonistic behaviour on oscillation speeds of MCAK  and Kif18A in vivo, considering that both proteins are microtubule depolymerases  in vitro?  

In conclusion, our studies and recent work from other labs have established that  Kif18A is a keyplayer in chromosome alignment by precisely regulating kMTs plus  end dynamics.  

3.1.8.3 How do kinesin‐8s provide the dynamic linkage at the plus ends of kMTs for  force generation to control chromosome alignment? 

Our studies and recent work from other labs have established that Kif18A is a  keyplayer  in  chromosome  alignment  by  precisely  regulating  kinetochore  microtubule plus end dynamics. However, do kinesin‐8s provide the dynamic  linkage at the plus ends of kMTs for force generation coupled to microtubule  depolymerization and polymerization to control their alignment or do they just  regulate the dynamics of kMTs while other proteins act to link and to stabilize these  connections? 

Attempts to answer this question may arise from studies of kinesin‐8, Klp5/6 from  fission yeast demonstrating that they are plus‐end directed motors that can couple  microtubule depolymerization to cargo movement by harnessing the energy of  tubulin  depolymerization¹¹⁸.  In  this  study  Klp5/6  were  capable  of  tubulin‐

depolymerisation dependent, ATP independent motion in the minus direction¹¹⁸. In  line with this study is a report demonstrating that Klp5/6 and the Dam1 complex  fulfil  essential  overlapping  functions  in  coordinating  controlled  bipolar  chromosome attachment¹¹⁹.  

Given the overlapping function of kinesin‐8 and Dam1 in fission yeast, it is tempting  to speculate that Kif18A exerts its function by a similar mechanism as the Dam1  complex in human cells. (human cells lack the Dam1 complex)  

3.1.8.3.1 Do kinesin‐8s in humans functionally counterpart the Dam1 complex in yeast?  

In general, the Dam1 complex (complex consists of 10 subunits) assembles into  rings  to  form  dynamic  linkages  to  disassembling  kinetochore  microtubules.¹²⁰  Moreover, it is assumed that the Dam1 ring formation allows processive movement  on  depolymerising  microtubule  ends,  this  processive  movement  could  help  chromosomes to stay attached to disassembling kinetochore microtubules¹²¹. In  addition,  the  ring  is  needed  as  a  force‐coupling  device  that  translates  the  mechanical energy of the powerstroke (outward peeling of protofilaments) into a  sustained  movement  along  the  lattice^121‐122.  In  conclusion,  the  Dam1  complex  assembles into rings thereby providing dynamic linkages to maintain connections  with  dynamic  microtubule  polymers  and  couple  microtubule  disassembly  to  chromosome movement. 

Further support for the above mentioned idea that Kif18A may resembles the  function of the Dam1 complex comes from electron microscopy studies. Moores et  al. observed that Kif18A, similar to MCAK, can induce protofilament bending.  

This curled form (tubulin rings) of the microtubule protofilament is evident in the  electron microscope^{104;  110}. Moreover, this study demonstrated that the rings are  composed of two bands of protein density: an outer band of curved tubulin dimers  and an inner band of kinesin‐8‐MD. A subset of these rings was composed of 14  kinesin‐8‐MD–tubulin  dimer  complexes.  Thus,  kinesin‐8  and  the  Dam1  share  common functional and biochemical similarities. First, kinesin‐8 and the Dam1  show dual localization to the plus‐ends of kinetochore microtubules and spindle  microtubules^{24; 32; 123}. Second, the localization of the Dam1 and Kinesin‐8 (Kif18A) to  the plus tips of kMTs is microtubule dependent^{24; 32; 124}. Third, loss of function of the  Dam1  complex  results  in  a  checkpoint  dependent  arrest  and  causes  severe  chromosome congression and segregation defects24; 32; 123. Fourth, both the Dam1 and  kinesin‐8, Klp5/6, from fission yeast can move cargo along a microtubule in a  depolymerization‐coupled manner^118; 121.  

Finally, both form cooperative assemblies. Thus, the cooperative mechanism shown  to be the underlying mechanism for kinesin‐8 mediated microtubule disassembly in  vitro³⁵ could allow kinesin‐8 to assemble in rings¹⁰⁴ to either induce depolymerisation  (force  generation)  and  to  dynamically  stay  attached  to  the  disassembling  microtubules to move chromosomes (during congression and anaphase). From  these ideas new questions arise: Are kinesin‐8 from humans able to move cargo  coupled to microtubule depolymerisation in vitro? What are the linker molecules at  the kinetochore (CENP‐E and/or CENP‐F)? How do kinesin‐8s transmit the forces  generated by the dynamic microtubule plus end to the inner kinetochore to allow  centromere oscillations during metaphase and poleward chromosome movement  during anaphase? Does the ring formation induced by kinesin‐8 and the interaction  with  Cenp‐E,  a plus end microtubule elongation factor, explain  the observed  suppression of kinetochore microtubule dynamics mediated by kinesin‐8? 

3.1.9 Proposed model of Kif18A function at the plus tips of kinetochore