Durchflusszytometrie

Mit dem Durchflusszytometer erfolgt die zuverlässige und schnelle Charakterisierung von Zellen aufgrund ihrer Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften. Die Zellen aus einer Suspension werden hierbei über ein Probenführsystem vereinzelt und kreuzen dann hintereinander einen Laserstrahl.

Die Größe der Zelle sowie die Struktur der Zellmembran und des Zellinnern beeinflusst die Interaktion des Laserstrahles (hier Argonlaser) mit der Zelle. Als Vorwärtsstreulicht, Forward Scatter (FSC), bezeichnet man die Beugung des Lichts bei einer in Richtung des einfallenden Strahls, als Seitwärtsstreulicht, Side Scatter (SSC), das im rechten Winkel zum Strahlengang gestreute Licht, wobei das Ausmaß der Streuung beim Vorwärtsstreulicht abhängig von der Größe des Partikels, beim Seitwärtsstreulicht von seiner Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) ist.

Außerdem registriert das Gerät Fluoreszenzlichtemissionen jedes Partikels in drei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen: die Grünlichtfluoreszenz FL-1 in einer Wellenlänge von 515-545 nm, die Orangefluoreszenz FL-2 in einer Wellenlänge von 564-606nm und die Rotlichtfluoreszenz FL-3 in einer Wellenlänge von > 650nm.

Jeder Partikel, der den Laserstrahl passiert, liefert somit bei einer bestimmten Geräteeinstellung entsprechend seiner optischen Eigenschaften ein Datenmuster, das ihn als Messereignis definiert. Über die Software (CellQuest Pro®) der zum Gerät gehörende

Computereinheit wird nun eine gezielte Auswertung der Messung mit Hilfe einer Zweiparameterdarstellung ermöglicht.

Quantifizierung der Zahl an vitalen Zellen mittels Durchflusszytometrie (Referenzzellmethode)

Bei der Zellkultivierung in vitro (s. 3.3.7) sterben im Laufe der Inkubation aufgrund der Kulturbedingungen oder der stimulierenden Zytokine ein Teil der Zellen ab und somit sind in der Zellkultur eine unbekannte Anzahl vitaler Zellen vorhanden. Um diesen Teil zu bestimmen, werden der Zellprobe eine bestimmte Anzahl anderer Partikel (Referenzzellen) zugesetzt, die mit den gleichen Geräteinstellungen erfasst werden können, aber sich in einem zu messenden Parameter von den Kulturzellen unterscheiden.

Der absolute Gehalt vitaler Zellen kann nun berechnet werden, in dem man die Zahl der gemessenen, als Referenzzellen identifizierten, mit denen als vitale Zellen identifizierten Zellen ins Verhältnis setzt.

Als Referenzzellen zur Bestimmung der Zahl vitaler Zellen dienten bovine mononukleäre Zellen des Blutes. Sie wurden mit einem monoklonalen Antikörper gegen bovine MHC-Klasse-I-Moleküle markiert und indirekt mit einem fluorochromgekoppelten Ziege-anti-Maus-Antikörper gefärbt, weswegen sie von den unmarkierten Zellen der Probe im Durchflusszytometer zu unterscheiden waren.

Herstellung der Referenzzellen

Zur Herstellung der Referenzzellen erfolgte zuerst die Isolierung von bovinen mononukleären Zellen aus Vollblut. Hierzu wurde das Vollblut 1:2 mit PBS verdünnt, über eine Schicht aus 15 ml Ficoll pipettiert und 30 min bei 1380xg, 10°C zentrifugiert. Aufgrund der spezifischen Dichte sammeln sich die mononukleären Zellen und einige Thrombozyten in einer Interphase zwischen Plasma und Ficoll, die nun vorsichtig abgesaugt wurde. In ein mit 10ml PBS gefülltes Röhrchen wurde nun die Interphase überführt und durch dreimaliges Zentrifugieren (jeweils 15 min bei 430xg, 220xg, 80xg, RT) und Resuspendieren in PBS die mononukleären Zellen von den spezifisch leichteren Thrombozyten gereinigt. Nun wurden 2x10⁷ der frisch separierten bovinen mononukleären Zellen des Blutes in einem 15ml Röhrchen 5min bei 80xg und 4°C abzentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstands wurde das Zellpellet in 100µl PBS resuspendiert und nach Zugabe von 100µl des unverdünnten mAk BoI für 15min bei 4°C inkubiert.

Danach erfolgte ein Waschschritt in 5ml MIF-Puffer (s.S. 39) (80xg, 4°C, 7min). Das Zellpellet wurde nun für 20 Minuten bei 4°C lichtgeschützt mit 100ul FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus Antikörper, der 1:40 in MIF-Puffer (s.S. 39) verdünnt wurde, inkubiert.

In 5ml PBS wurden die Zellen anschließend erneut gewaschen, dann in ein 50ml-Rörchen überführt, das auf 50ml mit PBS aufgefüllt wurde und 15min bei 80xg und 4°C abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde nun in 30ml einer 4%-igen Paraformaldehydlösung resuspendiert und 24h bei 4°C lichtgeschützt inkubiert. Nach 15minütiger Zentrifugation bei Raumtemperatur und einem erneuten Waschschritt in PBS, erfolgt die Aufnahme des Zellpellets in einer PI-haltigen Trägerflüssigkeit in einer Konzentration von 4x10⁵ /ml. Vor dem Einsatz der Referenzzellen wurde die Konzentration kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert.

Vorbereitung der Proben für die Messung

Die Mikrotiterplatte wurde nach Beendigung der Inkubation mikroskopisch auf Vitalität und bakterielle Kontamination kontrolliert.

Danach wurde die Platte 15 Minuten auf Eis gestellt, um adhärente Zellen abzulösen, nachfolgend der Inhalt jeder Vertiefung gut durchmischt und 100µl zur Messung in ein Röhrchen zur Durchflusszytometrie überführt. Nach Zugabe von 100µl der Referenzzellsuspension und 16µl Propidiumiodidstammlösung (s.S. 39) (Endkonzentration 2µg/ml) erfolgte die Messung am Durchflusszytometer.

Ermittlung der Zahl vitaler Zellen

Es wurden je Probe 2000 Messereignisse erfasst. Da die Referenzzellen nach ihrer Fixierung weitgehend ihre Morphologie behielten, wiesen sie im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht die gleichen Charakteristika auf wie frisch separierte vitale humane mononukleäre Zellen. Durch verschiedene Darstellung derselben Messung einer Mischung aus Referenzzellen und Kulturzellen gelang es, die einzelnen Zellpopulationen durch Setzen von Fenstern (gates) zu identifizieren und die jeweilige Zahl der Messereignisse (events, E) zu registrieren.

Aus folgender Formel ergibt sich die Zahl vitaler Kulturzellen, da die eingesetzte Anzahl an Referenzzellen bekannt war:

ref ref vit

vit

E

A A = E ×

A vit : Anzahl vitaler Kulturzellen

Evit: Messereignis vitaler Messereignisse Aref: Anzahl eingesetzter Referenzzellen E ref: Messereignisse für Referenzzellen 3.3.5 Zellsortierung

Die Zellsortierung der aufgereinigten Granulozyten und PBMC erfolgte mit dem Gerät FACSVantageSE® der Firma Becton Dickinson und wurde von Herrn Manuel Scheuermann, Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, anhand der charakteristischen Streulichteigenschaften im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht unter Zugabe von Propidiumiodid-Stammlösung in einer Endkonzentration von 2µg/ml durchgeführt.