der Tierärztlichen Hochschule Hannover und
dem Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg (Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie und Onkologie, Medizinische Klinik und Poliklinik V der Universität Heidelberg)
Untersuchungen zur Regulation des Enzyms Arginase in humanen Granulozyten
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer
D O K T O R I N D E R V E T E R I N Ä R M E D I Z I N (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Gwendolyn Ulrike Maria Doschko aus Heidelberg
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
Dr. med. Markus Munder
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. I. Nolte
Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2004
Meinen lieben Eltern
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ... 8
1 Einleitung und Zielsetzung ... 11
2 Literaturübersicht... 13
2.1 Das Enzym Arginase ... 13
2.1.1 Induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) und Arginase ... 13
2.1.2 Das Enzym Arginase im murinen Immunsystem... 16
2.1.3 Funktion der Arginase in Krankheitsmodellen ... 17
2.1.4 Arginase im humanen System... 18
2.2 Myeloische Zellen ... 19
2.2.1 Makrophagen... 20
2.2.2 Dendritische Zellen ... 20
2.2.3 Granulozyten ... 21
2.3 Abstoßungsreaktion (Graft-versus-host reaction) ... 23
2.4 Glukokortikoide ... 26
2.4.1 Das Enzym Arginase und Glukokortikoide ... 27
3 Geräte, Material und Methoden ... 29
3.1 Geräte ... 29
3.2 Material ... 30
3.2.1 Verbrauchsmaterialien ... 30
3.2.2 Reagenzien ... 31
3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien ... 34
3.2.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen... 35
3.2.5 Humane Probanden ... 39
3.3 Methoden... 44
3.3.1 Gewinnung der Leukozyten ... 44
3.3.2 Separation mittels Ficoll... 44
3.3.3 Vitalitätsbestimmung von Zellen ... 45
3.3.4 Durchflusszytometrie ... 46
3.3.6 Auftrennung der PBMC ... 49
3.3.7 Kultivierung der Granulozyten in vitro... 49
3.3.8 Proteinmessung ... 50
3.3.9 Enzymaktivitätsmessung: Bestimmung der Arginase... 51
3.3.10 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) und Immunoblot ... 51
3.3.11 RNA-Extraktion ... 53
3.3.12 Quantifizierung der RNA ... 53
3.3.13 Statistisches Verfahren... 53
4 Ergebnisse... 55
4.1 Methodische Vorarbeiten ... 55
4.1.1 Bestimmung des pH-Optimums der humanen Granulozyten-Arginase... 55
4.1.2 Bestimmung der Enzymaktivität nach Präaktivierung mit zweiwertigen Ionen ... 56
4.2 Arginase in humanen myeloischen Zellen... 57
4.2.1 Arginase in humanen mononukleären Zellen und Granulozyten... 57
4.2.2 Arginase in hochreinen Granulozyten- und PBMC-Fraktionen... 59
4.2.3 Arginase in humanen Erythrozyten... 62
4.2.4 Arginase in Granuloyzyten von Patienten mit Arginase-Defizienz ... 63
4.3 Regulation der Arginase in vitro... 65
4.3.1 Stimulation der Granulozyten mit den TH2-Zytokinen IL-4 und IL-10... 67
4.3.2 Stimulation der Granulozyten mit den TH1-Zytokinen TNF-α und IFN-γ... 69
4.3.3 Stimulation der Granulozyten mit dem Chemokin IL-8 ... 69
4.3.4 Stimulation der Granulozyten mit Forskolin... 70
4.3.5 Stimulation der Granulozyten mit Dexamethason ... 70
4.3.6 Zusammenfassung der in vitro Experimente... 71
4.3.7 Interaktion der Granulozyten mit Thrombozyten... 72
4.4 Regulation der Arginase in vivo... 74
4.4.1 Enzymaktivität bei Kontrollpersonen... 75
4.4.2 Enzymaktivität bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation ... 75
allogener Stammzelltransplantation... 97
5 Diskussion... 100
5.1 Arginase in humanen myeloischen Zellen... 100
5.2 Arginase im murinen und humanen Immunsystem: fundamentale Differenzen in Lokalisation, Regulation und Funktion ... 102
5.3 In vivo veritas: Regulation der humanen Granulozyten-Arginase durch Glukokortikoide ... 105
5.4 Glukokortikoide und humane Granulozyten: Steigerung der Arginaseexpression während der Reifung im Knochenmark oder nach Abschluss der Differenzierung? ... 108
5.5 Steigerung der Arginase-Aktivität in PMN durch Steroide: Beeinflussung der Infektionsabwehr?... 110
5.6 Genetische Determination der Arginase-Aktivität in den Granulozyten? ... 110
5.7 Arginase I und IL8 in humanen Granulozyten: Charakterisierung eines (anti)inflammatorischen Phänotyps? ... 111
6 Zusammenfassung... 113
7 Summary... 115
8 Literaturverzeichnis... 117
9 Anhang... 132
9.1 Transplantationsvorbereitung (Konditionierung) des Patienten ... 132
9.1.1 GvHD-Prophylaxe und -Diagnostik... 132
9.2 Übersicht über die Patienten... 133
9.3 Verlauf der Patienten... 135
9.3.1 Patienten mit mehr als 6 Messzeitpunkten... 135
9.3.2 Patienten mit 6 oder weniger Zeitpunkten ... 174
A Ampere Abb. Abbildung
Aqua bidest. Aqua bidestillata (zweifach destiliertes Wasser)
BSA Bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise ca. zirka
CD Cluster of Differentiation
(System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigen) CD14+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD14
an der Oberfläche exprimieren
CD14- Zellen, die das Differenzierungsantigen CD14 nicht an der Oberfläche exprimieren
CMV Cytomegalie-Virus
CO2 Kohlenstoffdioxid
d.h. das heißt
DMSO Dimethylsulfoxid EDTA Ethylendiamintetraacetat
ERK Extracellular-regulated kinase
FACScan® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg) FITC Fluoreszeinisothiocyanat FL-1/2/3 FL-1=Grünfluoreszenz,530+-15nm
FL-2=Orangefluoreszenz,585+-21nm FL-3=Rotfluoreszenz, > 650nm FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht),
Messparameter des FACScan®
g Gramm
GvHD Graft-versus-host-disease (Erkrankung)
h Stunde (lateinisch, hora)
Hb Hämoglobin
I.E. internationale Einheiten
IFN Interferon IL Interleukin
iNOS induzierbare Stickstoffoxid-Synthase
m milli (x 10 )
mAK monoklonale(r) Antikörper
MIF Membranimmunfluoreszenz min Minute(n)
MnCl2 Manganchlorid
MSH Mundschleimhaut
MW arithmetischer Mittelwert
n Anzahl der Einzelbeobachtungen bei Berechnung des Mittelwerts
NaCl Natriumchlorid Nr Nummer p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse
der Ähnlichkeiten zweier Datengruppe PBMC mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
(engl. pheripheral blood mononuclear cells) PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte
Kochsalzlösung
Pellet Bodensatz durch Zentrifugation sedimentierter Zellen PI Propidiumiodid
PMN polymorphonuclear Leukocytes (Granulozyten) r / ρ Korrelationskoeffizient RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur s. siehe
SD Standardabweichung SDS-PAGE Natrium(Sodium) Dodecylsulfat-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese
SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®
Tab. Tabelle
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin TH T-Helfer-Zelle
TNF Tumornekrosefaktor
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
u.a. unter anderem V Volt
vgl. vergleiche
x g multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)
z.B. zum Beispiel
µ mikro (x 10-6)
1 Einleitung und Zielsetzung
Der Arginin-Stoffwechsel muriner Immunzellen spielt im Rahmen von entzündlichen Prozessen eine herausragende Rolle (BOGDAN 2001). Arginin kann zum einen über die Stickstoffmonoxid-Synthase (NO-Synthase) zu dem zytotoxischen Produkt NO verstoffwechselt werden. Beim alternativen Stoffwechselweg wird die Aminosäure Arginin durch das Enzym Arginase zu den Folgeprodukten Ornithin und Harnstoff umgesetzt.
Ornithin wiederum ist Ausgangsprodukt für die Synthese der Polyamine, welche grundlegende Funktionen bei Prozessen der Zellreplikation ausüben (TABOR & TABOR 1984) und von Prolin, welches in die Synthese von Kollagen mündet. Neben der antiinflammatorischen Potenz durch Kompetition mit iNOS um das gemeinsame Substrat Arginin scheint Arginase somit aktiv an Prozessen der Geweberegeneration und (patho)physiologischen Synthese von Extrazellularmatrix beteiligt zu sein (JENKINSON et al. 1996). Es sind zwei Isoenzymvarianten der Arginase bekannt, welche die gleiche Reaktion katalysieren, sich allerdings in zellulärer Lokalisation und Regulation voneinander unterscheiden. Neben der zytosolischen Arginase I des hepatischen Harnstoffzyklus wird in diversen extrahepatischen Geweben (v.a. Niere, Prostata, Dünndarm) des Säugetierorganismus mitochondriell die Arginase II exprimiert.
Die Regulation des Arginin-Stoffwechsels in murinen myeloischen Zellen verläuft streng dichotom durch Zytokine und CD4+T-Zellen. Während die NO-Synthase im Rahmen TH1- gesteuerter inflammatorischer Bedingungen exprimiert wird, induzieren TH2- Immunantworten die Expression der Arginase I in murinen Makrophagen und dendritischen Zellen (MUNDER et al. 1998, MUNDER et al. 1999) sowie in Granulozyten (MUNDER et al. Manuskript eingereicht).
Im Vergleich zu den mittlerweile detaillierten Kenntnissen im murinen System liegen kaum Daten zur Expression von Arginase in Zellen des humanen Immunsystems vor.
Es konnte bisher gezeigt werden, dass verschiedene humane Monozyten-Reifungsstadien beide Isoenzyme der Arginase exprimieren (ROUZAUT et al. 1999), und dass posttraumatisch Arginaseaktivität in humanen mononukleären Zellen induziert wird (OCHOA et al. 2000). Eine mögliche Beteiligung der Arginase im Rahmen inflammatorischer Prozesse zeigt sich durch die Überexpression der Arginase I in situ im Rahmen entzündlicher Infiltrate bei der humanen Psoriasis (BRUCH-GERHARZ et al. 2003). Des weiteren konnte auch in
inflammatorischen Zellen der Synovialflüssigkeit bei Patienten mit rheumatoider Arthritis Arginase-Expression nachgewiesen werden (CORRALIZA et al. 2002).
In Vorversuchen des Labors konnte gezeigt werden, dass innerhalb der humanen myeloischen Reihe das Enzym Arginase selektiv durch Granulozyten im Ruhezustand exprimiert wird. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit soll nun die Regulation der Arginase in humanen Granulozyten in vivo und in vitro untersucht werden.
Die Analyse in vitro erfolgt in Zellkulturexperimenten mit Granulozyten klinisch gesunder Probanden. Dabei soll zunächst die selektive Expression der Arginase in humanen Granulozyten an einem größeren Spenderkollektiv validiert werden. Anschließend soll in vitro untersucht werden, ob sich die konstitutive Arginase-Aktivität humaner Granulozyten durch Zytokine, Chemokine und immunmodulierende Substanzen beeinflussen lässt.
In einem zweiten Teil soll zur Klärung der Funktion und Regulation des Enzyms Arginase in vivo im humanen Immunsystem ein Patientenkollektiv im Verlauf nach allogener Stammzelltransplantation untersucht werden. Dieses Kollektiv scheint besonders geeignet, da diese Patienten zum einen nach Transplantation in relativ hoher Frequenz inflammatorische Probleme entwickeln, bei denen sowohl infektiöse (v.a. Sepsis, Pneumonie, Weichteilinfekte) wie nicht-infektiöse (GvHD) pathogenetische Effektormechanismen zugrunde liegen. Zum anderen erhalten diese Patienten verschiedene immunmodulierende Substanzen mit konsekutiver Beeinflussung der Granulozyten-Aktivierung (z.B. Steroide). So kann der mögliche Einfluss verschiedener pro- und antiinflammatorischer Zustände auf die humane Granulozyten-Arginase in vivo im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden.
2 Literaturübersicht
Das Immunsystem stellt ein komplexes Netzwerk miteinander interagierender Zellen und ihrer Botenstoffe und Effektormoleküle dar. Eine der zentralen Aufgaben dieses Systems besteht in der Steuerung von Inflammation und Antiinflammation: So sollen Pathogene über inflammatorische Mechanismen eliminiert werden, wobei im Idealfall ein Maximum an Effizienz (Inflammation) mit einem Minimum an Gewebedestruktion (Antiinflammation) kombiniert wird. Einer der zentralen Stoffwechselwege im murinen Immunsystem im Rahmen von Inflammation und Zytotoxizität ist der Arginin-Metabolismus myeloischer Zellen.
2.1 Das Enzym Arginase
2.1.1 Induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) und Arginase Die Aminosäure Arginin kann auf zwei Wegen abgebaut werden.
Durch das Enzym NO-Synthase, von dem drei Isoformen existieren, kann Arginin über das Zwischenprodukt NG-Hydroxy-L-Arginin zu Citrullin und Stickstoffmonoxid (NO) verstoffwechselt werden. Zwei der Isoformen, die neuronale und die endotheliale Form, synthetisieren Calcium-abhängig kleine Mengen an NO, die als Botenstoffe bei vielen physiologischen Prozessen (wie z.B. Vasoregulation oder Darmperistaltik) beteiligt sind. Die induzierbare NO-Synthase, welche die dritte Isoform darstellt, wird Calcium-unabhängig durch transkriptionelle Induktion reguliert (MACMICKING et al. 1997), wobei vor allem von Makrophagen große Mengen an NO über lange Zeiträume synthetisiert werden können. NO und weitere reaktive Folgeprodukte (z.B. Peroxynitrit) wiederum interagieren dann mit Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren und sind so an zytotoxischen, antibakteriellen und antiviralen Abwehrmechanismen beteiligt.
In einem alternativen Stoffwechselweg kann Arginin mittels Hydrolyse durch das Enzym Arginase zu den Produkten Ornithin und Harnstoff abgebaut werden. Aus der Aminosäure Ornithin kann durch die mitochondriell gelegene Ornithin-Aminotransferase Prolin synthetisiert werden, welches eine zentrale Komponente des Kollagen darstellt. Durch das Enzym Ornithin-Decarboxylase wird Ornithin zu den Polyaminen Putrescin, Spermidin und Spermin abgebaut, welche u.a. bei der Zellreplikation von Bedeutung sind (TABOR &
TABOR 1984).
Das Enzym Arginase wurde bei vielen Prokaryonten und Eukaryonten charakterisiert und liegt als multimerer, zumeist trimerer bis hexamerer Komplex vor, welcher aus identischen Untereinheiten besteht (Molekulargewicht 30-40 kDa). Im aktiven Zentrum befinden sich zwei Mn2+-Ionen, die für die Stabilität und Aktivität des Enzyms notwendig sind (KANYO et al. 1996). Das pH-Optimum liegt im basischen Bereich bei pH 9-10.
Beim Menschen existieren zwei Isoenzymvarianten: Im hepatischen Harnstoffzyklus nimmt die zytosolisch gelegene Arginase (Arginase I) eine wichtige Stellung ein, da diese Ammoniak aus dem Proteinkatabolismus letztlich zu Harnstoff abbaut, welcher dann über die Nieren ausgeschieden werden kann. Die grossen Organismenklassen lassen sich dabei hinsichtlich ihrer metabolischen Entsorgung von Ammoniak einteilen. Fische und amphibische Larven sezernieren Ammoniak direkt in das umgebende Wasser, während Vögel und landlebende Reptilien es in Form von praktisch unlöslicher Harnsäure ausscheiden (JENKINSON et al. 1996). Von allen im Harnstoffzyklus gelegenen Enzymen weist die Arginase die höchste Aktivität auf. Eine Übersicht des Harnstoffzyklus findet sich in Abb. 1.
Abb. 1 Funktion der Arginase im Harnstoffzyklus (LÖFFLER & PETRIDES 2003)
Die zweite Isoenzymvariante, die mitochondriell gelegene Arginase II, die sich aufgrund ihrer Regulation, chromosomalen Lokalisation (Arginase I: Chromosom 6; Arginase II:
Chromosom: 14) und diverser physikochemischer Eigenschaften von der anderen Isoenzymvariante unterscheidet, ist in vielen extrahepatischen Geweben (v.a. Gehirn, Niere, Prostata und Dünndarm) zu finden. Sie katalysiert die gleiche enzymatische Reaktion (JENKINSON et al. 1996). Hierbei kontrolliert die Arginase an wichtigen Stellen des Metabolismus die Höhe des Argininspiegels und liefert Ornithin für die Synthese z.B. von Harnstoff, Proteinen, Kreatin, NO, Polyaminen, Prolin, Glutamat, Glutamin, GABA (γ- Aminobuttersäure) und Agmatin.
Je nach Expression der alternativen Enzyme iNOS oder Arginase verschiebt sich folglich die Homöostase des Immunsystems entweder in Richtung Inflammation (Generierung reaktiver
Stickstoffverbindungen durch iNOS) oder Anti-Inflammation (Reparaturprozesse, Kollagensynthese durch Arginase) (BOGDAN 2001).
2.1.2 Das Enzym Arginase im murinen Immunsystem
Murine Makrophagen und dendritische Zellen können sowohl hohe Arginaseaktivität als auch iNOS exprimieren (CORRALIZA et al. 1995, MODOLELL et al. 1995, MUNDER et al.
1999). Dabei können diese Stoffwechselwege durch bestimmte Zytokine, bakterielle Produkte oder antigenabhängig durch aktivierte T-Zellen in den myeloischen Zellen induziert werden.
Während Lipopolysaccharid gramnegativer Bakterien gleichzeitig beide Enzyme des Argininstoffwechsels induziert (WANG et al. 1995), findet eine selektive Induktion eines der beiden Enzyme im Rahmen CD4+ T-Zell-gesteuerter und zytokinvermittelter Immunreaktionen statt. Hierbei lassen sich CD4+ T-Zellen anhand ihrer sezernierten Zytokine in zwei große Klassen einteilen (ABBAS et al. 1996). T-Helfer 1 (TH1) Zellen sezernieren die Zytokine IFN-γ, IL-2 und TNF-β, während TH2-Zellen die Zytokine IL-4, IL-5, IL-6, IL- 10 und IL-13 bei Stimulation produzieren. Diesem dichotomen Zytokin-Sekretionsmuster entsprechen ebenso unterschiedliche Funktionen. TH1-Zellen sind v.a. an zellvermittelten Immunreaktionen und TH2-Zytokine eher an humoralen Immunantworten beteiligt. Die zentrale Bedeutung dieser Dichotomie zeigt sich im Verlauf zahlreicher muriner Infektionen, der wesentlich vom Typ der T-Zell-Polarisierung bestimmt wird (MOSMANN & SAD 1996).
Typische TH1-Zytokine (TNF-α, IFN-γ) induzieren die Expression von iNOS und Hemmung der Arginase, während typische TH2-Zytokine (IL-4, IL-10, IL-13) umgekehrt die Expression der Arginase und Hemmung der iNOS bewirken (CORRALIZA et al. 1995, MODOLELL et al. 1995).
Die Zwischen- und Endprodukte der jeweiligen Stoffwechselwege sind ebenfalls an der dichotomen Regulation beteiligt. So hemmt Nitrit, ein stabiles Produkt von NO, bzw. NG- Hydroxy-L-Arginin die Arginase (BOUCHER et al. 1994, HRABAK et al. 1996), während das Polyamin Spermin (SOUTHAN et al. 1994) und Harnstoff (PRABHAKAR et al. 1997) die iNOS hemmen (s. Abb. 2).
Arginin
NO+ Citrullin Ornithin+ Harnstoff
Polyamine
(Putrescin, Spermidin, Spermin)
Prolin
Kollagen
TH1 Zytokine (IFN-γ, TNF-α, TNF-β) LPS
TH2 Zytokine (IL-4, IL-10, IL-13)
LPS +
OAT ODC
+
Arginase iNOS
Arginin
NO+ Citrullin Ornithin+ Harnstoff
Polyamine
(Putrescin, Spermidin, Spermin)
Prolin
Kollagen
TH1 Zytokine (IFN-γ, TNF-α, TNF-β) LPS
TH2 Zytokine (IL-4, IL-10, IL-13)
LPS +
OAT ODC
+
Arginase
Arginase iNOSiNOS
Abb. 2 Argininstoffwechsel in murinen Makrophagen: Regulation und Folgeprodukte
Murine Makrophagen können durch bestimmte Zytokine bzw. bakterielle Produkte zur Expression von iNOS bzw. Arginase stimuliert werden. Durch LPS können beide Enzyme des Argininstoffwechsels induziert werden. Typische TH1-Zytokine (TNF-α, IFN-γ) führen zur Expression der induzierbaren NOS und Hemmung der Arginase, während typische TH2-Zytokine (IL-4, IL-13, IL-10) die Expression der Arginase und Hemmung der iNOS bewirken. Auch die Zwischen- und Endprodukte der jeweiligen Stoffwechselwege greifen in die Regulation ein. Nitrit hemmt die Arginase, während das Polyamin Spermin und Harnstoff die induzierbare NOS hemmen. OAT: Ornithin-Aminotranferase ODC: Ornithin-Decarboxylase
Auch auf zellulärer Ebene mit polarisierten TH1- und TH2-Zell-Klonen zeigte sich diese dichotome Regulation, wobei durch synergistische Kooperation der sezernierten TH2- Zytokine IL-4 und IL-10 bzw. IL-13 und IL-10 sehr hohe Arginase-Aktivitäten in den murinen myeloischen Zellen induziert werden (MUNDER et al. 1998, MUNDER et al. 1999).
2.1.3 Funktion der Arginase in Krankheitsmodellen
In murinen Krankheitsmodellen zeigt sich, dass die Polarisierung des Argininstoffwechsels für den Phänotyp der Immunantwort von Bedeutung ist.
Die dichotome Regulation des Argininstoffwechsels korreliert mit dem inflammatorischen Phänotyp und dem Verlauf bei verschiedenen murinen Krankheitsmodellen wie beispielsweise bei der Wundheilung (SHEARER et al. 1997), der granulomatösen Entzündung (RUTSCHMAN et al. 2001), der Herpes-simplex-Infektion (MISTRY et al.
2001), der Sepsis (CARRAWAY et al. 1998) sowie der autoimmunen Glomerulonephritis (WADDINGTON et al. 1998). So ist die frühe Phase einer Inflammation bzw. die Tumorabstoßung mit der Expression des Enzyms iNOS vergesellschaftet, wobei die entstehenden reaktiven Stickstoffverbindungen ein zytotoxisches Umfeld schaffen.
Demgegenüber wird im weiteren Verlauf der Inflammation zunehmend Arginase in den
myeloischen Zellen exprimiert. Im Rahmen dieser späteren Phase setzen reparative Prozesse ein, welche die Arginase durch Bereitstellung von Prolin für die Kollagensynthese bzw.
Polyaminen zur Fibroblastenreplikation begünstigt. Auch in einem murinen Tumormodell wurde die Assoziation von Zytotoxizität (Tumorabstoßung) mit der iNOS bzw. von Tumorprogress mit der Arginase demonstriert. So konnte gezeigt werden, dass Mäuse nach Präimmunisierung mit avitalen P815 Tumorzellen nachfolgend intraperitoneal injizierte vitale P815 Tumoren abstoßen, während es in naiven Mäusen zu einem progredienten Tumorwachstum kommt. Im Rahmen der Tumorabstoßung exprimieren die im Tumor enthaltenen Makrophagen vermehrt NO-Synthase, was zu einem Anstieg der Produktion von NO und Citrullin im Tumorgewebe führt. Im Gegensatz hierzu ist der Tumorprogress mit einem Abfall der Citrullin- und NO-Produktion und einer vermehrten Arginaseexpression der infiltrierenden Makrophagen assoziiert (MILLS et al. 1992).
Die pathogenetische Relevanz der Arginase wurde auch im murinen Krankheitsmodell einer Infektion mit Schistosoma mansoni gezeigt. In dieser Infektion kommt es im Rahmen einer TH2-Zytokin-induzierten Immunantwort zur pathologisch-fibrosierenden Granulombildung durch lokale Makrophagen mit starker Arginase-Expression. Diese TH2-induzierten Zellen unterhalten durch Prolin-Bereitstellung und konsekutive Kollagensynthese die Granulombildung (HESSE et al. 2001). Bei einer Infektion muriner Makrophagen durch Trypanosoma cruzi wird das Parasitenwachstum durch Arginaseexpression der Makrophagen gefördert (STEMPIN et al. 2004).
Auch bei der murinen Leishmaniasis spielt die Aktivierung der Arginase über TH2-Zytokine eine Rolle für den Krankheitsverlauf. Leishmanien sind auxotroph für Polyamine, welche durch TH2-induzierte Makrophagen bereitgestellt werden. Diesen Mechanismus nutzen die Parasiten über eine TH2-Polarisierung der Immunantwort gezielt, um sich innerhalb des Wirtes zu vermehren (INIESTA et al. 2001).
2.1.4 Arginase im humanen System
Im humanen System kommt es unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen zu einer vermehrten Expression der Arginase. So wurde in entzündlichen Infiltraten bei Patienten mit Psoriasis eine vermehrte Expression der Arginase I beschrieben (BRUCH-GERHARZ et al.
2003). In der Synovia von Patienten mit rheumatoider Arthritis wurde eine Hochregulation
der Arginase II beobachtet (CORRALIZA et al. 2002). Ebenso konnte im Tumorgewebe der Milchdrüse vermehrt Arginase gemessen werden (POREMBSKA et al. 2003).
Im menschlichen hämatopoetischen System wurde Arginaseaktivität in Granulozyten bei einem an chronisch myeloischer Leukämie erkrankten Patienten nachgewiesen. Auch bei zwei an akuter myeloischer Leukämie erkrankten Patienten war Arginaseaktivität im Überstand maligner Zellen nach Differenzierungsinduktion zu finden (REYERO et al. 1975, PALU et al.
1979).
In humanen Erythrozyten konnte eine Expression der Arginase gemessen werden, wobei es sich um das Isoenzym I handelt (SPECTOR et al. 1985, KIM et al. 2002).
Erhöhte Arginase-Aktivität wurde in peripheren humanen mononukleären Zellen nach Verletzungen entdeckt, wobei die Zunahme der zellulären Arginase-Aktivität korreliert war mit einer abnehmenden Plasma-Arginin-Konzentration sowie dem Schweregrad der Verletzung (OCHOA et al. 2001).
Auch im Serum klinisch gesunder Probanden kann Arginase-Aktivität gemessen werden.
Außerdem zeigte sich bei Untersuchungen von Patienten mit Mammatumoren eine erhöhte Enzymaktivität im Serum, die positiv mit dem Stadium der Erkrankung korrelierte (POREMBSKA et al. 2002, POLAT et al. 2003). Ebenso konnte bei Patienten mit kolorektalem Karzinom eine erhöhte Aktivität im Serum nachgewiesen werden, die nach Tumorresektion wieder abfiel (POREMBSKA et al. 2002). Weiter zeigten sich bei Patienten mit rheumatoider Arthritis erhöhte Enzymwerte im Serum (HUANG et al. 2001).
2.2 Myeloische Zellen
Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wird der Arginase-Stoffwechselweg in humanen Granulozyten näher charakterisiert. Im folgenden soll daher kurz auf das myeloische Zellsystem sowie die Stellung der Granulozyten innerhalb dieses Zellsystems eingegangen werden.
Im Knochenmark kommt es zur Bildung der pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle, von der sich alle zellulären Bestandteile des Blutes ableiten. Während die lymphatischen Vorläuferzellen zur Reifung der T-Lymphozyten in den Thymus abwandern, verbleiben die lymphatischen Vorläuferzellen der B-Lymphozyten wie auch die myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark, wo sie v.a. zu Monozyten und Granulozyten ausdifferenzieren.
2.2.1 Makrophagen
Aus myeloischen Vorläuferzellen entwickeln sich Monozyten, die nach Auswanderung aus dem Blutstrom in verschiedene Gewebe zu Makrophagen differenzieren. Je nach Aufenthaltsort und Aktivierungszustand variieren Makrophagen funktionell und morphologisch stark. Wesentliche Aufgabe der Makrophagen ist die Erkennung und Bekämpfung von Infektionen. Sie gehören zu den ersten Zellen am Infektionsort und erkennen Bakterien an allgemein vorkommenden Oberflächenstrukturen mittels Rezeptoren (z.B. Toll-like-Rezeptoren, Mannose- und Scavenger-Rezeptor), welche die Phagozytose der Infektionserreger bzw. die Aktivierung des Makrophagen einleiten.
So führt eine Stimulation des Makrophagen über Toll-like-Rezeptoren zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktor NFκB und konsekutiv zur Produktion verschiedener Zytokine und Expression der B7-Kostimulationsproteine. Diese wiederum spielen eine wichtige Rolle bei der Antigenpräsentation und somit der Induktion der adaptiven Immunantwort.
Neben einer Vielzahl von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen (z.B. TNF-α, G-CSF, IL-10, IL-15) sezernieren Makrophagen Chemokine (z.B. IL-8, MCP-1), die über spezialisierte Rezeptoren weitere Entzündungszellen an den Infektionsort bringen.
Makrophagen sind somit gleichsam Bindeglieder zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem (JANEWAY & TRAVERS 2002).
2.2.2 Dendritische Zellen
Aus der myeloischen Vorläuferzelle können sich dendritische Zellen differenzieren.
Dendritische Zellen sind wesentlich für die Antigenpräsentation und Primärstimulation von naiven T-Zellen verantwortlich (BANCHERAU & STEINMAN 1998).
Sie wandern im unreifen Zustand aus dem Blutstrom ins Gewebe, wo sie verbleiben und als interdigitierende Zellen in einem Netzwerk verteilt sind. Dendritische Zellen nehmen Antigene über Phagozytose (z.B. via Mannoserezeptor) und über Makropinozytose (SALLUSTO et al. 1995) auf. Nach Antigenaufnahme in einem inflammatorischen Milieu migrieren dendritische Zellen zum drainierenden Lymphknoten. Während der Migration erfolgt eine weitere Ausreifung und Aktivierung der dendritischen Zellen. Im Zuge dieser Differenzierung verlieren sie weitgehend die Fähigkeit zur Antigenaufnahme. Sie exprimieren stattdessen in hoher Dichte MHC-Klasse I und II-Proteine, Kostimulations- und Adhäsionsmoleküle und sind somit ausgerichtet auf eine möglichst effektive
Antigenpräsentation und ggf. Aktivierung interagierender T-Zellen (JANEWAY &
TRAVERS 2002).
2.2.3 Granulozyten
Die Entwicklung des Granulozyten führt über verschiedene Differenzierungsstufen im Knochenmark (Promyelozyt- Metamyelozyt- Myelozyt- Stabkerniger- Segmentkerniger) schließlich zur Ausschwemmung in die Blutzirkulation, wobei z.B. bakterielle Produkte (LPS) oder Glukokortikoide den Prozess der Ausschwemmung befördern. Die komplette Entwicklung dauert ca. 10 Tage, nach dem Stadium des Myelozyten verliert der reifende Granulozyt die Fähigkeit zur Replikation. Die Halbwertszeit des im Blut zirkulierenden Granulozyten beträgt lediglich 4-10 Stunden. Im Blut unterscheidet man eine zirkulierende und eine am Endothel verlangsamt entlangrollende Fraktion.
Granulozyten verdanken ihren Namen der ausgeprägten zytoplasmatischen Granulierung. Sie enthalten vier verschiedene Granula-Typen, die sich in ihrer Proteinzusammensetzung und Funktion voneinander unterscheiden. Insgesamt sind bislang mehr als 50 verschiedene Proteine als Bestandteile der diversen Granula bekannt. Die Primärgranula (azurophile Granula), deren Markerprotein die Myeloperoxidase darstellt, verschmelzen mit dem Phagolysosom nach Phagozytose und entleeren ihren Inhalt (v.a. hydrolytische und bakterizide Proteine) in das neue Kompartiment. Demgegenüber sind die Sekundärgranula (Markerprotein: Lactoferrin) wesentlich für die Exozytose ihrer Inhaltsstoffe vorgesehen.
Neben diesen Granulatypen sind noch Tertiärgranula (Markerprotein: Gelatinase) und sekretorische Vesikel beschrieben (BORREGAARD & COWLAND 1997, GEMSA et al.
1997, JANEWAY & TRAVERS 2002). Es existieren drei Arten von Granulozyten:
neutrophile Granulozyten, welche als Phagozyten wesentlich für die Infektionsabwehr des Organismus sind, eosinophile Granulozyten, die bei der Abwehr von Infektionen durch Parasiten und Würmer beteiligt sind und basophile Granulozyten, deren primäre physiologische Funktion weitgehend unklar ist.
Neutrophile Granulozyten gehören zu den ersten Immunzellen, die angelockt durch Chemokine, welche von Makrophagen, Epithelzellen und Endothelzellen als Reaktion auf bakterielle Bestandteile sezerniert werden, am Ort eines Infektionsgeschehens erscheinen. Es kommt zur Wanderung der Neutrophilen aus dem Blutgefäß ins Gewebe, der sogenannten Extravasation.
Eingeleitet wird diese durch die in den Weibel-Palade-Körperchen der Endothelzellen vorliegenden P-Selektinen und E-Selektinen, die wenige Minuten bzw. einige Stunden nach Freisetzung chemotaktischer Faktoren an der Oberfläche der Endothelzellen erscheinen.
Diese Selektine erkennen die sulfatisierte Sialyl-Lewisx-Einheit, die an der Oberfläche der Neutrophilen zu finden sind. Durch die Wechselwirkung zwischen Selektin und der Sialyl- Lewisx-Einheit kommt es zum reversiblen Anheften der Neutrophilen an die Endothelzellen und somit zu ihrer Abbremsung („rollen“), was eine stärkere Interaktion ermöglicht. Kommt es nun durch TNF-α induziert auf den Endothelzellen zur Expression des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 und auf der Oberfläche der Granulozyten durch Chemokine (z.B. IL-8) zu einer Konformationsänderung der Integrine LFA-1 und Mac-1, die normalerweise nur eine schwache Adhäsion zeigen, heften sich die Granulozyten nun fest an das Endothel und beenden das Entlangrollen. Mit Hilfe des immunglobulinähnlichen Molekül CD31, das sowohl auf den Granulozyten als auch an den Verbindungsstellen der Endothelzellen vorkommt, wird es den Neutrophilen ermöglicht, sich zwischen die Endothelzellen zu drängen und das Blutgefäß zu verlassen („Diapedese“), wobei die Basalmembran mittels proteolytischer Enzyme der Granulozyten für diese passierbar wird. Im Gewebe reagieren die Leukozyten auf Chemokine und erreichen entlang eines Konzentrationsgradienten den Infektionsherd (JANEWAY & TRAVERS 2002). Schon der Kontakt der Granulozyten mit dem Fremdmaterial bzw. mit IL-8 und TNF-α setzt verschiedene Kaskaden in Gang. In der Arachidonsäurekaskade werden z.B. biologisch hoch-wirksame Eicosanoide freigesetzt (Prostaglandine, Leukotriene). Die Granulozyten besitzen weiterhin die Fähigkeit zur Phagozytose, indem sie durch Ausstülpung der Membran als Pseudopodium das Pathogen umhüllen. Für eine effiziente Phagozytose wesentlich ist die Interaktion von Komplement- und FC-Rezeptoren des Granulozyten mit opsonisierenden Strukturen (Immunglobuline, Komplement) auf der Oberfläche des Pathogens. Es bildet sich so ein Phagosom, welches dann als Phagolysosom v.a. mit azurophilen Granula verschmilzt.
Granulozyten verfügen über ein breites Spektrum oxidativer und nicht-oxidativer Abwehr- mechanismen gegenüber Pathogenen. Durch das Enzymsystem der NADPH Oxidase werden im sogenannten „respiratory burst“ aus molekularem Sauerstoff Superoxidanionen und durch weitere Umsetzung Hydroxylradikale und Hypochlorsäure gebildet. Diese hochreaktiven Verbindungen wirken antimikrobiell, aktivieren Metalloproteinasen und inaktivieren Antiproteinasen, was u.a. für die Gewebeschädigung im Rahmen einer Granulozyten-
vermittelten Entzündung verantwortlich ist. Neben den oxidativen Abwehrsystemen besitzen Granulozyten in ihren Granula verschiedene nicht-oxidativ operierende antimikrobielle Proteine (Defensine, Cathepsin G, Azurocidin, bacterial-permeability increasing protein, Lactoferrin). Nach Verrichtung ihrer Aufgabe im Rahmen von Inflammation sterben Granulozyten rasch durch Apoptose oder Nekrose ab und werden durch Makrophagen phagozytiert (GEMSA et al. 1997, JANEWAY & TRAVERS 2002).
2.3 Abstoßungsreaktion (Graft-versus-host reaction)
Bei einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD) kommt es zur Abstoßung von Empfänger- Zellen, Geweben und Organen (host) durch alloreaktive Spender-T-Lymphozyten (graft), die sich aus dem Transplantat des Spenders entwickeln und die Zellen des Empfängers aufgrund antigener Differenzen als „fremd“ erkennen.
Es gibt drei Voraussetzungen, die für das Entstehen einer GvHD erfüllt sein müssen (BILLINGHAM 1966). Dies sind die Übertragung immunkompetenter Zellen, eine Histoinkompatibilität zwischen Spender und Empfänger, und die Unfähigkeit des Empfängers, die transfundierten oder transplantierten Zellen zu inaktivieren oder zu zerstören.
Alle diese Voraussetzungen sind bei einer allogenen Blutstammzell-Transplantation mit nicht-monozygotem Spender erfüllt, wobei die klinisch relevante Inzidenz der GvHD in Abhängigkeit von der Spendersituation trotz immunsuppressiver medikamentöser Prophylaxe und der Auswahl eines in möglichst vielen HLA-Loci kompatiblen Spenders zwischen 30%
und 80% (BEATTY et al. 1985) beträgt. Die Rate höhergradiger akuter GvHD-Reaktionen steigt aufgrund der Tatsache, dass zunehmend ältere Patienten transplantiert werden, und sich der Anteil an Fremdspendern und Mismatch-Transplantationen (Nicht-Übersteinstimmung zwischen Spender und Empfänger auf einem HLA-Allel) erhöht. In welchem Ausmaß eine Abstoßung auftritt, hängt zum einem von der allelischen Variabilität im Bereich der verschiedenen Genloci des Haupthistokompatibilitätskomplexes (HLA A, B, C, DR, DP, DQ) sowie weiterer, heute noch unvollständig charakterisierter sog. „minor histocompatibility antigens“ ab. Auch das Alter des Patienten, Geschlechtsunterschiede zwischen Spender und Empfänger, die Art der vorbereitenden Konditionierung, der CMV (Cytomegalievirus)-Status, der klinische Zustand des Patienten vor der Transplantation und Art und Umfang der Immunsuppression bestimmen die Inzidenz einer GvHD (GALE et al. 1987, NASH et al.
1992).
Pathophysiologisch betrachtet ist die GvHD eine entzündliche Reaktion, welche durch immunkompetente Zellen aus dem Transplantat des Spenders ausgelöst wird, die sich gegen Empfängerzellen richten. Diese immunkompetenten Zellen erkennen Fremdstrukturen des Empfängers durch direkte oder indirekte Alloreaktivität und werden dadurch aktiviert. Die Antigene werden den Spender-T-Zellen durch Antigen-präsentierende Zellen wie dendritische Zellen oder Makrophagen präsentiert, wobei Interleukin 1, das hauptsächlich von Monozyten produziert wird, die T-Helfer-Zellen zusammen mit anderen Faktoren stimuliert. Die T- Helfer-Zellen wiederum exprimieren Interleukin 2, was zytotoxische CD8-positive T-Zellen aktiviert. Diese reagieren mit den Empfänger-Zielzellen, die den MHC-Klasse-I-Komplex auf ihrer Oberfläche besitzen. Die aktivierten T-Zellen sezernieren ein ganzes Spektrum proinflammatorischer Zytokine (z.B. IFN-γ, TNF-α), aktivieren andere Effektorzellen des Immunsystems (z.B. Makrophagen und NK-Zellen) und vermitteln direkte Zytotoxizität (z.B.
CD8+ T-Zell-vermittelt über Perforine und Granzym). Im murinen System konnte eine Dominanz von TH1-vermittelten Immunreaktionen, die wesentlich durch CD4+-Zell- Aktivierung initiiert und unterhalten wird, gezeigt werden (FERRARA et al. 1996).
Zeichen einer GvHD treten bevorzugt an den Organsystemen Haut, Gastrointestinaltrakt und Leber auf. Am häufigsten betroffen ist die Haut. Bei einem Vergleich (MARTIN et al. 1990) von 740 an akuter GvHD erkrankter Menschen zeigten 81% einen Befall der Haut, 54%
Zeichen am Gastrointestinaltrakt und 50% an der Leber.
Die Hautmanifestationen zeigen ein breites Spektrum, welches vom typischen makulopapulösen Exanthem bis zur generalisierten bullösen Erythrodermie reichen kann.
Typische Prädilektionsstellen sind Handflächen, Fußsohlen, Schultern und Nacken. Eine Ausbreitung der häufig juckenden entzündlichen Hautreaktion über den gesamten Körper ist möglich. Nicht selten sind besonders bei chronischer GvHD neben der Haut auch die Schleimhäute betroffen. Das Ausmaß der GvHD wird anhand der befallenen Körper- oberfläche ermittelt und ist nicht zuletzt abhängig von der Schwere der Hautreaktion (Erythem, Blasenbildung, Nekrosen und weiteres).
Histopathologisch lässt sich neben der Zerstörung des Epithelgewebes und Zellnekrosen bei schweren Formen eine komplette Ablösung des oberen Teils der Epidermis von darunter liegenden Hautschichten nachweisen. Die GvHD des Gastrointestinaltraktes ist eine der häufigsten Todesursachen nach allogener Blutstammzell-Transplantation. Sie äußert sich meist in sehr starken, teils blutigen, hochfrequenten wässrigen Diarrhöen und krampfartigen
Bauchschmerzen. Die pro Tag ausgeschiedene Stuhlmenge ist für die Beurteilung des Schweregrades entscheidend. Bei schweren Verläufen kann sie mehrere Liter betragen und führt somit zu einem massiven Verlust an Elektrolyten und Körperflüssigkeit.
Differentialdiagnostisch müssen dabei vor allem virale (z.B. CMV, Rotavirus, HSV, Adenovirus) oder bakterielle Enteritiden sowie die Clostridium difficile-assoziierte Enterokolitis abgegrenzt werden. Zur Beurteilung des histologischen Schweregrades wird in der Regel eine endoskopische Untersuchung des Gastrointestinaltraktes mit Gewinnung von Stufenbiopsien vorgenommen. Typischerweise ist das Kolon des Patienten betroffen, GvHD- Zeichen können aber auch in allen anderen Bereichen des Gastrointestinaltraktes, wie beispielsweise Magen, Ösophagus oder Duodenum auftreten.
Die Leber-GvHD ist eine entzündliche Erkrankung des Epithels der kleinen Gallengänge, wobei es zu einem cholestatischen Ikterus mit direkter Hyperbilirubinämie, Anstieg der Cholestaseparameter (AP, γGT) und weniger ausgeprägt auch der Transaminasen kommt.
Differentialdiagnostisch kommen z.B. virale Hepatitis, medikamententoxische Leberschäden oder Venenverschlusskrankheit in Frage.
Je nach Ausmaß der Organbeteiligung und histologischer Analyse des betroffenen Areals wird die GvHD in vier histologische Schweregrade unterteilt (GLUCKSBERG et al. 1974).
Aus dem Zusammenspiel aller beteiligten Organsysteme ergibt sich ein klinisches Gesamtstadium, das von einer milden GvHD im Grad I bis zu einer lebensbedrohlichen Symptomatik im Grad IV reichen kann.
Man unterscheidet zwischen einer akuten und einer chronischen GvHD, wobei die akute GvHD innerhalb der ersten 100 Tage und die chronische GvHD typischerweise nach mehr als 100 Tagen nach allogener Transplantation auftritt. Zur Unterscheidung zwischen diesen beiden Formen ist jedoch nicht primär der Zeitpunkt des Auftretens relevant, sondern das klinische Erscheinungsbild.
So zeigt die akute GvHD meist ein sich rasch entwickelndes und - falls medikamentös nicht beherrschbar – schnell progredientes Krankheitsbild, während die chronische GvHD, die schätzungsweise 40%-60% der Langzeitüberlebenden entwickeln (VOGELSANG et al.
2003), eher schleichend verläuft. Während in den letzten drei Jahrzehnten bei transplantierten Patienten die Mortalität nach akuter GvHD durch Entdeckung neuer Immunsuppressiva deutlich gesenkt werden konnte, so ist es bis heute kaum möglich, die Häufigkeit des
Auftretens der chronischen GvHD sowie deren Mortalitätsrate zu senken (GÖRNER et al.
2002).
Die akute GvHD, die mit zunehmendem Alter der Patienten eine höhere Inzidenz zu haben scheint, ist häufig mit Fieber, Verschlechterung des Allgemeinzustandes und Gewichtsverlust verbunden. Neben den genannten Organen können auch lymphatische Organe, die Konjunktiven oder die Bronchien betroffen sein. Bei der chronischen Form der GvHD, die Ähnlichkeiten zu bestimmten schweren Autoimmunerkrankungen aufweist, sind oft auch Schleimhäute, Augen, Ösophagus, Lunge oder Muskeln betroffen.
Therapiebedürftigkeit bezüglich einer GvHD besteht in der Regel ab einem klinischen Gesamtschweregrad II, insbesondere bei viszeraler Beteiligung. Die Primärtherapie besteht in der Gabe von Steroiden wie beispielsweise Prednison, welches die zellvermittelte Immunität durch eine Reduktion der Zahl an Lymphozyten und eosinophilen Granulozyten supprimiert.
Das rasche Ansprechen der GvHD auf diese Therapie ist von großer Bedeutung für die weitere Prognose des Patienten. Bei Therapierefraktärität können sich, ähnlich zu Darmerkrankungen anderer Genese, Komplikationen wie Ileusbildung, Perforation, Megakolon, schwere Blutungen oder exsudative Enteropathiesyndrome entwickeln. Die Mortalität der schweren, steroidrefraktären GvHD liegt bei etwa 70% (MARTIN et al. 1990).
2.4 Glukokortikoide
Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wird der Einfluss von Glukokortikoiden auf die Arginase-Aktivität humaner Granulozyten in vitro und in vivo untersucht. Glukokortikoide werden zum einen bei einer Vielzahl von inflammatorischen Erkrankungen als Immunsuppressivum therapeutisch eingesetzt. Sie beeinflussen die Reaktionslage des Immunsystems durch Interaktion mit verschiedenen Zelltypen wie beispielsweise neutrophilen Granulozyten (COX 1995), Eosinophilen und Lymphozyten (OHTA &
YAMASHITA 1999, FRANCHIMONT 2004) sowie durch Induktion einer Vielzahl zellulärer Mechanismen (COX 1995, NAKAGAWA et al. 1998, OHTA & YAMASHITA 1999). Bei schwereren Verlaufsformen der GvHD stellen sie das Mittel der ersten Wahl dar (s. 2.3). Ihre Wirkungsweise summiert sich hierbei zu einer im wesentlichen antiinflammatorischen Effektorfunktion. Da in verschiedenen Studien eine Beeinflussung der Arginaseexpression durch Steroide gezeigt worden war, schien es interessant, eine mögliche Regulation der humanen Granulozyten-Arginase durch Glukokortikoide zu analysieren.
Glukokortikoide werden hauptsächlich in der Zona fasciculata der Nebennierenrinde gebildet (TAN et al. 1975). Über die Freisetzung des Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) aus dem Hypothalamus erfolgt die Ausschüttung von ACTH aus dem Hypophysenvorderlappen, welches wiederum die Synthese von Glukokortikoiden in der Nebennierenrinde bewirkt. Die Ausschüttung des ACTH und somit die vermehrte Synthese und Ausschüttung der Glukokortikoide erfolgt zirkadian, mit einem morgendlichen Gipfel. Das ausgeschüttete Glukokortikoid wiederum koppelt negativ zur Hypophyse und zum Hypothalamus zurück (HODGES 1984, LABRIE et al. 1984, CSERNUS & MESS 2003).
Glukokortikoide regulieren den Metabolismus von Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen. Sie stimulieren die Glukoneogenese der Leber, und im Fettmetabolismus bewirken Gluko- kortikoide eine Spaltung von Triglyzeriden (Lipolyse) zur Erhöhung des Fettsäurespiegels im Blut (EXTON 1979, FAIN 1979, DE MARTINO et al. 2004).
Unter Stressreaktionen kommt es zur vermehrten Ausschüttung von Glukokortikoiden und bei lange andauernden Stressphasen zur Habituation (HERMAN et al. 2003, HELM et al. 2004).
Des weiteren wirken Glukokortikoide antiinflammatorisch und immunsuppressiv. So hemmen sie das Enzym Phospholipase A2, welches aus Phospholipiden Arachidonsäure synthetisiert (BAILEY 1991). Sie senken die Anzahl der zirkulierenden eosinophilen und basophilen Granulozyten und Lymphozyten (OHTA & YAMASHITA 1999, MARONE et al. 2002, DRUILHE et al. 2003).
Außerdem wurde eine Interaktion von inflammatorischen Zytokinen mit dem Hypothalamus- Hypophysen-Nebennierenrinden-System gezeigt. So führen die Zytokine IL-1 und IL-2 zur vermehrten Freisetzung des CRH aus dem Hypothalamus, während im Gegenzug die Zytokinproduktion durch Glukokortikoide gehemmt wird (CAMBRONERO et al. 1992, GILL et al. 1998).
2.4.1 Das Enzym Arginase und Glukokortikoide
Verschiedentlich ist eine Beeinflussung der Arginase durch Glukokortikoide beschrieben worden. Sowohl in vivo in der Rattenleber (PATNAIK & PATNAIK 1989) als auch in vitro in Hepatozyten und hepatischen Zell-Linien der Ratte (HAGGERTY et al. 1982, GOTOH et al. 1997) lässt sich die Arginase-Expression durch die Stimulation mit Glukokortikoiden steigern.
In Alveolarmakrophagen wird durch die Gabe von Glukokortikoiden die basale Arginase- Enzymaktvität erniedrigt und die LPS-induzierte Zunahme der Arginaseaktivität unterdrückt (KLASEN et al. 2001). Bei Fibroblasten der Atemwege der Ratte bleibt zwar durch Glukokortikoidgabe die basale Enzymaktivität unverändert, allerdings zeigt sich auch hier eine Blockade des durch IL-13 und IL-4 induzierten Enzymanstiegs (LINDEMANN &
RACKÉ 2003). Bei der steroidvermittelten Regulation der Arginase handelt es sich offenbar um ein weit verbreitetes Phänomen. So induzieren Steroide das Enzym u.a. in humanen Magenkarzinom-Zell-Linien (WU et al. 1992), im Intestinaltrakt neonataler Ratten (KONARSKA et al. 1986) und in murinen Speicheldrüsen (AKIBA et al. 2002).
Verschiedene Arbeiten zeigten eine Beteiligung von Transkriptionsfaktoren der CCAAT/Enhancer Binding Protein Familie im Rahmen der Glukokortikoid-induzierten Arginase I-Expression in verschiedenen Gewebetypen (TAKIGUCHI & MORI 1991, GOTOH et al. 1997).
3 Geräte, Material und Methoden
3.1 Geräte
Absaugvorrichtung für Zellkulturen und Mikrobiologie
neoLab (29336), Heidelberg Accu-jet® Pipettierhilfe neoLab (32650), Heidelberg
Aqua tridest Aufbereitungsanlage Quantum EX(QTUM 000 EX), Millipore, Schwalbach
Autoklav Typ A5-70598 Webeco, Bad Schwartau
Biofuge fresco Heraeus Instruments, Hanau
Blotkammer - Trans Blot-49BR 1374 Bio-RAD, Hercules, USA
Centrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg
Cytospinzentrifuge „Cytospin® 2“ Shandon, Franfurt
Dampfsterilisator „Varioklav®“ Typ 300EC H+P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim Eismaschine Typ AF 20AS/B Scotsman, Milano
Eisschrank –80°C Heraeus, Hanau
Electrophorese Einheit –SE 600 Hoefer, US Patent 4,224,134
Electrophoresis Power Supply EPS 3500 Amersham Pharmacia Bio Tech, Freiburg ELISA Lesegerät Tecan Sunrise Tecan, Crailsheim
FACSScan Becton Dickinson, Heidelberg
FACSVantage SE Becton Dickinson, Heidelberg
Gene Quant II RNA/DNA-Calculator Pharmacia Biotech, Cambridge, England
Heizblöcke Eppendorf, Hamburg
HeraCell Begasungsfeuchtraumbrutschrank Heraeus Instruments, Hanau
Laborwaage L2200P Sartorius, Mannheim
Mikroskope DMIL Leica, Solms
Mikroskop DMLS Typ 020 518 500 Leica, Wetzlar
Neubauer Zählkammer Eppendorf, Hamburg
pH-Meter- Typ 766 Knick, Darmstadt
Photoentwicklungsmaschine-Typ: 9462/205 Agfa (CP 1000), Mortsel, Belgien Pipetten,
einstellbar von 100-1000ul, 20-200ul, 1-20ul Abimed, Langenfelden Reinluftsterilbank HeraSafe Heraeus Instruments, Hanau
Sepatech Megafuge 3.0R Heraeus Instruments, Hanau
Vortex-Genie 2 neoLab, Heidelberg (Wellesley, USA) 3.2 Material
3.2.1 Verbrauchsmaterialien 96 Well Polystyrol Microplatten, F-Boden,
transparent Greiner (655 101), Frickenhausen
Abdeckfolie für Mikrotiterplatten Greiner (676 001), Frickenhausen MACS® CD 14 Micro Beads Miltenyi Biotec (191-01),
Bergisch Gladbach
Filterkarten, weiss zur Cytospinzentrifuge Shandon(599 100 22), Frankfurt Filterpipettenspitzen 101-1000ul Starlab (51126 7810), Ahrensberg
HybondTM P Amersham Bioscience (Rpn 2020),
Little Chalfont, UK
HyperfilmTM Amersham Bioscience (RPN 3103k),
Little Chalfont, UK
MiniMACS® Starting Kit Miltenyi Biotec (130 090 312), Bergisch Gladbach
Multifly® Set Sarstedt (85.1638), Nümbrecht
Objektträger Langenbrinck, Emmendingen
Objektträger „Superfrost“ Shandon (6776207), Frankfurt Pasteur Kapillarpipetten, Grösse 150mm neoLab (E 1096), Heidelberg Pipetten, serologisch 25ml Greiner (760 180), Frickenhausen Pipettenspitzen 0,5-20ul Greiner (771 290), Frickenhausen Pipettenspitzen 100-1000ul Greiner (740 290), Frickenhausen Pipettenspitzen 10-200ul Greiner (739 290), Frickenhausen Polypropylen Röhrchen mit Schraubverschluss,
15ml, konische Bodenform
Greiner (188 261), Frickenhausen Polypropylen Röhrchen mit Schraubverschluss,
50ml, konische Bodenform
Greiner (227 261), Frickenhausen Reaktionsgefäß „Cryo-Tubes“ 1,5ml neoLab (74708), Heidelberg
Reaktionsgefäße 1,5ml Eppendorf (0030 120 086), Hamburg Röhrchen, 5ml für die Durchflusszytometrie Becton Dickinson (2008), Heidelberg S-Monovette®-EDTA Sarstedt (02.1066.001), Nümbrecht
Sterilfilter, 0,22um Porenweite Renner (06001), Darmstadt
Whatman-Papier Sartorius (2519460570), Göttingen Zellkultur Multiwell Platten,
12 Vertiefungen, steril Greiner (665 180), Frickenhausen 3.2.2 Reagenzien
α-Isonitrosopropiophenon Sigma (I3502), Steinheim Acrylamide-Bis Serva (10688), Darmstadt Ammoniumchlorid (NH4Cl) Merck (1142), Farnstadt
Ammoniumpersulfat Fluka - Sigma (09914), Steinheim
Aprotinin Sigma (A1153), Taufkirchen
Bovines Serum Albumin Serva (11930), Heidelberg Bromphenolblau Merck (46191), Farnstadt
Chloroform Baker (7386), Deventer, Holland ColorBurstTM Elektrophoresemarker Sigma (C 4105), Saint Louis, USA Dexamethason Sigma (D1756), Saint Louis, USA
Dextransulfat Amersham Pharmacia Biotech (17-0340-01), Uppsala, Schweden
Dimethyl-Sulfoxid Sigma (02140EB), St.Louis, USA Dithiothreitol Roche (70004021), Mannheim
ECLTM Reagent 1 Amersham Bioscience (RPN 2106V1), Little Chalfont, UK
ECLTM Reagent 2 Amersham Bioscience (RPN 2106V2), Little Chalfont, UK
EDTA Sigma (E5134), Taufkirchen
Entwickler, Reagens A Agfa (G153-A), Mortsel, Belgien Entwickler, Reagens B Agfa (G153-B), Mortsel, Belgien Ethanol absolut Riedel-de Häen (32205), Seelze Fetales Kälberserum Sigma (F7524), St. Louis, USA
FicoLite H® Linaris (1511YK),Wertheim-Bettingen
Fixierer Agfa (G354), Mortsel, Belgien
Forskolin Calbiochem (344 270), La Jolla, USA Giemsa-Lösung Fluka - Sigma (48900), Steinhein
Glycerol ICN Biomedicals (800688), Aurora, USA Glycin für die Molekularbiologie AppliChem (1067.1000), Darmstadt Harnstoff Fluka - Sigma (51459), Steinheim
Immersionsöl für Mikroskopie Merck (1046990100), Farmstadt Kaliumhydrogenkarbonat (KHCO3) Riedel-de Häen (12602), Seelze L-Arginin Hydrochlorid Sigma (A5131), Steinheim
Leupeptin Sigma (L2884), Taufkirchen
L-Glutamin Bio Whittaker (BE 17-605E), Verviers, Belgien Manganchlorid Fluka - Sigma (M3634), Steinheim
May-Grünwald Merck (1014240500), Darmstadt
Methanol Fluka - Sigma (65543), Seelze
Milchpulver Roth (T 145.2), Karlsruhe
N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Fluka - Sigma (87689), Steinheim Natriumazid J.T.Baker (9099), Gross-Gerau Natriumchlorid Roth (9265), Karlsruhe
ortho-Phosphorsäure 85%, p.a. neoLab (4990), Heidelberg PBS-Dubecco (1x) w/o Ca2+, Mg2+ Biochrom A(L1825), Berlin Penicillin-Streptomycin-Lösung Sigma (P0781), St.Louis, USA
PepstatinA Sigma (P5318), Taufkirchen
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma (P7626), Steinheim
Phenolrot Sigma (P5530), St.Louis, USA
Propidiumiodid Calbiochem (537059), Bad Soden Protein Assay, Reagent A Bio-RAD (500-0113), Hercules, USA Protein Assay, Reagent B Bio-RAD (500-0114), Hercules, USA Protein Assay, Reagent S Bio-RAD (500-0115), Hercules, USA
rHu IFN-γ PromoCell (C-60724), Heidelberg
rHu IL-4 PromoCell (C-61410), Heidelberg
rHu IL-8 PromoCell (C-61830), Heidelberg
rHu IL-10 PromoCell (C-62012), Heidelberg
rHu TNF-α PromoCell (C-63720), Heidelberg
RPMI 1640-Medium Sigma (R0883), Steinheim
Schwefelsäure 96%, p.a. Roth (9316.2), Karlsruhe Sodium dodecyl sulfate Sigma (L3771), Steinheim
Trifast® Peqlab (302020), Erlangen
Tris-HCl Fluka - Sigma (61952), Steinheim
Tris, Pufferan® Roth (48551), Karlsruhe Triton x-100 Sigma (T8532), Steinheim
Trypanblau Merck (143903), Darmstadt
Tween®20 Roth (91271), Karlsruhe
3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien Kaninchen-anti-Ratte-Arginase I
Hierbei handelt es sich um ein gegen Leber-Arginase der Ratte gewonnenes polyklonales Kaninchen-Antiserum, welches kreuzreaktiv gegen humane Leber-Arginase ist.
Der Antikörper wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. G. Soler, Universität der Extremadura, Cáceres, Spanien (DIEZ et al. 1994). Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:5000 in TBST (s.S. 38) unter Zugabe von 1% BSA eingesetzt.
MAP-Kinase: ERK 1/2 (Extracellular-regulated kinase)
Zur Kontrolle der Proteinbeladung beim Immunoblot wurde dieser Antikörper (Kaninchen, polyklonal) in einer Verdünnung von 1:3000 in TBST (s.S. 38) unter Zugabe von 1%BSA eingesetzt.
Sekundärantikörper
Als Sekundärantikörper beim Immunoblot wurde Ziege-anti-Kaninchen IgG HRP (Sc 2004, Santa Cruz 40174 251) in einer Verdünnung von 1:3000 in TBST (s.S. 38) hergestellt.
Monoklonale Antikörper
Die Hybridome, welche die monoklonalen Antikörper Bo1 (IgG 1κ) produzieren, wurden in der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover nach der Immunisierung von Mäusen mit bovinen lymphoblastoiden Zellen des Rindes (nach Transformation mit Theileria annulata) hergestellt (VON DER OSTEN 1990, REBESKI 1990). Der mAK Bo1 erkennt bovine MHC-Klasse I-Moleküle (SCHUBERTH et al. 1992).
Sekundärantikörper zur Herstellung von Referenzzellen
Als Sekundärantikörper dienten Ziege-anti-Maus IgG und IgM (schwere und leichte Ketten), affinitätschromatographisch gereinigte, polyklonale Antikörper, absorbiert gegen Human-, Rinder- und Pferdeserumproteine, konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat (Dianova, Hamburg, Nr.115-015-068, 1,5mg/ml). Die eingesetzte Verdünnung zur Herstellung von Referenzzellen war 1:40.
3.2.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen
Alle Medien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua bidest.
angesetzt.
Lösungen zur Aufreinigung des Blutes Dextransulfat-Lösung
3g Dextransulfat wurden in 100ml PBS gelöst.
Erythrozyten-Lyse-Puffer NH4Cl 155 mmol/l KHCO3 10 mmol/l EDTA 0,1 mmol/l
Der pH-Wert wurde auf 7,4 einstellt.
Zellkulturmedien und Zusätze Zellkultur-Vollmedium
RPMI-1640-Medium wurden 10%FCS zugefügt, das zuvor 30min bei 56°C inaktiviert wurde, sowie 100E/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin und 2mmol/l L-Glutamin.
Stammlösung von Interferon- γ (IFN-γ), Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 10 (IL-10)
Zur Herstellung einer Stammlösung wurde das jeweilige Zytokin in sterilem Wasser gelöst und auf eine Konzentration von 10µg/ml eingestellt. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine finale Konzentration von 20ng/ml verdünnt.
Stammlösung von Tumornekrosefaktor-α (ΤΝF−α)
Humanes rekombinantes TNF-α wurde zur Herstellung einer Stammlösung in sterilem Wasser gelöst und auf eine Konzentration von 10µg/ml verdünnt.
Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) zur Erstellung der finalen Konzentration 1:100 verdünnt.
Stammlösung von Interleukin-8 (IL-8)
Humanes rekombinantes IL-8 wurde mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 100µg/ml eingestellt. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine Konzentration von 50ng/ml eingestellt.
Stammlösung von Forskolin
Forskolin wurde in DMSO gelöst und eine Stammlösung von 10mmol/l hergestellt. Vor Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine Konzentration von 50µmol/l eingestellt.
Stammlösung von Dexamethason
Dexamethason wurde in Ethanol gelöst und eine Stammlösung von 2,5mmol/l hergestellt. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine finale Konzentration von 50 µmol/l eingestellt.
Lösungen zur Messung der Enzymaktivität der Arginase Triton-Lösung
1ml Triton X-100 wurde zur Herstellung einer 1%igen Triton-Lösung in 99 ml H2O gelöst.
Tris-HCl-Lösung
Zur Herstellung einer Tris-HCl-Lösung mit einer Konzentration von 50mmol/l wurden 3,03g Tris-Base/500ml in H2O gelöst und anschließend mit 5 mol/l HCL auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt.
Proteaseinhibitoren
PMSF: zur Herstellung einer Stocklösung von 100mmol/l wurde 17,4mg in 1 ml 100% Ethanol gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 1 mmol/l
Aprotinin: zur Herstellung einer 5000fachen (10mg/ml) Stocklösung wurde 50mg in 5 ml H2O gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 2 µg/ml
Leupeptin: zur Herstellung einer 1000fachen (1mg/ml) Stocklösung wurde 50mg in 50 ml H2O gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 1 µg/ml
Pepstatin A: zur Herstellung einer 1000fachen (1,5mg/ml) Stocklösung wurde 5mg in 3300 µl Methanol gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 1,5 µg/ml Die aliquoten Teile der Proteinaseinhibitoren (1 ml) wurden bei –20°C aufbewahrt.
Zell-Lyse-Puffer
Zur Herstellung des Zell-Lyse-Puffers wurde 1%ige Triton-Lösung (s.S. 36) mit Tris-HCl- Lösung (s.S. 36) in einem Verhältnis 1:1 gemischt. Danach erfolgte die Zugabe der Proteinaseinhibitoren in oben aufgeführter finaler Konzentration.
Manganchlorid-Lösung (MnCl2)
Zur Herstellung einer MnCl2-Lösung von 10mmol/l wurden 0,19 g MnCl2 in 100 ml H2O.gelöst.
L-Arginin-Lösung
Zur Herstellung einer L-Arginin-Lösung mit einer Konzentration von 0,5mol/l wurden 10,53g L-Arginin in 100ml H2O gelöst und dann mit 5 mol/l NaOH auf einen pH-Wert von 9,7 eingestellt.
Die Aufbewahrung der aliquoten Teile erfolgte bei –20°C.
Säuregemisch
Es wurden 320 ml H2O mit 135 ml Phosphorsäure (H3PO4, 85%) und 45 ml Schwefelsäure (H2SO4, 97%) gemischt und bei 4°C gelagert.
α-Isonitrosopropiophenon-Lösung
Zur Herstellung einer 6% ISPF-Lösung wurden 3g ISPF in 50ml 100% Ethanol gelöst.
Die Aufbewahrung erfolgte bei 4°C in Dunkelheit.
Harnstoff-Stock-Lösung
Zur Herstellung der Harnstoff-Stocklösung wurden 60 mg Harnstoff in 100 ml H2O gelöst.
Die Aufbewahrung der aliquoten Teile erfolgte bei –20°C.
Lösungen für die Elektrophorese und den Immunoblot SDS-Page Puffer (3fach)
Dithiothreitol 7mg/ml
EDTA 1mmol/l
Tris-HCl 10mmol/l
SDS 3%
Glycerol 13%
Bromphenolblau 0,007%
EDTA, Tris-HCl, SDS, Glycerol und Bromphenolblau wurden auf 37°C erwärmt, um die Produkte zu lösen. Danach erfolgte die Zugabe von Dithiothreitol.
Tris-Lösung I
Tris-Base 1,5mol/l
Der pH-Wert wurde mit HCl-Lösung (1 mol/l) auf pH 8,8 eingestellt.
Die Lösung wurde durch einen 0,45µm Filter filtriert.
Danach erfolgte Zugabe von 0,4% SDS.
Tris-Lösung II
Tris-Base 0,5mol/l
Der pH-Wert wurde mit HCl-Lösung (1mol/l) auf 6,8 eingestellt.
Die Lösung wurde durch einen 0,45µm Filter filtriert.
Danach erfolgte Zugabe von 0,4% SDS.
Trenngel
12% finale Acrylamidkonzentration
6ml 30% Acrylamide/0,8% Bisacrylamide 3,75ml Tris-Lösung I (s.S. 37)
5,25ml H2O
0,05ml 10% Ammoniumpersulfat
0,01ml N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Sammelgel
0,65ml 30% Acrylamide/0,8 % Bisacrylamide 1,25ml Tris-Lösung II (s.S. 38)
3,05ml H2O
0,025ml 10% Ammoniumpersulfat
0,005ml N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Puffer zur Elektrophorese (5fach)
Tris-Base 15,1g/l Glycin 72,0g/l SDS 5,0g/l TBS (5fach)
Tris-Base 50 mmol/l NaCl 250 mmol/l
Der pH-Wert wurde mit HCl-Lösung (12mol/l) auf 8,0 eingestellt.
TBST
1 l TBS (5fach) ad 5 l Wasser
Es wurden 0,5% Tween-20 zugegeben.
SDS-PAGE Blotting Puffer (5fach) Tris-Base 242,4 g/l Glycin 1152 g/l
SDS-PAGE Blotting Puffer (1fach) 800 ml 5x SDS-PAGE Blotting Puffer 10 ml 20% SDS
800 ml Methanol 2390 ml H2O Blocking-Puffer
Zur Herstellung einer 5%igen Magermilch-Blocking-Puffer-Lösung wurden 5g Magermilchpulver in 100 ml TBST (s.S. 38) gelöst.
Lösungen für die Durchflusszytometrie Stammlösung von Propidiumiodid-Lösung 25 µg/ml Propidiumiodid in PBS
Membranimmunfluoreszenzpuffer (MIF-Puffer)
Wasch- und Verdünnungspuffer für die Immunfluoreszenz
BSA 5g/l
NaN3 0,1g/l Gelöst in PBS
Lagerung bei 4°C
3.2.5 Humane Probanden Patienten
Bei den Patienten handelte es sich um Personen im Alter zwischen 21 und 65 (im Durchschnitt: 48) mit hämatologischen Krankheitsbildern, die im Zeitraum von Mai 2002 bis November 2003 in der Medizinischen Klinik und Poliklinik V der Universität Heidelberg allogen blutstammzelltransplantiert wurden.
Diese Patienten wurden vor Beginn der Studie schriftlich und mündlich über den Hintergrund der geplanten Analysen und die damit verbundenen Belastungen aufgeklärt. Ihre Zustimmung wurde durch Unterschrift auf der Einwilligungserklärung dokumentiert.
In ca. 14-tägigen Abständen wurde den Patienten im Rahmen von routinemäßigen Untersuchungen zusätzlich ca. 8ml EDTA-Blut abgenommen. Dies wurde bis maximal ein Jahr nach der allogenen Stammzelltransplantation durchgeführt.
Bei einer therapierefraktären Anämie mit einem Hb unter 7,5 g/dl wurde den Patienten kein zusätzliches Blut entnommen.
Die Blutabnahmen wurden im Rahmen einer von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Heidelberg befürworteten Studie gewonnen (#120/2002; Titel:
Verwendung von Restmaterial aus gewonnenen diagnostischen Darm-, Haut- und Knochenmarkbiopsien sowie Gewinnung zusätzlicher Blutproben bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation zur Evaluation der Zusammenhänge von Graft-versus- Host-Erkrankung (GvHD) und Immunrekonstitution).
Eine Übersicht der Patienten hinsichtlich Alter, Grunderkrankung, Konditionierung und Krankheitsverlauf befindet sich im Anhang.
Vorbereitung und Transplantation Indikationen zur allogenen Transplantation
Die Grunderkrankungen stellten bei den an dieser Studie teilnehmenden Patienten eine Indikation zur allogenen Blutstammzell-Transplantation mit einem familiären oder unverwandten Spender dar. Die Indikation zur Transplantation wurde nach ausführlicher Untersuchung, Restaging der Erkrankung und Einverständnis des Patienten gestellt.
Die genaue Vorgehensweise bei der Transplantationsvorbereitung ist dem Anhang zu entnehmen.
Medikamente zur Prophylaxe einer GvHD Cyclosporin A (CsA)
Das Oligopeptid Cyclosporin A hemmt die Calcineurin-Phosphatase und somit die Translokation des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of activated T cells) aus dem Zytosol in den Zellkern. Dieser Wirkmechanismus erklärt die selektive Suppression der Zytokinsekretion und Proliferation von T-Zellen.
Mycophenolatmofetil (MMF)
Mycophenolatmotefil hemmt die de-novo-Synthese von Guanosin-Nukleotiden durch Blockade des Enzyms Inosin Monophosphat Dehydrogenase. Da diese de-novo-Synthese für die Proliferation von T- und B-Lymphozyten unerlässlich ist, wirkt MMF stärker zytostatisch auf Lymphozyten als auf andere Zellen.
Prednison
Das Glukokortikoid Prednison (1,2-Dehydrocortison) hat eine antiinflammatorische und antiproliferative Wirkung auf verschiedene Zelltypen. Es supprimiert die zellvermittelte Immunität durch eine Reduktion der Zahl an Lymphozyten und eosinophilen Granulozyten.
Im Gegensatz hierzu wird die Zahl der Thrombozyten und neutrophilen Granulozyten erhöht.
Wie alle Glukokortikoide gelangt auch Prednison nach Bindung an einen zytoplasmatischen Steroidrezeptor in den Zellkern. Dort moduliert der Glukokortikoid-Rezeptorkomplex durch Bindung an regulatorische Gensequenzen die Transkription verschiedener Zytokine und Adhäsionsproteine, welche im Rahmen inflammatorischer Immunantworten exprimiert werden.
FK506
Wie Cyclosporin A ist auch FK506 ein Calcineurin-Inhibitor, der über eine Hemmung der NFAT-Translokation in den Zellkern eine Suppression der T-Zell-vermittelten Immunreaktionen bewirkt.
Methotrexat
Methotrexat wirkt immunsuppressiv durch seinen Antagonismus gegenüber Folsäure.
GvHD-Diagnostik
Zur Beurteilung der GvHD werden sowohl klinische Zeichen (Stuhlmenge und Stuhlfrequenz, Übelkeit, Veränderungen der Haut und Schleimhäute) als auch Laborwerte (Bilirubin) herangezogen. Man unterscheidet die akute von der chronischen GvHD. Die akute GvHD zeigt sich definitionsgemäß vor dem Tag+100, die chronische GvHD beginnt nach Tag+100.
Für die Unterscheidung ist jedoch der klinische Zustand aussagekräftiger als der genaue Zeitpunkt des Auftretens typischer Symptome.
Einteilung der akuten GvHD
Folgende Tabellen zeigen eine Übersicht über die Einteilung der akuten GvHD.
Tab. 1 Ausmaß der Organbeteiligung bei akuter GvHD
GRAD HAUT LEBER GIT
I makulopapulöses Erythem
< 25% der Körperoberfläche Bilirubin 2-3 mg/dl Diarrhoe 0,5 - 1 l/d, persistierende Nausea II makulopapulöses Exanthem
25-50% der Körperoberfläche Bilirubin 3-6 mg/dl Diarrhoe 1 - 1,5 l/d III makulopapulöses Exanthem
> 50% der Körperoberfläche Bilirubin 6-15 mg/dl Diarrhoe 1,5 - 2 l/d
IV
generalisierte Erythrodermie mit Blasenbildung und
Desquamation
Bilirubin > 15 mg/dl Diarrhoe > 2 l/d, Ileus
Bestimmung des Schweregrades einer akuten GvHD nach Glucksberg et al. 1974. Entscheidend sind Lokalisation, Ausmaß und Beteiligung der einzelnen Organsysteme. Abkürzungen: GIT = Gastrointestinaltrakt, Grad = klinischer Grad der Organbeteiligung
Tab. 2 Klinisches Gesamtstadium der akuten GvHD
GESAMTSTADIUM HAUT LEBER GIT
I (mild) I - II 0 0
II (moderat) I - III I I
III (schwer) II - III II - III II - III
IV (lebensbedrohlich) II - IV II - IV II - IV
Bestimmung des klinischen Gesamtstadiums einer akuten GvHD unter Berücksichtigung der Schwere des Befalls der einzelnen betroffenen Organe. GIT = Gastrointestinaltrakt
