3 Geräte, Material und Methoden
3.1 Geräte
Absaugvorrichtung für Zellkulturen und Mikrobiologie
neoLab (29336), Heidelberg Accu-jet® Pipettierhilfe neoLab (32650), Heidelberg
Aqua tridest Aufbereitungsanlage Quantum EX(QTUM 000 EX), Millipore, Schwalbach
Autoklav Typ A5-70598 Webeco, Bad Schwartau
Biofuge fresco Heraeus Instruments, Hanau
Blotkammer - Trans Blot-49BR 1374 Bio-RAD, Hercules, USA
Centrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg
Cytospinzentrifuge „Cytospin® 2“ Shandon, Franfurt
Dampfsterilisator „Varioklav®“ Typ 300EC H+P Labortechnik GmbH, Oberschleißheim Eismaschine Typ AF 20AS/B Scotsman, Milano
Eisschrank –80°C Heraeus, Hanau
Electrophorese Einheit –SE 600 Hoefer, US Patent 4,224,134
Electrophoresis Power Supply EPS 3500 Amersham Pharmacia Bio Tech, Freiburg ELISA Lesegerät Tecan Sunrise Tecan, Crailsheim
FACSScan Becton Dickinson, Heidelberg
FACSVantage SE Becton Dickinson, Heidelberg
Gene Quant II RNA/DNA-Calculator Pharmacia Biotech, Cambridge, England
Heizblöcke Eppendorf, Hamburg
HeraCell Begasungsfeuchtraumbrutschrank Heraeus Instruments, Hanau
Laborwaage L2200P Sartorius, Mannheim
Mikroskope DMIL Leica, Solms
Mikroskop DMLS Typ 020 518 500 Leica, Wetzlar
Neubauer Zählkammer Eppendorf, Hamburg
pH-Meter- Typ 766 Knick, Darmstadt
Photoentwicklungsmaschine-Typ: 9462/205 Agfa (CP 1000), Mortsel, Belgien Pipetten,
einstellbar von 100-1000ul, 20-200ul, 1-20ul Abimed, Langenfelden Reinluftsterilbank HeraSafe Heraeus Instruments, Hanau
Sepatech Megafuge 3.0R Heraeus Instruments, Hanau
Vortex-Genie 2 neoLab, Heidelberg (Wellesley, USA) 3.2 Material
3.2.1 Verbrauchsmaterialien 96 Well Polystyrol Microplatten, F-Boden,
transparent Greiner (655 101), Frickenhausen
Abdeckfolie für Mikrotiterplatten Greiner (676 001), Frickenhausen MACS® CD 14 Micro Beads Miltenyi Biotec (191-01),
Bergisch Gladbach
Filterkarten, weiss zur Cytospinzentrifuge Shandon(599 100 22), Frankfurt Filterpipettenspitzen 101-1000ul Starlab (51126 7810), Ahrensberg
HybondTM P Amersham Bioscience (Rpn 2020),
Little Chalfont, UK
HyperfilmTM Amersham Bioscience (RPN 3103k),
Little Chalfont, UK
MiniMACS® Starting Kit Miltenyi Biotec (130 090 312), Bergisch Gladbach
Multifly® Set Sarstedt (85.1638), Nümbrecht
Objektträger Langenbrinck, Emmendingen
Objektträger „Superfrost“ Shandon (6776207), Frankfurt Pasteur Kapillarpipetten, Grösse 150mm neoLab (E 1096), Heidelberg Pipetten, serologisch 25ml Greiner (760 180), Frickenhausen Pipettenspitzen 0,5-20ul Greiner (771 290), Frickenhausen Pipettenspitzen 100-1000ul Greiner (740 290), Frickenhausen Pipettenspitzen 10-200ul Greiner (739 290), Frickenhausen Polypropylen Röhrchen mit Schraubverschluss,
15ml, konische Bodenform
Greiner (188 261), Frickenhausen Polypropylen Röhrchen mit Schraubverschluss,
50ml, konische Bodenform
Greiner (227 261), Frickenhausen Reaktionsgefäß „Cryo-Tubes“ 1,5ml neoLab (74708), Heidelberg
Reaktionsgefäße 1,5ml Eppendorf (0030 120 086), Hamburg Röhrchen, 5ml für die Durchflusszytometrie Becton Dickinson (2008), Heidelberg S-Monovette®-EDTA Sarstedt (02.1066.001), Nümbrecht
Sterilfilter, 0,22um Porenweite Renner (06001), Darmstadt
Whatman-Papier Sartorius (2519460570), Göttingen Zellkultur Multiwell Platten,
12 Vertiefungen, steril Greiner (665 180), Frickenhausen 3.2.2 Reagenzien
α-Isonitrosopropiophenon Sigma (I3502), Steinheim Acrylamide-Bis Serva (10688), Darmstadt Ammoniumchlorid (NH4Cl) Merck (1142), Farnstadt
Ammoniumpersulfat Fluka - Sigma (09914), Steinheim
Aprotinin Sigma (A1153), Taufkirchen
Bovines Serum Albumin Serva (11930), Heidelberg Bromphenolblau Merck (46191), Farnstadt
Chloroform Baker (7386), Deventer, Holland ColorBurstTM Elektrophoresemarker Sigma (C 4105), Saint Louis, USA Dexamethason Sigma (D1756), Saint Louis, USA
Dextransulfat Amersham Pharmacia Biotech (17-0340-01), Uppsala, Schweden
Dimethyl-Sulfoxid Sigma (02140EB), St.Louis, USA Dithiothreitol Roche (70004021), Mannheim
ECLTM Reagent 1 Amersham Bioscience (RPN 2106V1), Little Chalfont, UK
ECLTM Reagent 2 Amersham Bioscience (RPN 2106V2), Little Chalfont, UK
EDTA Sigma (E5134), Taufkirchen
Entwickler, Reagens A Agfa (G153-A), Mortsel, Belgien Entwickler, Reagens B Agfa (G153-B), Mortsel, Belgien Ethanol absolut Riedel-de Häen (32205), Seelze Fetales Kälberserum Sigma (F7524), St. Louis, USA
FicoLite H® Linaris (1511YK),Wertheim-Bettingen
Fixierer Agfa (G354), Mortsel, Belgien
Forskolin Calbiochem (344 270), La Jolla, USA Giemsa-Lösung Fluka - Sigma (48900), Steinhein
Glycerol ICN Biomedicals (800688), Aurora, USA Glycin für die Molekularbiologie AppliChem (1067.1000), Darmstadt Harnstoff Fluka - Sigma (51459), Steinheim
Immersionsöl für Mikroskopie Merck (1046990100), Farmstadt Kaliumhydrogenkarbonat (KHCO3) Riedel-de Häen (12602), Seelze L-Arginin Hydrochlorid Sigma (A5131), Steinheim
Leupeptin Sigma (L2884), Taufkirchen
L-Glutamin Bio Whittaker (BE 17-605E), Verviers, Belgien Manganchlorid Fluka - Sigma (M3634), Steinheim
May-Grünwald Merck (1014240500), Darmstadt
Methanol Fluka - Sigma (65543), Seelze
Milchpulver Roth (T 145.2), Karlsruhe
N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Fluka - Sigma (87689), Steinheim Natriumazid J.T.Baker (9099), Gross-Gerau Natriumchlorid Roth (9265), Karlsruhe
ortho-Phosphorsäure 85%, p.a. neoLab (4990), Heidelberg PBS-Dubecco (1x) w/o Ca2+, Mg2+ Biochrom A(L1825), Berlin Penicillin-Streptomycin-Lösung Sigma (P0781), St.Louis, USA
PepstatinA Sigma (P5318), Taufkirchen
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma (P7626), Steinheim
Phenolrot Sigma (P5530), St.Louis, USA
Propidiumiodid Calbiochem (537059), Bad Soden Protein Assay, Reagent A Bio-RAD (500-0113), Hercules, USA Protein Assay, Reagent B Bio-RAD (500-0114), Hercules, USA Protein Assay, Reagent S Bio-RAD (500-0115), Hercules, USA
rHu IFN-γ PromoCell (C-60724), Heidelberg
rHu IL-4 PromoCell (C-61410), Heidelberg
rHu IL-8 PromoCell (C-61830), Heidelberg
rHu IL-10 PromoCell (C-62012), Heidelberg
rHu TNF-α PromoCell (C-63720), Heidelberg
RPMI 1640-Medium Sigma (R0883), Steinheim
Schwefelsäure 96%, p.a. Roth (9316.2), Karlsruhe Sodium dodecyl sulfate Sigma (L3771), Steinheim
Trifast® Peqlab (302020), Erlangen
Tris-HCl Fluka - Sigma (61952), Steinheim
Tris, Pufferan® Roth (48551), Karlsruhe Triton x-100 Sigma (T8532), Steinheim
Trypanblau Merck (143903), Darmstadt
Tween®20 Roth (91271), Karlsruhe
3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien Kaninchen-anti-Ratte-Arginase I
Hierbei handelt es sich um ein gegen Leber-Arginase der Ratte gewonnenes polyklonales Kaninchen-Antiserum, welches kreuzreaktiv gegen humane Leber-Arginase ist.
Der Antikörper wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. G. Soler, Universität der Extremadura, Cáceres, Spanien (DIEZ et al. 1994). Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:5000 in TBST (s.S. 38) unter Zugabe von 1% BSA eingesetzt.
MAP-Kinase: ERK 1/2 (Extracellular-regulated kinase)
Zur Kontrolle der Proteinbeladung beim Immunoblot wurde dieser Antikörper (Kaninchen, polyklonal) in einer Verdünnung von 1:3000 in TBST (s.S. 38) unter Zugabe von 1%BSA eingesetzt.
Sekundärantikörper
Als Sekundärantikörper beim Immunoblot wurde Ziege-anti-Kaninchen IgG HRP (Sc 2004, Santa Cruz 40174 251) in einer Verdünnung von 1:3000 in TBST (s.S. 38) hergestellt.
Monoklonale Antikörper
Die Hybridome, welche die monoklonalen Antikörper Bo1 (IgG 1κ) produzieren, wurden in der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover nach der Immunisierung von Mäusen mit bovinen lymphoblastoiden Zellen des Rindes (nach Transformation mit Theileria annulata) hergestellt (VON DER OSTEN 1990, REBESKI 1990). Der mAK Bo1 erkennt bovine MHC-Klasse I-Moleküle (SCHUBERTH et al. 1992).
Sekundärantikörper zur Herstellung von Referenzzellen
Als Sekundärantikörper dienten Ziege-anti-Maus IgG und IgM (schwere und leichte Ketten), affinitätschromatographisch gereinigte, polyklonale Antikörper, absorbiert gegen Human-, Rinder- und Pferdeserumproteine, konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat (Dianova, Hamburg, Nr.115-015-068, 1,5mg/ml). Die eingesetzte Verdünnung zur Herstellung von Referenzzellen war 1:40.
3.2.4 Kulturmedien, Puffer und Lösungen
Alle Medien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua bidest.
angesetzt.
Lösungen zur Aufreinigung des Blutes Dextransulfat-Lösung
3g Dextransulfat wurden in 100ml PBS gelöst.
Erythrozyten-Lyse-Puffer NH4Cl 155 mmol/l KHCO3 10 mmol/l EDTA 0,1 mmol/l
Der pH-Wert wurde auf 7,4 einstellt.
Zellkulturmedien und Zusätze Zellkultur-Vollmedium
RPMI-1640-Medium wurden 10%FCS zugefügt, das zuvor 30min bei 56°C inaktiviert wurde, sowie 100E/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin und 2mmol/l L-Glutamin.
Stammlösung von Interferon- γ (IFN-γ), Interleukin 4 (IL-4), Interleukin 10 (IL-10)
Zur Herstellung einer Stammlösung wurde das jeweilige Zytokin in sterilem Wasser gelöst und auf eine Konzentration von 10µg/ml eingestellt. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine finale Konzentration von 20ng/ml verdünnt.
Stammlösung von Tumornekrosefaktor-α (ΤΝF−α)
Humanes rekombinantes TNF-α wurde zur Herstellung einer Stammlösung in sterilem Wasser gelöst und auf eine Konzentration von 10µg/ml verdünnt.
Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) zur Erstellung der finalen Konzentration 1:100 verdünnt.
Stammlösung von Interleukin-8 (IL-8)
Humanes rekombinantes IL-8 wurde mit sterilem Wasser auf eine Konzentration von 100µg/ml eingestellt. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine Konzentration von 50ng/ml eingestellt.
Stammlösung von Forskolin
Forskolin wurde in DMSO gelöst und eine Stammlösung von 10mmol/l hergestellt. Vor Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine Konzentration von 50µmol/l eingestellt.
Stammlösung von Dexamethason
Dexamethason wurde in Ethanol gelöst und eine Stammlösung von 2,5mmol/l hergestellt. Vor dem Einsatz in der Zellkultur wurde es mit Zellkultur-Vollmedium (s.S. 35) auf eine finale Konzentration von 50 µmol/l eingestellt.
Lösungen zur Messung der Enzymaktivität der Arginase Triton-Lösung
1ml Triton X-100 wurde zur Herstellung einer 1%igen Triton-Lösung in 99 ml H2O gelöst.
Tris-HCl-Lösung
Zur Herstellung einer Tris-HCl-Lösung mit einer Konzentration von 50mmol/l wurden 3,03g Tris-Base/500ml in H2O gelöst und anschließend mit 5 mol/l HCL auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt.
Proteaseinhibitoren
PMSF: zur Herstellung einer Stocklösung von 100mmol/l wurde 17,4mg in 1 ml 100% Ethanol gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 1 mmol/l
Aprotinin: zur Herstellung einer 5000fachen (10mg/ml) Stocklösung wurde 50mg in 5 ml H2O gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 2 µg/ml
Leupeptin: zur Herstellung einer 1000fachen (1mg/ml) Stocklösung wurde 50mg in 50 ml H2O gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 1 µg/ml
Pepstatin A: zur Herstellung einer 1000fachen (1,5mg/ml) Stocklösung wurde 5mg in 3300 µl Methanol gelöst, eingesetzte finale Konzentration: 1,5 µg/ml Die aliquoten Teile der Proteinaseinhibitoren (1 ml) wurden bei –20°C aufbewahrt.
Zell-Lyse-Puffer
Zur Herstellung des Zell-Lyse-Puffers wurde 1%ige Triton-Lösung (s.S. 36) mit Tris-HCl-Lösung (s.S. 36) in einem Verhältnis 1:1 gemischt. Danach erfolgte die Zugabe der Proteinaseinhibitoren in oben aufgeführter finaler Konzentration.
Manganchlorid-Lösung (MnCl2)
Zur Herstellung einer MnCl2-Lösung von 10mmol/l wurden 0,19 g MnCl2 in 100 ml H2O.gelöst.
L-Arginin-Lösung
Zur Herstellung einer L-Arginin-Lösung mit einer Konzentration von 0,5mol/l wurden 10,53g L-Arginin in 100ml H2O gelöst und dann mit 5 mol/l NaOH auf einen pH-Wert von 9,7 eingestellt.
Die Aufbewahrung der aliquoten Teile erfolgte bei –20°C.
Säuregemisch
Es wurden 320 ml H2O mit 135 ml Phosphorsäure (H3PO4, 85%) und 45 ml Schwefelsäure (H2SO4, 97%) gemischt und bei 4°C gelagert.
α-Isonitrosopropiophenon-Lösung
Zur Herstellung einer 6% ISPF-Lösung wurden 3g ISPF in 50ml 100% Ethanol gelöst.
Die Aufbewahrung erfolgte bei 4°C in Dunkelheit.
Harnstoff-Stock-Lösung
Zur Herstellung der Harnstoff-Stocklösung wurden 60 mg Harnstoff in 100 ml H2O gelöst.
Die Aufbewahrung der aliquoten Teile erfolgte bei –20°C.
Lösungen für die Elektrophorese und den Immunoblot SDS-Page Puffer (3fach)
Dithiothreitol 7mg/ml
EDTA 1mmol/l
Tris-HCl 10mmol/l
SDS 3%
Glycerol 13%
Bromphenolblau 0,007%
EDTA, Tris-HCl, SDS, Glycerol und Bromphenolblau wurden auf 37°C erwärmt, um die Produkte zu lösen. Danach erfolgte die Zugabe von Dithiothreitol.
Tris-Lösung I
Tris-Base 1,5mol/l
Der pH-Wert wurde mit HCl-Lösung (1 mol/l) auf pH 8,8 eingestellt.
Die Lösung wurde durch einen 0,45µm Filter filtriert.
Danach erfolgte Zugabe von 0,4% SDS.
Tris-Lösung II
Tris-Base 0,5mol/l
Der pH-Wert wurde mit HCl-Lösung (1mol/l) auf 6,8 eingestellt.
Die Lösung wurde durch einen 0,45µm Filter filtriert.
Danach erfolgte Zugabe von 0,4% SDS.
Trenngel
12% finale Acrylamidkonzentration
6ml 30% Acrylamide/0,8% Bisacrylamide 3,75ml Tris-Lösung I (s.S. 37)
5,25ml H2O
0,05ml 10% Ammoniumpersulfat
0,01ml N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Sammelgel
0,65ml 30% Acrylamide/0,8 % Bisacrylamide 1,25ml Tris-Lösung II (s.S. 38)
3,05ml H2O
0,025ml 10% Ammoniumpersulfat
0,005ml N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Puffer zur Elektrophorese (5fach)
Tris-Base 15,1g/l Glycin 72,0g/l SDS 5,0g/l TBS (5fach)
Tris-Base 50 mmol/l NaCl 250 mmol/l
Der pH-Wert wurde mit HCl-Lösung (12mol/l) auf 8,0 eingestellt.
TBST
1 l TBS (5fach) ad 5 l Wasser
Es wurden 0,5% Tween-20 zugegeben.
SDS-PAGE Blotting Puffer (5fach) Tris-Base 242,4 g/l Glycin 1152 g/l
SDS-PAGE Blotting Puffer (1fach) 800 ml 5x SDS-PAGE Blotting Puffer 10 ml 20% SDS
800 ml Methanol 2390 ml H2O Blocking-Puffer
Zur Herstellung einer 5%igen Magermilch-Blocking-Puffer-Lösung wurden 5g Magermilchpulver in 100 ml TBST (s.S. 38) gelöst.
Lösungen für die Durchflusszytometrie Stammlösung von Propidiumiodid-Lösung 25 µg/ml Propidiumiodid in PBS
Membranimmunfluoreszenzpuffer (MIF-Puffer)
Wasch- und Verdünnungspuffer für die Immunfluoreszenz
BSA 5g/l
NaN3 0,1g/l Gelöst in PBS
Lagerung bei 4°C
3.2.5 Humane Probanden Patienten
Bei den Patienten handelte es sich um Personen im Alter zwischen 21 und 65 (im Durchschnitt: 48) mit hämatologischen Krankheitsbildern, die im Zeitraum von Mai 2002 bis November 2003 in der Medizinischen Klinik und Poliklinik V der Universität Heidelberg allogen blutstammzelltransplantiert wurden.
Diese Patienten wurden vor Beginn der Studie schriftlich und mündlich über den Hintergrund der geplanten Analysen und die damit verbundenen Belastungen aufgeklärt. Ihre Zustimmung wurde durch Unterschrift auf der Einwilligungserklärung dokumentiert.
In ca. 14-tägigen Abständen wurde den Patienten im Rahmen von routinemäßigen Untersuchungen zusätzlich ca. 8ml EDTA-Blut abgenommen. Dies wurde bis maximal ein Jahr nach der allogenen Stammzelltransplantation durchgeführt.
Bei einer therapierefraktären Anämie mit einem Hb unter 7,5 g/dl wurde den Patienten kein zusätzliches Blut entnommen.
Die Blutabnahmen wurden im Rahmen einer von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Heidelberg befürworteten Studie gewonnen (#120/2002; Titel:
Verwendung von Restmaterial aus gewonnenen diagnostischen Darm-, Haut- und Knochenmarkbiopsien sowie Gewinnung zusätzlicher Blutproben bei Patienten nach allogener Stammzelltransplantation zur Evaluation der Zusammenhänge von Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD) und Immunrekonstitution).
Eine Übersicht der Patienten hinsichtlich Alter, Grunderkrankung, Konditionierung und Krankheitsverlauf befindet sich im Anhang.
Vorbereitung und Transplantation Indikationen zur allogenen Transplantation
Die Grunderkrankungen stellten bei den an dieser Studie teilnehmenden Patienten eine Indikation zur allogenen Blutstammzell-Transplantation mit einem familiären oder unverwandten Spender dar. Die Indikation zur Transplantation wurde nach ausführlicher Untersuchung, Restaging der Erkrankung und Einverständnis des Patienten gestellt.
Die genaue Vorgehensweise bei der Transplantationsvorbereitung ist dem Anhang zu entnehmen.
Medikamente zur Prophylaxe einer GvHD Cyclosporin A (CsA)
Das Oligopeptid Cyclosporin A hemmt die Calcineurin-Phosphatase und somit die Translokation des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of activated T cells) aus dem Zytosol in den Zellkern. Dieser Wirkmechanismus erklärt die selektive Suppression der Zytokinsekretion und Proliferation von T-Zellen.
Mycophenolatmofetil (MMF)
Mycophenolatmotefil hemmt die de-novo-Synthese von Guanosin-Nukleotiden durch Blockade des Enzyms Inosin Monophosphat Dehydrogenase. Da diese de-novo-Synthese für die Proliferation von T- und B-Lymphozyten unerlässlich ist, wirkt MMF stärker zytostatisch auf Lymphozyten als auf andere Zellen.
Prednison
Das Glukokortikoid Prednison (1,2-Dehydrocortison) hat eine antiinflammatorische und antiproliferative Wirkung auf verschiedene Zelltypen. Es supprimiert die zellvermittelte Immunität durch eine Reduktion der Zahl an Lymphozyten und eosinophilen Granulozyten.
Im Gegensatz hierzu wird die Zahl der Thrombozyten und neutrophilen Granulozyten erhöht.
Wie alle Glukokortikoide gelangt auch Prednison nach Bindung an einen zytoplasmatischen Steroidrezeptor in den Zellkern. Dort moduliert der Glukokortikoid-Rezeptorkomplex durch Bindung an regulatorische Gensequenzen die Transkription verschiedener Zytokine und Adhäsionsproteine, welche im Rahmen inflammatorischer Immunantworten exprimiert werden.
FK506
Wie Cyclosporin A ist auch FK506 ein Calcineurin-Inhibitor, der über eine Hemmung der NFAT-Translokation in den Zellkern eine Suppression der T-Zell-vermittelten Immunreaktionen bewirkt.
Methotrexat
Methotrexat wirkt immunsuppressiv durch seinen Antagonismus gegenüber Folsäure.
GvHD-Diagnostik
Zur Beurteilung der GvHD werden sowohl klinische Zeichen (Stuhlmenge und Stuhlfrequenz, Übelkeit, Veränderungen der Haut und Schleimhäute) als auch Laborwerte (Bilirubin) herangezogen. Man unterscheidet die akute von der chronischen GvHD. Die akute GvHD zeigt sich definitionsgemäß vor dem Tag+100, die chronische GvHD beginnt nach Tag+100.
Für die Unterscheidung ist jedoch der klinische Zustand aussagekräftiger als der genaue Zeitpunkt des Auftretens typischer Symptome.
Einteilung der akuten GvHD
Folgende Tabellen zeigen eine Übersicht über die Einteilung der akuten GvHD.
Tab. 1 Ausmaß der Organbeteiligung bei akuter GvHD
GRAD HAUT LEBER GIT
I makulopapulöses Erythem
< 25% der Körperoberfläche Bilirubin 2-3 mg/dl Diarrhoe 0,5 - 1 l/d, persistierende Nausea II makulopapulöses Exanthem
25-50% der Körperoberfläche Bilirubin 3-6 mg/dl Diarrhoe 1 - 1,5 l/d III makulopapulöses Exanthem
> 50% der Körperoberfläche Bilirubin 6-15 mg/dl Diarrhoe 1,5 - 2 l/d
IV
generalisierte Erythrodermie mit Blasenbildung und
Desquamation
Bilirubin > 15 mg/dl Diarrhoe > 2 l/d, Ileus
Bestimmung des Schweregrades einer akuten GvHD nach Glucksberg et al. 1974. Entscheidend sind Lokalisation, Ausmaß und Beteiligung der einzelnen Organsysteme. Abkürzungen: GIT = Gastrointestinaltrakt, Grad = klinischer Grad der Organbeteiligung
Tab. 2 Klinisches Gesamtstadium der akuten GvHD
GESAMTSTADIUM HAUT LEBER GIT
I (mild) I - II 0 0
II (moderat) I - III I I
III (schwer) II - III II - III II - III
IV (lebensbedrohlich) II - IV II - IV II - IV
Bestimmung des klinischen Gesamtstadiums einer akuten GvHD unter Berücksichtigung der Schwere des Befalls der einzelnen betroffenen Organe. GIT = Gastrointestinaltrakt
Einteilung der chronischen GvHD
Folgende Tabelle zeigt eine Übersicht über die Einteilung der chronischen GvHD.
Tab. 3 Einteilung der chronischen GvHD
GVHD-STADIUM BESCHREIBUNG DES STADIUMS
"subclinical" histologisch positiver Befund ohne klinische Symptome
"limited disease" lokale Hautbeteiligung und/oder Leberbeteiligung
"extensive disease" generalisierte Hautbeteiligung oder
lokale Hautbeteiligung und/oder Leberbeteiligung plus
histol. Nachweis mit Zeichen einer chronisch aggressiven Hepatitis, Bindegewebsbrücken, Nekrosen oder Zirrhosezeichen in der Leber
oder
Augenbeteiligung (Schirmertest < 5mm) oder
histologisch gesicherte Beteiligung der kleinen Speicheldrüsen oder der Mundschleimhaut
oder
andere viszerale Beteiligungen (z.B. Lunge oder Niere)
Einteilung der chronischen GvHD nach RATANATHARATHORN et al. 2001 und SHULMAN et al.
1980. Hierbei wird die cGvHD nach dem Ausmaß der Organbeteiligung in drei Stadien eingeteilt.
Kontrollprobanden
a) Zur Kontrolle der Enzymaktivität der Arginase im Verlauf standen 7 klinisch gesunde Personen zwischen 25 und 50 Jahren zur Verfügung, denen im Abstand von ca. 4 Wochen 2 bis 6 mal Vollblut entnommen wurde.
b) Für die Gewinnung von humanem Blut für die Zellkultivierung in vitro (s. 3.3.7) standen freiwillige klinisch gesunde männliche und weibliche Personen (Alter zwischen 20-50) zur Verfügung.
3.3 Methoden
Das durch Punktion der in der Armbeuge gelegenen Venen gewonnene Blut wurde in sterile EDTA-enthaltende Blutentnahmeröhrchen überführt.
3.3.1 Gewinnung der Leukozyten
Es wurde 1ml des Vollblutes entnommen. Die Erythrozyten wurden mittels hypotoner Lyse entfernt, indem zu dem EDTA-Blut 10ml kalter Erythrozyten-Lyse-Puffer (s.S. 35) zugegeben wurde.
Nach gutem Mischen erfolgte eine 15minütige Inkubation auf Eis. Im Anschluss wurden die Zellen bei 260xg, 4°C für 8min zentrifugiert. Zur vollständigen Entfernung der Erythrozyten wurde der kalte Erythrozyten-Lyse-Puffer (s.S. 35) erneut für 15min zugesetzt.
3.3.2 Separation mittels Ficoll
Die bis zu 8 ml Vollblut wurden mit dem Nährmedium RPMI-1640 auf ein Gesamtvolumen von 25 ml verdünnt, über eine Schicht aus 15ml Ficoll pipettiert und 20min bei Raumtemperatur und 700xg zentrifugiert. Auf Grund der spezifischen Dichte der mononukleären Zellen sammeln sich diese zusammen mit den Thrombozyten, als sogenannte Interphase, zwischen Plasma und Ficoll, während Erythrozyten und Granulozyten sich als Pellet (Bodensatz) am Röhrchenboden absetzen.
Gewinnung der mononukleären Zellen aus der Ficoll-Separation
Der Interphasering des Ficollgradienten wurde vorsichtig abgenommen, erneut mit RPMI-1640 auf ein Gesamtvolumen von 40 ml aufgefüllt und 10 Minuten bei 4°C und 400xg zentrifugiert. Um die kontaminierenden Erythrozyten vollständig zu entfernen, wurde das Zellpellet nach Zentrifugation zur hypotonen Lyse in 20ml kalten Erythrozyten-Lyse-Puffer (s.S. 35) resuspendiert und für 15min auf Eis inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren erfolgte erneut ein Waschschritt in PBS (ohne Ca2+, und Mg2+). Ein Aliquot der Zellsuspension wurde nun mit Trypanblau gemischt, auf Vitalität geprüft und gezählt. Die durchschnittliche Vitalität lag bei 90%. Jeweils 5x106 vitale Zellen wurden in ein Röhrchen überführt, zur RNA-Extraktion in 500µl TriFast gelöst bzw. als Zellpellet bei -80°C eingefroren.
Gewinnung der Granulozyten nach der Separation über Ficoll
Das im Rahmen der Ficoll-Separation sich bildende Zellpellet setzt sich aus Granuloyten und Erythrozyten zusammen. Das Zellpellet wurde mit PBS (ohne Ca2+und Mg2+) resusupendiert und 1:1 mit 3% Dextransulfat-Lösung (s.S. 35) gemischt. Nach 20minütiger Sedimentation der Erythrozyten bei Raumtemperatur wurde die obere Phase abgenommen, bei 4°C 8min mit 260xg zentrifugiert und anschließend der Überstand entfernt. Um die noch verbleibenden Erythrozyten aus dem Pellet zu entfernen wurde es in 20ml kaltem Erythrozyten-Lyse-Puffer (s.S. 35) resuspendiert und für 15min auf Eis inkubiert. Nach dem Zentrifugieren (260xg, 4°C, 8min) erfolgte ein Waschschritt in PBS und dann bei Bedarf eine erneute 15minütige Erythrozytenlyse auf Eis. Nach Vitalitätsprüfung (durchschnittliche Vitalität: 85%) und Quantizifierung mit Trypanblau wurden jeweils 5x106 vitale Zellen in ein Röhrchen überführt, zur RNA-Extraktion in 500µl TriFast gelöst bzw. als Zellpellet bei -80°C eingefroren.
Gewinnung der Erythrozyten
Nach der 20minütigen Sedimentationsphase mit 3% Dextran in PBS (s.S. 35) blieb am Röhrchenboden ein Erythrozytenpellet zurück, das bei 4°C 8min mit 260xg abzentrifugiert wurde. Nach Entfernung des Überstands wurde das Zellpellet aliquotiert und bei –80°C weggefroren.
3.3.3 Vitalitätsbestimmung von Zellen Mikroskopie nach Trypanblaufärbung
Ein Aliquot der jeweiligen Zellsuspension wurde 1:1 mit Trypanblau-Lösung gemischt und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt.
Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, dessen Anion an Zellproteine bindet. Das Trypanblau dringt durch defekte Zellmembranen toter Zellen in das Zytosol und färbt diese Zellen tiefblau, während intakte Zellen gut an einer Doppelbrechung im Phasenkontrast zu erkennen sind.
Mikroskopie nach May-Grünwald-Färbung
Der Zellpopulation in PBS wurden 100 000 Zellen entnommen und in der Cytospin-Zentrifuge bei 100xg 5 min auf den Objektträger zentrifugiert.
Nach Trocknung der Objektträger wurden sie mit 0,8ml einer 1% May-Grünwald-Lösung überschichtet.
Nach drei Minuten wurde vorsichtig 1,6ml H2O hinzugefügt und weitere 90 sec inkubiert.
Danach wurde der Objektträger kurz mit Wasser abgewaschen und für weitere 15min mit einer 1:10 verdünnten Giemsa-Lösung überschichtet.
Der Objektträger wurde schließlich gründlich mit Wasser gereinigt und an der Luft getrocknet.
Am Ölimmersionsmikroskop konnten nun die Zellen hinsichtlich Reinheit, Vitalität und Morphologie beurteilt werden.
Durchflusszytometrische Beurteilung von Zellen
Die Vitalität und Reinheit der separierten Zellen wurden am Durchflusszytometer (FSC, SSC und Propidiumiodid) kontrolliert. Der Anteil propidiumiodidnegativer und damit lebender Zellen lag immer bei über 80%. Der Anteil von PMN an der separierten Zellpopulation betrug immer mehr als 95%.
3.3.4 Durchflusszytometrie
Mit dem Durchflusszytometer erfolgt die zuverlässige und schnelle Charakterisierung von
Mit dem Durchflusszytometer erfolgt die zuverlässige und schnelle Charakterisierung von