0 1000 2000 3000 4000
unstimuliert IL4 IL10 IL4+IL10 TNF-α IFN-γ TNF-α +IFN-γ IL 8 Dexamethason Forskolin
Enzymaktivität mU/mg Protein
B
0 1000 2000 3000 4000
unstimuliert IL4 IL10 IL4+IL10 TNF-α IFN-γ TNF-α + IFN-γ IL 8 Dexamethason Forskolin
Enzymaktivität mU/mg Protein
Abb. 12 Arginase-Aktivität humaner Granulozyten nach Inkubation mit verschiedenen Zytokinen, Dexamethason und Forskolin. Inkubationszeit: 2 (A) bzw. 14-18 Stunden (B)
Jeweils 5x106 humane Granulozyten wurden mit verschiedenen Zytokinen und Zytokin-Kombinationen, Forskolin und Dexamethason (mit einer finalen Konzentration wie in S. 35 angegeben) für 2 Stunden (A) bzw. 14-18 Stunden (B) stimuliert. In den Zell-Lysaten wurde anschließend die Arginase-Enzymaktivität bestimmt. Keine der Stimulationsbedingungen führte zu einer signifikanten Veränderung (p<0,05) der Arginase-Aktivität der Granulozyten. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von n=5 (2h: 8, Dexamethason), n=6 (2h: 10, IL-4+IL-10, IFN-γ / 18h: IL-10, IL-IL-4+IL-10, IFN-γ), n=7 (2h: IL-4, TNF-α+IFN-γ, Forskolin / 14-18h: IL-4, TNF-α+IFN-γ, IL-8, Forskolin, Dexamethason), n=8 (2h: TNF-α), n=9 (14-14-18h: TNF-α).
4.3.7 Interaktion der Granulozyten mit Thrombozyten
In vitro wurde gezeigt, dass Thrombozyten fähig sind, verschiedene Fähigkeiten der neutrophilen Granulozyten zu modulieren wie beispielsweise Chemotaxis (DEUEL et al.
1982), Aggregation (RHEE et al. 1986), Phagozytose (WILSON et al. 1987), die Produktion von Superoxidanionen (MOON et. al 1990), die Freisetzung lysosomaler Enzyme mittels Degranulation (DEL MASCHIO et al. 1989) sowie die Synthese von Arachidonsäure-Metaboliten (z.B. Leukotriene) (MACLOUF et al. 1990). Die Interaktion findet zwischen Adhäsionsmolekülen der Thrombozyten wie P-Selectin und GPIIb/IIIa und den korrespondierenden Rezeptoren der Granulozyten statt (PALABRICA et al. 1992, SPANGENBERG et al. 1993).
In Vorversuchen erfolgte eine Messung der Enzymaktivität der Arginase in Thrombozyten, wobei in drei Experimenten mit Thrombozyten gesunder Normalspender jeweils keine Arginase-Aktivität messbar war. Es wurde die mögliche Beeinflussung der Arginase-Aktivität in Granulozyten durch Thrombozyten allein oder in Gegenwart von Zytokinen, Chemokinen und immunmodulierenden Substanzen in Kokultivierungsassays (Verhältnis 50:1 bzw. 10:1 / Thrombozyten:Granulozyten) überprüft. Wiederum zeigte sich keine signifikante Beeinflussung der Arginase-Aktivität der humanen Granulozyten. Abb. 13 zeigt einen Vergleich bezüglich Enzymaktivität zwischen unstimulierten und stimulierten Granulozyten (in Kokultivierung mit 50:1 bzw. 10:1 Thrombozyten: Granulozyten). Die Arginaseaktivität der unstimulierten Granulozyten wurde jeweils als 100% gesetzt.
A Enzymaktivität: Vergleich mit unstimulierter Kokultivierung son
1:50 Gran:Thromb Enzymaktivität: Vergleich mit unstimulierter Kokultivierung
1:50 Gran:Thromb 1:10 Gran:Thromb
Abb. 13 Beeinflussung der Arginase-Aktivität in Granulozyten durch Thrombozyten in Gegenwart von Zytokinen, Chemokinen und immunmodulierende Substanzen in Kokultivierungsassays; Inkubationszeit: 2 Stunden (A) bzw. 14-18 Stunden (B)
Jeweils 5x106 humane Granulozyten wurden in Gegenwart von Thrombozyten (Verhältnis 50:1 bzw.
10:1 / Thrombozyten:Granulozyten) mit verschiedenen Zytokinen und Zytokin-Kombinationen, Forskolin und Dexamethason für 2 Stunden (A) bzw. 14-18 Stunden (B) stimuliert. In den Zell-Lysaten wurde anschließend die Arginase-Enzymaktivität bestimmt. Dargestellt ist der Vergleich bezüglich Enzymaktivität zwischen unstimulierten und stimulierten Granulozyten. Die Arginaseaktivität der unstimulierten Granulozyten (in Kokultivierung mit 50:1 bzw. 10:1 Thrombozyten: Granulozyten) wurde jeweils als 100% gesetzt. Dargestellt ist die Zusammenfassung von zwei unabhängigen Experimenten mit Mittelwert und Schwankung.
Zusammenfassend zeigte sich in den Zellkulturuntersuchungen keine signifikante Modulation der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch verschiedene pro- und antiinflammatorische Mediatoren des Immunsystems. Auch die zusätzliche Interaktion der Granulozyten mit Thrombozyten führte unter den unterschiedlichen Stimulationsbedingungen nicht zu einer Beeinflussung der Arginase in den humanen PMN.
4.4 Regulation der Arginase in vivo
Nachdem sich in den in Abschnitten 4.1-4.3 dargestellten Zellkulturuntersuchungen keine signifikante Modulation der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten in vitro gezeigt hatte, sollte die Frage der Regulation in vivo untersucht werden. Hierzu schien das Patientenkollektiv der allogen blutstammzelltransplantierten Patienten aus verschiedenen Gründen besonders geeignet. Zum einen entwickeln die Patienten nach Transplantation in relativ hoher Frequenz inflammatorische Probleme, bei denen sowohl infektiöse (v.a. Sepsis, Pneumonie, Weichteilinfekte) wie nicht-infektiöse (GvHD) pathogenetische Effektormechanismen zugrunde liegen. Zum zweiten erhalten diese Patienten verschiedene immunmodulierende Substanzen mit konsekutiver Beeinflussung auch der Granulozyten-Aktivierung (z.B. Steroide). Zum dritten handelt es sich bei den Patienten nach allogener Stammzelltransplantation um ein Kollektiv, welches einer engmaschigen klinischen und laborchemischen Kontrolle unterliegt, eine Grundvoraussetzung für intraindividuelle Untersuchungen im Langzeitverlauf. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden 51 Patienten untersucht, die aufgrund einer hämatologischen Erkrankung in der Medizinischen Klinik und Poliklinik V der Universität Heidelberg allogen blutstammzelltransplantiert wurden. Im Abstand von ca. 14 Tagen wurden Blutproben asserviert und die Granulozyten zur späteren Bestimmung von Arginase-Aktivität, mRNA und Proteinexpression isoliert. Bei 55% der Patienten konnten auch Granulozyten vor Transplantation gewonnen werden. Bei den anderen Patienten begann der Beobachtungszeitraum 14 bis 261 Tage nach Transplantation. Der Beobachtungszeitraum erstreckte sich bis ca. ein Jahr nach Transplantation, wobei 22% der Patienten während dieser Zeitspanne verstarben.
4.4.1 Enzymaktivität bei Kontrollpersonen
Zur Einschätzung der Schwankungsbreite der Arginase-Enzymaktivität bei gesunden Kontrollpersonen wurde 7 klinisch gesunden Blutspendern im Alter zwischen 25 und 50 Jahren im Abstand von ca. 4 Wochen 2 bis 6 mal Vollblut entnommen und daraus die Granulozyten isoliert.
Die Enzymaktivität innerhalb dieses Kontrollkollektivs schwankte zwischen 1037 und 1886 mU Enzymaktivität pro mg Protein (Mittelwert: 1578 mU/mg Protein, SD: 251). Der Verlauf der Granulozyten-Arginase-Aktivität der Einzelspender ist in Abb. 14 A dargestellt, die Mittelwerte samt Standardabweichungen der einzelnen Spender ist Abb. 14 B zu entnehmen.
Die Standardabweichung der Arginase-Aktivität der Einzelspender schwankte zwischen 9 und 215, entsprechend einer prozentualen Schwankung zwischen 0,5 und 13,2, im Mittel 8.
A Enzymaktivität mU/mg Protein
B Enzymaktivität mU/mg Protein
Abb. 14 Arginase-Enzymaktivität von Kontrollpersonen im Verlauf
Bei 7 klinisch gesunden Personen wurde im Abstand von ca. 4 Wochen zwei bis sechs Mal Blut genommen und die Arginaseaktivität der Granulozyten untersucht. A: Verlauf der Kontrollpersonen B: Mittelwerte und Standardabweichungen der Arginase-Aktivität der Granulozyten von Kontrollpersonen, von welchen über einen individuell unterschiedlichen Gesamtzeitraum von 28 bis 273 Tagen Blutproben gewonnen wurden
4.4.2 Enzymaktivität bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation Bei den 51 Patienten handelte es sich um 35% weibliche und 65% männliche Personen im Alter zwischen 21 und 65 Jahren (Durchschnittsalter 48 Jahre). Da diese Patienten nach ihrer Stammzelltransplantation immer wieder Phasen generalisierter Inflammation wie Sepsis oder Graft-versus-host-Reaktion durchlaufen, sollte die mögliche Funktion des Arginase-Stoffwechselweges im Rahmen von inflammatorischen bzw. antiinflammatorischen Zuständen des Immunsystems untersucht werden.
Einfluss von Graft-versus-host-Erkrankungen auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten
Während sich im murinen System die pathogenetische Relevanz von TH1 und TH2 Zytokinen in der Induktion bzw. Suppression von GvHD zweifelsfrei gezeigt hat (ALLEN et al. 1993, RUS et al. 1995, FERRARA et al. 1996), scheint die Situation im Rahmen der humanen GVHD komplexer zu sein. Gleichwohl spielen auch hier Zytokin-vermittelte Entzündungsvorgänge eine wesentliche Rolle.
Die humane GvHD in ihrer unterschiedlichen Ausprägung (lokalisiert / generalisiert), Lokalisation (v.a. Leber, Haut, Darm) und sicher auch Pathogenese (akut / chronisch) ist für ein Studium der Regulation myeloischer Zellfunktionen im Kontext von Inflammation und Antiinflammation daher sehr gut geeignet.
Im Rahmen des untersuchten Studienkollektivs entwickelten 76% (n=39/51) der Patienten eine oder mehrere Episoden einer Graft-versus-host-Erkrankung, wobei 19% der Patienten nur an einer akuten GvHD und 39% nur an einer chronischen GvHD erkrankten. 18% der Patienten entwickelten im Verlauf sowohl eine akute als auch eine chronische GvHD-Erkrankung. Es handelte sich hierbei um Abstoßungsreaktionen (n=73) der Haut (41%), der Mundschleimhaut (23%), des Darms (19%), der Leber (14%) und sonstige GvHD (3%). 24%
(n=12/51) der Patienten erkrankten an keiner Graft-versus-host-Erkrankung. Innerhalb der GvHD-Episoden ist zwischen solchen mit und ohne spezifische Therapie (Kortison) zu unterscheiden. Diese Unterscheidung ist in diesem Kontext von großer Bedeutung, da einer potentiellen Beeinflussung der Arginase-Aktivität der Granulozyten sowohl die Inflammation der GvHD wie auch die spezifische Therapie zugrunde liegen könnte. Betrachtet man zunächst alle GvHD-Phasen ohne spezifische immunsuppressive Therapie (n=12/73; 16%), so zeigt es sich, dass weder im Rahmen von akuten GvHD Episoden (n=2/12; 17%) noch im Rahmen von chronischen GvHD-Episoden (n=10/12; 83%) eine deutliche Modulation der Arginase-Aktivität zu verzeichnen war. Bei den unbehandelten GvHD-Episoden handelt es sich ausschließlich um Abstoßungsreaktionen der Haut (n=6) und Mundschleimhaut (n=6) mit histologischem Grad I. Zwei repräsentative Verläufe sind in Abb. 15 dargestellt.
A
0 1000 2000 3000
-40 10 60 110 160 Tage nach Transplantation Enzymaktivität mU/mg Protein
Enzymaktivität Argniase
B
0 1000 2000 3000
+100 +200 +300 +400
Tage nach Transplantation Enzymaktivität mU/mg Protein
Enzymaktivität Arginase
Abb. 15 Patient WD 58 mit akuter GvHD
Keine Modulation der Arginase-Aktivität durch GvHD
Patient WD 58 erkrankte an einer akuten GvHD ( ) der Haut (histologischer Grad: I). Es war kein Anstieg der Enzymaktivität bedingt durch GvHD zu beobachten. Die GvHD-Episode wurden nicht systemisch behandelt.
Patient GH 58 mit chronischer GvHD
Keine Modulation der Arginase-Aktivität durch GvHD
Patient GH 56 erkrankte zweimal an chronischer, histologisch gesicherter GvHD ( ) der Haut bzw.
der Haut und Mundschleimhaut. Es war kein Anstieg der Enzymaktivität bedingt durch GvHD zu beobachten. Die GvHD-Episoden wurden nicht systemisch behandelt.
Betrachtet man nun bei diesen Patienten den Mittelwert der Enzymaktivität der Proben vor bzw. nach der GvHD (Ausgangswert: 100%; Werte unter Steroidmedikation nicht berücksichtigt) mit dem Mittelwert der Proben unter GvHD, so kam es im Mittel zu keinem Anstieg (Arginaseaktivität in den Proben vor bzw. nach GvHD = 100%, unter GvHD = 106%
des Ausgangswerts, Minimum: 81% Maximum: 123%, p = 0,2098).
50%
100%
150%
A B
Enzymaktivität mU/mg Protein: Vergleich mit Proben ohne GvHD
Abb. 16 Keine Beeinflussung der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch GvHD-Inflammation
Vergleich Mittelwert der Enzymaktivität der Proben vor bzw. nach GvHD (Ausgangswert: 100%;
Werte unter Steroidmedikation nicht berücksichtigt) (A) mit dem Mittelwert der Proben unter unbehandelter GvHD (B)
Zusammenfassend wurde also keine Modulation der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten im Rahmen einer unbehandelten GvHD beobachtet. Die Analyse der mit Steroiden systemisch behandelten GvHD-Episoden erfolgt auf Seite 81.
Einfluss von infektiös-inflammatorischen Episoden auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten
57% (n=29/51) der Patienten entwickelten während des Beobachtungszeitraums eine oder mehrere infektiöse inflammatorische Episoden. Neben klinischen Kriterien (z.B. Fieber) und mikrobiologischen Untersuchungsergebnissen (Blutkulturen, Abstrichergebnisse) wurde laborchemisch als Entzündungsmarker das C-reaktive Protein (CRP) gemessen (Normbereich 0-5 mg/l).
Tab. 5 zeigt die Verteilung und den dabei durchschnittlich aufgetretenen CRP-Wert bei Patienten mit infektiösen-inflammatorischen Episoden. 26% der infektiös-inflammatorischen Geschehnisse traten während einer bereits bestehenden GvHD auf.
Tab. 5 Verteilung der infektiös-inflammatorischen Geschehnisse bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation
ART DER INFEKTIÖS-INFLAMMATORISCHEN EPISODEN DURCHSCHNITTLICHER CRP-WERT1
Pneumonie (23%) 114,8
fieberhafter Infekt (42%) 70,9
respiratorischer Infekt (12%) 33,1
Sonstige infektiös-inflammatorische Episoden (23%) 42,2
Bei 57% (n=29/51) der Patienten traten während des Beobachtungszeitraums eine oder mehrere infektiös-inflammatorische Episoden (n=43) auf.
1) Der Normbereich des CRP liegt <5mg/l
Korreliert man nun bei allen Patienten (n=29/51), die eine oder mehrere infektiöse inflammatorische Episoden entwickelten, den CRP-Wert mit der Enzymaktivität, so konnte nur bei 5% (n=1) eine Korrelation festgestellt werden. Eine repräsentative Analyse ist in Abb.
17 dargestellt.
0 1000 2000 3000
0 20 40 60 80 100
CRP in mg/l Enzymaktivität mU/mg Protein
Abb. 17 Einfluss des CRP-Wert auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten bei Patient SH47
Patient SH47 entwickelte während des Beobachtungszeitraums mehrere infektiöse inflammatorische Episoden mit Anstieg des CRP-Wert bis 33,8 mg/l. Es konnte keine Korrelation festgestellt werden.
Auch im Rahmen der 43 infektiös-inflammatorischen Episoden konnte jeweils keine signifikante Veränderung der Enzymaktivität der Granulozyten-Arginase zu Beginn oder im Verlauf der Episoden verzeichnet werden. Im folgenden sind drei repräsentative Verläufe dargestellt.
0 1000 2000 3000
60 80 100 120
Tage nach Transplantation
Enzymaktivität mU/mg Protein
0 100 200
CRP-Wert mg/l
Enzymaktivität Arginase CRP-Wert
Abb. 18 Humane Granulozyten-Arginase: Keine Beeinflussung durch infektiöse Inflammation:
Patient BJ50 mit respiratorischem Infekt
Patient BJ 50 erkrankte an einem respiratorischen Infekt ( ), der CRP-Wert stieg auf 54,1 mg/l (Pfeil). Die Enzymaktivität der Granulozyten-Arginase blieb nahezu unverändert.
0 1000 2000
-30 20 70 120
Tage nach Transplantation
Enzymaktivität mU/mg Protein
0 100 200
CRP-Wert mg/l
Enzymaktivität Arginase CRP-Wert
Abb. 19 Granulozyten-Arginase: Keine Beeinflussung durch Sepsis: Patient PA 83
Bei Patient PA 83 kam es im Verlauf zu Fieberschüben bedingt durch Sepsis mit Nachweis von Staphylococcus haemolyticus ( ). Der CRP-Wert stieg auf max. 85,5 mg/l an (Pfeil). Die Enzymaktivität blieb unverändert.
0 1000 2000
+25 +65 +105 +145 +185
Tage nach Transplantation
Enzymaktivität mU/mg Protein
0 50 100 150
CRP-Wert mg/l
Enzymaktivität CRP-Wert
Abb. 20 Humane Granulozyten-Arginase: Keine Beeinflussung durch infektiöse Inflammation:
Patient KC 41mit Pneumonie
Bei Patient KC 41 kam es im Verlauf zu einer schweren Pneumonie. Der CRP-Wert stieg auf max.
58,1 mg/l. an (Pfeil). Die Enzymaktivität blieb unverändert.
Einfluss von in vivo Glukokortikoiden auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten
Wie auf Seite 76 dargelegt, wurden 12 von 73 GvHD Episoden nicht spezifisch therapiert. Für alle übrigen GvHD Episoden bestand die Primärtherapie aus der unterschiedlich hoch dosierten Gabe von Steroiden, zumeist Prednison. Zwar hatte sich in den Zellkulturuntersuchungen in vitro kein Einfluss von Glukokortikoiden auf die Arginase-Aktivität isolierter humaner Granulozyten gezeigt, doch schien eine erneute Analyse der Steroid-Wirkung in vivo interessant. So war zum einen in verschiedenen Spezies und Gewebetypen ein Einfluss von Steroiden auf die Expression von Arginase dokumentiert (HAGGERTY et al. 1982, GOTOH et al. 1997, KLASEN et al. 2001), zum anderen kann natürlich eine Zellkulturuntersuchung niemals die Komplexität der in vivo Situation abbilden.
67% (n=34/51) der Patienten erhielten aufgrund einer klinisch vermuteten oder histologisch nachgewiesenen Abstoßungsreaktion das Glukokortikoid Prednison. Die Therapiedauer der Behandlungszyklen schwankte im Patientenkollektiv zwischen drei Wochen und mehreren
Monaten. Die Anfangsdosierung lag bei 20 bis 1000 mg pro Tag, das Absetzen des Präparats erfolgte durch langsame Dosisreduktion.
84% (n=61/73) aller Abstoßungsreaktionen wurden mit Prednison behandelt. 15% (n=11/73) der GvHD-Episoden lagen bereits zu Beginn des Beobachtungszeitraums vor und wurden dementsprechend schon bei Studieneinschluss des Patienten mit Steroiden behandelt. Weitere 12% (n=9/73) der GvHD-Episoden entwickelten sich während der Steroidbehandlung einer sich an einem anderen Organ manifestierenden GvHD. Die Mehrzahl der GvHD-Episoden innerhalb des Patientenkollektivs (56%, n= 41/73) entwickelte sich de novo während des Beobachtungszeitraums und wurde neu mit Steroiden behandelt. Die Latenzzeit zwischen Diagnosestellung der GvHD und dem Beginn einer Steroidtherapie war wesentlich abhängig vom klinischen Schweregrad der GvHD und von der Art (akut / chronisch) und schwankte erheblich zwischen 0 und 270 Tagen. Im Mittel wurde 33 Tage nach Diagnosestellung mit der Behandlung begonnen. Bei 54% (n=22/41) dieser Episoden konnte mindestens eine Granulozyten-Probe zwischen histologischer oder klinischer Diagnosestellung und Beginn der Prednisontherapie gewonnen werden. Bei diesen Patienten konnte folglich definitiv zwischen dem Einfluss der GvHD und dem der Steroidmedikation auf die Arginase-Aktivität der humanen Granulozyten unterschieden werden.
Betrachtet man nun bei diesen Patienten die Enzymaktivität der Probe vor Diagnosestellung der GvHD (Ausgangswert: 100%) mit dem Mittelwert der Proben unter GvHD, aber vor Prednisongabe, so kam es im Mittel zu keinem Anstieg (Arginaseaktivität in der Probe vor Diagnosestellung = 100%, nach Diagnosestellung und vor Steroidbehandlung = 97% des Ausgangswerts; Minimum: 56%, Maximum: 128%; p = 0,3450). Vergleicht man hingegen die Enzymaktivität vor Diagnosestellung der GvHD mit der Probe unter Prednisontherapie, so kam es im Mittel zu einem signifikanten Anstieg (139% des Ausgangswert; Minimum: 93%, Maximum: 216%; p = 0,0058) (s. Abb. 21).
0%
50%
100%
150%
200%
A B C
Enzymaktivität mU/mg Protein: Vergleich mit Probe vor GvHD
Abb. 21 Beeinflussung der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch Steroide, nicht aber durch GvHD-Inflammation.
Vergleich der Arginaseaktivität der Probe vor Diagnosestellung der GvHD (A, Ausgangswert: 100%) mit dem Mittelwert der Proben unter GvHD, aber vor Prednisongabe (B, 97%) und der Probe unter Prednisontherapie (C, 139%) bei Patienten, bei denen zwischen Beginn der GvHD-Inflammation und Beginn der Steroidtherapie unterschieden werden konnte (n=22).
In Abb. 22, Abb. 23 und Abb. 24 sind beispielhafte Verläufe dreier Patienten nach allogener Stammzelltransplantation dargestellt.
0 500 1000 1500 2000 2500
75 125 175 225 275 325 375
Tage nach Transplantation
Enzymaktivität mU/mg Protein
0 70 140
Prednison in mg
Enzymaktivität Arginase Prednison
Abb. 22 Humane Granulozyten-Arginase: Einfluss der applizierten Steroiddosis auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten: Patient LS 64
Patient LS 64 erkrankte an einer akuten GvHD des Darms ( ), histologisch Grad II und klinisch Grad III bzw. an einer chronischen GvHD der Mundschleimhaut und der Haut ( ), histologisch Grad II.
Bei der ersten Granulozytenprobe (Tag+120) während der akuten GvHD des Darmes zeigte sich ein Anstieg der Enzymaktivität, wobei aber bereits ab Tag+109 mit einer Steroidtherapie begonnen worden war (hier konnte nicht zwischen Beginn der GvHD und Beginn der Kortisontherapie unterschieden werden). Bei der GvHD der Mundschleimhaut und Haut konnte zwischen dem Beginn der GvHD und dem Beginn der Cortisontherapie unterschieden werden. Hier zeigte es sich, dass erst nach der Gabe von Prednison (ab Tag+293) die Enzymaktivität in den Granulozyten anstieg.
0 1000 2000 3000
20 70 120 170 220 270 320
Tage nach Transplantation
Enzymaktivität mU/mg Protein
0 100 200
Prednison in mg
Enzymaktivität Arginase Prednison
Abb. 23 Arginase-Induktion durch Steroidmedikation: Patient GM 74
Der Patient GM 74 erkrankte an einer GvHD der Haut, klinisch Grad II ( ). Die Enzymaktivität blieb dabei nahezu unverändert (vor GvHD: 1807, unter GvHD 1590 –1890). Durch Einnahme von Prednison (Pfeile, ) (beginnend mit Tagesdosen von 80 mg an Tag +66 bzw. 40mg an Tag +105, das bei V.a. immunologisch vermittelte Fieberschübe unklarer Genese verordnet wurde, zeigte sich eine signifikante Erhöhung der Enzymaktivität (Messwerte an Tag +71: Enzymaktivität: 2365 mU/mg Protein bzw. Tag +113 Enzymaktivität: 1965 mU/mg Protein).
0 1000 2000 3000
100 150 200 250 300 350 400
Tage nach Transplantation
Enzymaktivität mU/mg Protein
0 100 200
Prednison in mg
Enzymaktivität Arginase Prednison
Abb. 24 Arginase-Induktion durch Steroidmedikation: Patient HC 51
Patient HC 51 entwickelte 2 GvHD-Phasen, eine chronische GvHD der Haut ( ) bzw. eine chronische GvHD des Darms ( ), beide histologisch Grad I, die schon zu Beginn des Beobachtungszeitraums bestanden. Im Rahmen der histologisch gesicherten Haut- und Darm-GvHD-Episoden kam es zu keiner signifikanten Veränderung der Enzymaktivität. Nach klinischer Remission der Darm-GvHD um den Tag +120 entwickelte sich erneut eine Darm-GvHD ( ) ab Tag +165, wobei auf eine histologische Bestätigung verzichtet wurde. Prednison wurde in einer Dosierung von zunächst 80mg täglich appliziert, was zu einer signifikanten Erhöhung der Arginase-Aktivität in den Granulozyten führte.
Korreliert man nun die applizierte Steroidtagesdosis mit der an dem jeweiligen Tag gemessenen Arginaseaktivität der Granulozyten, so zeigte sich statistisch bei 68% der analysierbaren Verläufe eine positive Korrelation zwischen Steroiddosis und Enzymaktivität.
Eine repräsentative Analyse ist in Abb. 25 dargestellt. Diese Dosis-Wirkungs-Beziehung war in 41% der Fälle signifikant (p<0,05), in 24% sehr signifikant (p<0,01) und in 35%
hochsignifikant (p<0,001).
Bei einem Drittel der Verläufe konnte keine signifikante Korrelation zwischen Steroiddosis und Enzymaktivität festgestellt werden. Ein beispielhafter Verlauf ist in Abb. 26 dargestellt.
Eine vollständige Dokumentation der jeweiligen Korrelationen zeigt Tab. 6. Da es sich bei einer ersten Analyse der Verläufe gezeigt hatte, dass relativ niedrige Steroid-Tagesdosen offensichtlich keinen Einfluss auf die Arginase-Aktivität der Granulozyten haben, konzentriert sich die nachfolgende Auswertung auf Patienten mit einer Mindest-Tagesdosis von 30 mg (n=29/34). Aus statistischen Gründen wurden auch Patienten ausgeschlossen, bei denen weniger als 2 Granulozyten-Proben ohne Kortisonmedikation vorlagen (n=4/34).
0
Abb. 25 Einfluss der applizierten Steroiddosis auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten
Positive Korrelation: Patient BH 53
Bei Patient BH 53 zeigten sich kaum Schwankungen der Aktivität der Granulozyten-Arginase.
Aufgrund einer histologisch gesicherten GvHD der Mundschleimhaut ( ) wurde Prednison (zu Beginn 40mg täglich) verabreicht, konsekutiv kam es zu einem Anstieg der Enzymaktivität. Rechts:
Korrelation der Prednison-Tagesdosis mit der jeweiligen Arginase-Aktivität mittels linerarer Regression; Korrelationskoeffizient: ρ =0,8961 (p < 0,0001)
0
130 180 230 280 Tage nach Transplantation Enzymaktivität mU/mg Protein
Abb. 26 Einfluss der applizierten Steroiddosis auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten
Keine Korrelation nachweisbar: Patient WU 62
Bei Patient WU 62 bestand ein Verdacht auf GvHD der Leber und Haut. Prednison wurde in einer Dosierung von zunächst 40mg täglich appliziert. Es zeigte sich keine Modulation der Enzymaktivität:
ρ=-0,06041 (p>0,05)
Tab. 6 Korrelation von Steroiddosis und Granulozyten-Arginase-Aktivität
Zusammenstellung aller Patienten, die das Glukokortikoid Prednison aufgrund einer GvHD erhielten
PATIENT PROBENANZAHL (n) KORRELATIONSKOEFFIZIENT (r) SIGNIFIKANZNIVEAU (p)
BH53 17 0,8961 <0,0001
PA83 15 0,8589 <0,0001
GM74 17 0,8086 <0,0001
ST66 18 0,7397 0,0004
LS64 22 0,6929 0,0004
SH39 11 0,8612 0,0007
GB60 12 0,8163 0,0012
WH44 14 0,7264 0,0033
HC51 13 0,7188 0,0056
HS66 17 0,6197 0,0080
BJ50 8 0,8218 0,0123
BB43 14 0,6386 0,0140
MH40 8 0,7709 0,025
BH47 13 0,5917 0,0331
MM63 14 0,5678 0,0342
MW44 13 0,7709 0,0389
HH47 7 0,7703 0,0427
SH47 19 0,4442 0,0568
FK46 9 0,5474 0,1271
BK80 21 0,3180 0,1600
JU58 15 -0,5155 0,2120
GH56 23 0,2451 0,2596
WG46 19 0,3826 0,2752
WU62 18 -0,06041 0,8118
SM40 3 -0,2780 0,8207
Gezeigt ist die Korrelation (mittels linearer Regression) der applizierten Prednisontagesdosis je Patient mit der an dem jeweiligen Tag gemessenen Arginaseaktivität der Granulozyten. Patienten, denen initial weniger als 30 mg pro Tag appliziert wurde bzw. Patienten, bei denen weniger als 2 Granulozyten-Proben ohne Kortison bzw. weniger als 3 Messwerte vorlagen, wurden von der Analyse ausgeschlossen (n=9/34). Im oberen Bereich jeder Graphik ist jeweils der Korrelationskoeffizient ρ und das Signifikanzniveau p angegeben.
Die Induktion der Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch Steroidmedikation in vivo ist prinzipiell durch vermehrte Proteinexpression und/oder durch erhöhte enzymatische Aktivität durch posttranslationelle Modifikationen erklärbar. Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurde bei ausgewählten Patienten die Expression der hepatischen Isoform Arginase I im Kontext der Steroid-Medikation mittels Immunoblot analysiert. Wie in Abb.
27, Abb. 28 und Abb. 29 demonstriert, ist jeweils parallel zur Steroid-induzierten Arginase-Aktivität eine vermehrte Expression der Arginase I als Protein feststellbar. Nachdem bereits in 4.2.4 gezeigt wurde, dass humane Granulozyten in Ruhe einzig die hepatische Isoform der Arginase exprimieren, handelt es sich bei der im Kontext der Steroidmedikation induzierten Form ebenfalls um die Arginase I.
A B
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0 250
Prednison in mg Enzymaktivität mU/mg Protein
Abb. 27 Induktion von Arginase I Protein und Enzymaktivität in humanen Granulozyten durch
Abb. 27 Induktion von Arginase I Protein und Enzymaktivität in humanen Granulozyten durch