4 Ergebnisse
4.3 Regulation der Arginase in vitro
Im Gegensatz zu murinen Makrophagen und dendritischen Zellen, die in Ruhe keine Arginase exprimieren, zeigen die humanen Granulozyten bereits in Ruhe eine hohe Arginase-Aktivität.
Murine myeloische Zellen wiederum zeigen eine Arginase-Induktion nach TH2 Zytokin-Stimulation (CORRALIZA et al. 1995, MODOLELL et. al. 1995, MUNDER et al. 1998, MUNDER et al. 1999, LOUIS et al. 1999, CHANG et al. 2000, HESSE et al. 2001). Es sollte daher nun untersucht werden, ob sich die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch Zytokine, Chemokine, immunmodulierende Substanzen oder Zell-Zell-Interaktionen mit Thrombozyten beeinflussen lässt. Dazu wurden 5x106 Granulozyten mit und ohne die angegebenen Stimuli bzw. Thrombozyten für 2 bzw. 14-18 Stunden inkubiert.
Initial erfolgte die Austitrierung der Stimuli IL-8 (500-50-5ng/ml), Dexamethason (50-5-0,5µmol/l und Forskolin (500-50-5µmol/l) (Daten nicht gezeigt) in 2-4 unabhängigen Experimenten, wobei keine konzentrationsabhängige Zu- oder Abnahme der Arginaseaktivität feststellbar war. In allen weiteren Experimenten wurde dann eine auch in der Literatur (HAGGERTY et al. 1982, MUNDER et al. 1999, HAMMERMANN et al. 2000, KLASEN et al. 2001) angegebene optimale Konzentration der einzelnen Stmuli für andere in myeloischen Zellen induzierte Funktionen eingesetzt.
Nach Ablauf der Inkubationszeit erfolgt die Messung der Vitalität der Granulozyten mit Hilfe der Referenzzell-Methode (s.S. 48). Hierdurch wurde vorab sicher gestellt, dass die Ergebnisse nicht durch ein unterschiedliches Ausmaß an Apoptose der analysierten Granulozytenpopulationen verfälscht wurden. Danach wurde die Enzymaktivität der Arginase in den Granulozyten-Lysaten gemessen (s. 4.3.1-4.3.5). Die statistische Auswertung des Vergleichs zwischen unstimulierten und stimulierten Granulozyten erfolgte mittels gepaartem Student’s t-test mit einem Signifikanzniveau von 0,05.
Tab. 4 Vergleich der Vitalität der Granulozyten in Abhängigkeit von Zeit und Stimulationsbedingung.
STIMULATIONSBEDINGUNG ZAHL VITALER ZELLEN NACH
2 STUNDEN (%)
ZAHL VITALER ZELLEN NACH
14-18 STUNDEN (%)
O 100 100
IL-4 108 (p=0,42) 102 (p=0,40)
IL-10 107 (p=0,025) 103 (p=0,34)
IL-4 + IL-10 101 (p=0,76) 106 (p=0,11)
TNF-α 95 (p=0,30) 66 (p=0,13)
IFN-γ 100 (p=0,61) 95 (p=0,28)
TNF-α + IFN-γ 89 (p=0,36) 64 (p= 0,15)
IL-8 105 (p=0,79) 102 (p=0,54)
Forskolin 101 (p=0,57) 88 (p=0,06)
Dexamethason 96 (p=0,40) 91 (p=0,21)
Es wurden jeweils 5x106 Granulozyten mit den angegebenen Substanzen stimuliert und für 2 bzw. 14-18 Stunden inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Zahl vitaler Zellen mit Hilfe der Referenzzellmethode (s.S. 48) bestimmt. Die Zahl vitaler Zellen in den unstimulierten Ansätzen wurde als 100% gesetzt und die Zahl vitaler Zellen in den Stimulationsansätzen darauf bezogen.
Es zeigte sich, dass die Vitalität der unstimulierten Zellen nicht verschieden war von der Vitalität der Zellen nach Stimulation. Eine Ausnahme bildete hierbei die Stimulation mit TNF-α bzw. mit der Kombination aus TNF-α und IFN-γ, wo sich besonders nach 14-18-stündiger Inkubation eine deutliche Abnahme der Vitalität zeigte.
Im folgenden sind die Ergebnisse der Arginase-Enzymaktivitätsmessungen bei unterschied-licher Stimulation der Granulozyten dargestellt. Angegeben ist jeweils die Zahl n der unabhängig voneinander durchgeführten Experimente an Granulozyten jeweils verschiedener Blutspender sowie das Signifikanzniveau p beim Vergleich der Granulozyten ohne und mit Stimulation. Des weiteren wurde der Mittelwert und die Standardabweichung der Enzymaktivität innerhalb einer Stimulationsbedingung bei Experimenten verschiedener Spender aufgeführt. Eine zusammenfassende graphische Darstellung ist in Abb. 12 dargestellt.
4.3.1 Stimulation der Granulozyten mit den TH2-Zytokinen IL-4 und IL-10 Die typischen TH2-Zytokine IL-4 und IL-10 bewirken im murinen System eine Expression der Arginase in Makrophagen, dendritischen Zellen (CORRALIZA et al. 1995, MODOLELL et al. 1995, MUNDER et al. 1999) und Granulozyten (MUNDER et al. Manuskript eingereicht). Durch synergistische Kooperation zwischen den einzelnen TH2-Zytokinen kann die Expression noch erhöht werden (MUNDER et al. 1998, MUNDER et al. 1999).
IL-4
Bei Stimulation der Granulozyten mit IL-4 konnte weder bei 2h (n=7; p=0,7901; MW: 2288 ± 954), noch bei 14-18h (n=7; p=0,3921; MW: 1766 ± 534) eine signifikante Veränderung der Enzymexpression verzeichnet werden.
IL-10
Auch bei Inkubation der Granulozyten mit IL-10 konnte keine signifikante Veränderung der Enzymexpression verzeichnet werden (2h: n=6; p=0,3274; MW: 2196 ± 994 / 14-18h: n=6;
p=0,0757; MW: 1948 ± 799).
IL-4 und IL-10
Durch Kombination beider Interleukine konnte keine Stimulation oder Suppression der Arginase-Aktivität induziert werden (2h: n=6; p= 0,8991; MW: 2297 ± 1067 / 14-18h: n=6;
p=0,2784; MW: 1788 ±661).
Neben der Enzymaktivität wurde bei einzelnen Experimenten auch die Proteinexpression der Arginase I nach TH2-Zytokinstimulation der Granulozyten mittels Immunoblot analysiert (Abb. 11). Im Gegensatz zum murinen System konnten humane Granulozyten durch typische TH2-Zytokine nicht zur Expression der Arginase stimuliert werden.
A
B
0 500 1000 1500 2000
unstimuliert IL-4 IL-4+IL-10
Enzymaktivität mU/mg Protein
Abb. 11 Keine Induktion von Arginase I Protein (A) bzw. Arginase-Aktivität (B) in humanen Granulozyten durch TH2-Zytokin-Stimulation.
Es wurden 5x106 PMN für 14 Stunden mit IL-4 bzw. IL-4 und IL-10 (jeweils 10 ng/ml) stimuliert. Es zeigte sich weder eine vermehrte Arginase I-Proteinexpression im Immunoblot (A) noch eine erhöhte enzymatische Aktivität im Granulozytenlysat (B). Mit einem Immunoblot für MAP-Kinase (ERK1/2) erfolgte die Kontrolle der Proteinbeladung.
4.3.2 Stimulation der Granulozyten mit den TH1-Zytokinen TNF-α und IFN-γ Die typischen TH1-Zytokine TNF-α und IFN-γ führen im murinen System zu einer Suppression der Arginase I Expression sowie zu einer vermehrten Expression der induzierbaren NO-Synthase. Beide Zytokine sind potente Stimulatoren humaner Granulozytenfunktionen wie z.B. Adhärenz (SEOW et al. 1987), Phagozytose (ELLIS et al.
2004) und Degranulation (KLEBANOFF et al. 1986). Sie führen zur Stimulation der Expression von MHCII, Chemokin-Rezeptoren und der Sekretion verschiedener proinflammatorischer Zytokine (ELLIS et al. 2004) sowie der Produktion reaktiver Sauerstoffverbindungen (BERTON 1992).
TNF-α
TNF-α führte zu keiner signifikanten Beeinflussung der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten (2h: n=8; p=0,7328; MW: 2632± 1115 / 14-18h: n=9; p=0,2546; MW: 2000 ± 908).
IFN-γ
Auch IFN-γ führte zu keiner signifikante Veränderung der Arginase-Aktivität (2h: n=6, p=0,5366; MW: 2719±1048 / 14-18h: n=6; p=0,3438; MW: 2178 ± 534).
TNF-α und IFN-γ
Auch die Kombination beider Zytokine führte zu keiner signifikanten Veränderung der Enzymaktivität der Arginase (2h: n=7; p=0,9988; MW: 2566 ± 881 / 14-18h: n=7; p=0,1598;
MW: 2144 ± 437).
4.3.3 Stimulation der Granulozyten mit dem Chemokin IL-8
Bei Interleukin-8 handelt es sich um eines der wesentlichen Chemokine zur Attraktion von Granulozyten (BAGGIOLINI et al. 1989).
Die Stimulation der Granulozyten mit Interleukin 8 (2h: n=5; p=0,7069; MW: 2095 ± 333 / 14-18h: n=7; p=0,1630 MW: 1627 ± 706) führte zu keiner signifikanten Veränderung der Arginase-Expression.
4.3.4 Stimulation der Granulozyten mit Forskolin
Im murinen System wurde in verschiedenen Zelltypen eine Induktion der Arginase durch das cAMP / Proteinkinase A-System gezeigt (CORRALIZA et al. 1997, HAMMERMANN et al.
2000). Unter der Annahme vergleichbarer grundlegender Signaltransduktionsmechanismen in verschiedenen Spezies erfolgte daher die Stimulation mit Forskolin. Forskolin steigert über die direkte Stimulation der Adenylylcyclase die intrazelluläre Konzentration von cAMP.
Die Stimulation der Granulozyten mit Forskolin zeigte keine signifikante Veränderung der Enzymaktivität der Arginase verglichen mit den unstimulierten Granulozyten (2h: n=7, p=0,4648; MW: 2651 ± 1073 / 14-18h: n=7; p=0,7529; MW: 1992 ± 748).
4.3.5 Stimulation der Granulozyten mit Dexamethason
In verschiedenen Spezies und Zelltypen wurde eine Beeinflussung der Arginase-Expression durch Steroide gezeigt. In Hepatozyten der Ratte lässt sich durch die Stimulation mit Dexamethason die Expression der Arginase über eine Bindung des Transkriptionsfaktors C/EBPbeta an einen Enhancer erhöhen (HAGGERTY et al. 1982, GOTOH et al. 1997), während sie in Alveolarmakrophagen erniedrigt wird (KLASEN et al. 2001).
Bei Stimulation der humanen Granulozyten mit Dexamethason zeigte sich keine signifikante Veränderung der Enzymaktivität der Arginase. (2h: n=5; p=0,7069; MW: 2102 ± 330 / 14-18h: n=7; p=0,2734; MW: 1612 ± 644).
4.3.6 Zusammenfassung der in vitro Experimente A
0 1000 2000 3000 4000
unstimuliert IL4 IL10 IL4+IL10 TNF-α IFN-γ TNF-α +IFN-γ IL 8 Dexamethason Forskolin
Enzymaktivität mU/mg Protein
B
0 1000 2000 3000 4000
unstimuliert IL4 IL10 IL4+IL10 TNF-α IFN-γ TNF-α + IFN-γ IL 8 Dexamethason Forskolin
Enzymaktivität mU/mg Protein
Abb. 12 Arginase-Aktivität humaner Granulozyten nach Inkubation mit verschiedenen Zytokinen, Dexamethason und Forskolin. Inkubationszeit: 2 (A) bzw. 14-18 Stunden (B)
Jeweils 5x106 humane Granulozyten wurden mit verschiedenen Zytokinen und Zytokin-Kombinationen, Forskolin und Dexamethason (mit einer finalen Konzentration wie in S. 35 angegeben) für 2 Stunden (A) bzw. 14-18 Stunden (B) stimuliert. In den Zell-Lysaten wurde anschließend die Arginase-Enzymaktivität bestimmt. Keine der Stimulationsbedingungen führte zu einer signifikanten Veränderung (p<0,05) der Arginase-Aktivität der Granulozyten. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von n=5 (2h: 8, Dexamethason), n=6 (2h: 10, IL-4+IL-10, IFN-γ / 18h: IL-10, IL-IL-4+IL-10, IFN-γ), n=7 (2h: IL-4, TNF-α+IFN-γ, Forskolin / 14-18h: IL-4, TNF-α+IFN-γ, IL-8, Forskolin, Dexamethason), n=8 (2h: TNF-α), n=9 (14-14-18h: TNF-α).
4.3.7 Interaktion der Granulozyten mit Thrombozyten
In vitro wurde gezeigt, dass Thrombozyten fähig sind, verschiedene Fähigkeiten der neutrophilen Granulozyten zu modulieren wie beispielsweise Chemotaxis (DEUEL et al.
1982), Aggregation (RHEE et al. 1986), Phagozytose (WILSON et al. 1987), die Produktion von Superoxidanionen (MOON et. al 1990), die Freisetzung lysosomaler Enzyme mittels Degranulation (DEL MASCHIO et al. 1989) sowie die Synthese von Arachidonsäure-Metaboliten (z.B. Leukotriene) (MACLOUF et al. 1990). Die Interaktion findet zwischen Adhäsionsmolekülen der Thrombozyten wie P-Selectin und GPIIb/IIIa und den korrespondierenden Rezeptoren der Granulozyten statt (PALABRICA et al. 1992, SPANGENBERG et al. 1993).
In Vorversuchen erfolgte eine Messung der Enzymaktivität der Arginase in Thrombozyten, wobei in drei Experimenten mit Thrombozyten gesunder Normalspender jeweils keine Arginase-Aktivität messbar war. Es wurde die mögliche Beeinflussung der Arginase-Aktivität in Granulozyten durch Thrombozyten allein oder in Gegenwart von Zytokinen, Chemokinen und immunmodulierenden Substanzen in Kokultivierungsassays (Verhältnis 50:1 bzw. 10:1 / Thrombozyten:Granulozyten) überprüft. Wiederum zeigte sich keine signifikante Beeinflussung der Arginase-Aktivität der humanen Granulozyten. Abb. 13 zeigt einen Vergleich bezüglich Enzymaktivität zwischen unstimulierten und stimulierten Granulozyten (in Kokultivierung mit 50:1 bzw. 10:1 Thrombozyten: Granulozyten). Die Arginaseaktivität der unstimulierten Granulozyten wurde jeweils als 100% gesetzt.
A Enzymaktivität: Vergleich mit unstimulierter Kokultivierung son
1:50 Gran:Thromb Enzymaktivität: Vergleich mit unstimulierter Kokultivierung
1:50 Gran:Thromb 1:10 Gran:Thromb
Abb. 13 Beeinflussung der Arginase-Aktivität in Granulozyten durch Thrombozyten in Gegenwart von Zytokinen, Chemokinen und immunmodulierende Substanzen in Kokultivierungsassays; Inkubationszeit: 2 Stunden (A) bzw. 14-18 Stunden (B)
Jeweils 5x106 humane Granulozyten wurden in Gegenwart von Thrombozyten (Verhältnis 50:1 bzw.
10:1 / Thrombozyten:Granulozyten) mit verschiedenen Zytokinen und Zytokin-Kombinationen, Forskolin und Dexamethason für 2 Stunden (A) bzw. 14-18 Stunden (B) stimuliert. In den Zell-Lysaten wurde anschließend die Arginase-Enzymaktivität bestimmt. Dargestellt ist der Vergleich bezüglich Enzymaktivität zwischen unstimulierten und stimulierten Granulozyten. Die Arginaseaktivität der unstimulierten Granulozyten (in Kokultivierung mit 50:1 bzw. 10:1 Thrombozyten: Granulozyten) wurde jeweils als 100% gesetzt. Dargestellt ist die Zusammenfassung von zwei unabhängigen Experimenten mit Mittelwert und Schwankung.
Zusammenfassend zeigte sich in den Zellkulturuntersuchungen keine signifikante Modulation der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch verschiedene pro- und antiinflammatorische Mediatoren des Immunsystems. Auch die zusätzliche Interaktion der Granulozyten mit Thrombozyten führte unter den unterschiedlichen Stimulationsbedingungen nicht zu einer Beeinflussung der Arginase in den humanen PMN.