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5.3 Proliferation und Apoptose von Entzündungszellen
Zahlreiche histologische und immunhistochemische Untersuchungen an der Synovialmembran des Hundes zeigten, dass die Kreuzbandruptur oft mit einer lymphoplasmazellulären Entzündungsinfiltration einhergeht (HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 1999; LEMBURG et al. 2001). In den vorliegenden Untersuchungen galt es zu klären, ob die Akkumulationen von Entzündungszellen durch lokale Proliferation entstehen, oder ob sie bereits an einem anderen Ort aktiviert wurden und daraufhin hämatogen in die Synovialmembran einwandern. In der Literatur gibt es hierüber nur Informationen aus der Humanmedizin. KRENN et al. (1996) wiesen bei der Untersuchung der Synovialmembran von Menschen mit rheumatoider Arthritis nach, dass proliferierende, reife B-Zellen in Sekundärfollikeln, in kleinen follikulären Aggregaten mit follikulären dendritischen Retikulumzellen und nahe der synovialen Intima vorhanden sind. Die Autoren vermuteten, dass die Synovialmembran ein Ort für Antigen-abhängige Proliferation und Maturation ist.
MAGALHĂES et al. (2002) wiesen nach, dass in der Synovialmembran bei 10-23% der Fälle von Menschen mit rheumatoider Arthritis lymphatische Follikel mit sogenannten Keimzentren vorkommen und die B-Lymphozyten in der Lage sind, eine lokale Keimzentrumsreaktion einzugehen. Die Autoren unterscheiden eine Keimzentrumsreaktion (maturativer Typ) von einer Nicht-Keimzentrumsreaktion (akkumulativer Typ).
In der vorliegenden Arbeit konnten, wie auch schon bei LEMBURG et al. (2001), sowohl bei den Hunden mit Kreuzbandriss als auch bei den Hunden mit Polyarthritis teilweise hochgradige Akkumulationen von Lymphozyten und Plasmazellen beobachtet werden, welche jedoch keinen Keimzentrums-ähnlichen Aufbau aufwiesen. MAY et al. (1992) beobachteten dagegen das Vorkommen von Keimzentren in der Synovialmembran bei Hunden mit rheumatoider Arthritis.
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5.3.1 CD3- positive T-Lymphozyten und IgG- positive Plasmazellen in der Synovialmembran von Hunden mit Kreuzbandriss und mit Polyarthritis
Übereinstimmend mit den Untersuchungen von LEMBURG et al. (2001) kommt es sowohl bei Hunden mit Kreuzbandriss als auch bei Hunden mit Polyarthritis in entzündlich verändertem Gewebe zu einer Zunahme IgG- positiver Plasmazellen. In der vorliegenden Untersuchung bestanden bezüglich der Anzahl IgG- positiver Plasmazellen in den Kreuzbandrissgruppen signifikante Unterschiede; dabei war die Anzahl IgG- positiver Plasmazellen positiv mit steigendem Entzündungsgrad korreliert. Alle Gruppen unterschieden sich signifikant von den Vergleichstieren.
Die Gruppe der Tiere mit Polyarthritis wies im Vergleich mit KBR-Gruppe 3 eine signifikant geringere Anzahl an IgG- positiven Plasmazellen auf, zu den anderen beiden KBR-Gruppen bestanden keine signifikanten Unterschiede. Bei den Untersuchungen von LEMBURG et al.
(2001) waren keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Anzahl IgG- positiver Plasmazellen zwischen Tieren mit Polyarthritis und Kreuzbandriss festzustellen, jedoch hatten die genannten Autoren, anders als in dieser Arbeit, bei Hunden mit KBR keine Unterteilung nach dem Entzündungsgrad vorgenommen. Die IgG- positiven Zellen stellten in dieser Arbeit bei den Tieren mit Polyarthritis im Vergleich mit der Anzahl der CD3- positiven T-Lymphozyten die dominierende Entzündungszellart dar. Dagegen überwogen bei den Untersuchungen von LEMBURG et al. (2001) in der Synovialmembran von Hunden mit chronischer Polyarthritis die T-Lymphozyten. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von HEWICKER-TRAUTWEIN et al. (1999) veröffentlicht.
Zu betonen ist, dass CD3- positive T-Lymphozyten durchaus auch in der Synovialmembran von Vergleichstieren zu finden waren und vereinzelt kamen auch IgG- positive Plasmazellen vor. Bestätigt wird dieses Ergebnis durch die Untersuchungen von LEMBURG et al. (2001).
Dies könnte darauf hinweisen, dass sich auch in der Synovialmembran von Hunden ohne Gelenkserkrankungen eine gewisse Entzündungszellpopulation befindet, was damit generell für die Synovialmembran als ein Ort der Antigenabwehr spricht. Außerdem stellt sich die Frage, ob die beobachteten Entzündungsinfiltrationen in der Synovialmembran schon vor einer Kreuzbandruptur bestanden und möglicherweise in der Pathogenese des
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Kreuzbandrisses eine Rolle spielen könnten. Nähere Untersuchungen an einer größeren Anzahl an für den Kreuzbandriss prädisponierten Vergleichstieren (Faktoren: Rasse, Alter, Gewicht) wären notwendig, um diese Frage zu klären. In Übereinstimmung mit LEMBURG et al. (2001) zeigte sich insgesamt ein signifikanter Anstieg von CD3- positiven T-Lymphozyten in den KBR-Gruppen gegenüber den Vergleichstieren. In diesen Untersuchungen war die Anzahl CD3- positiver Entzündungszellen mit zunehmenden Entzündungsgrad der Synovialmembran der Kreuzbandrisstiere positiv korreliert und auch das perivaskuläre multifokale Verteilungsmuster nahm zu. Während in KBR-Gruppe 1 und KBR-Gruppe 2 dabei noch IgG- positive Zellen dominierten, war die CD3- Lymphozytenpopulation in KBR Gruppe 3 gegenüber den IgG- positiven Zellen um den Faktor 1,2 stärker vertreten.
5.3.2 Proliferation der Entzündungszellen bei den Tieren mit Kreuzbandriss
In den immunhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit wurden mit dem Proliferationsmarker Ki-67 zunächst alle proliferierenden Entzündungszellen jeder Gruppe gezählt und verglichen. Die größte Anzahl proliferierender Entzündungszellen zeigte dabei die KBR-Gruppe 3 mit einer Signifikanz zu allen Gruppen. Mit steigendem Entzündungsgrad steigt bei den Tieren mit Kreuzbandriss auch die Proliferation von Entzündungszellen an.
Durch zwei immunhistochemische Doppelfärbungen erfolgte eine Identifikation der proliferierenden Entzündungszellarten.
Bei der Doppelfärbung Ki-67 CD3 stellte sich heraus, dass sich bei der KBR-Gruppe 1 die Hälfte der CD3- positiven Zellen in Proliferationsaktivität befanden (50,9%). Die Proliferationsaktivität der CD3- positiven T-Lymphozyten nahm mit steigendem Entzündungsgrad der Synovialitis bei den KBR-Tieren immer weiter ab, bei KBR-Gruppe 2 proliferierten 14,4% und bei KBR-Gruppe 3 nur noch 1,2% der CD3- positiven Zellen. Bei den Vergleichstieren waren keine proliferierenden CD3- positiven T-Lymphozyten vorhanden. Signifikanzen zur Gruppe der Vergleichstiere lagen bei Gruppe 1 und KBR-Gruppe 3 vor.
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Die Proliferation von IgG- positiven Plasmazellen bei den Tieren mit Kreuzbandriss und Synovialitis war insgesamt gering; die Anzahl proliferierender Plasmazellen und eine multifokale perivaskuläre Verteilung war mit steigendem Entzündungsgrad positiv korreliert.
KBR-Gruppe 1 und KBR-Gruppe 3 wiesen jeweils 6,8% proliferierende IgG- positive Plasmazellen auf, danach folgte KBR-Gruppe 2 mit 4,1%. Selbst die Vergleichstiere zeigten eine geringe Proliferationsaktivität von 0,4% der IgG- positiven Zellen auf, dabei bestanden signifikante Unterschiede zu KBR-Gruppe 3. KBR-Gruppe 3 wies einen signifikanten Unterschied zur KBR-Gruppe 1 und den Vergleichstieren auf. Auch KBR-Gruppe 2 besaß signifikant mehr proliferierende IgG- positive Plasmazellen als KBR-Gruppe 1.
Aufgrund der nachgewiesenen geringen Proliferationsaktivität der IgG- positiven Plasmazellen in der Synovialmembran der Hunde mit Kreuzbandriss werden diese Zellen vermutlich an einem anderen Ort als in der Synovialmembran aktiviert, um anschließend hämatogen in die Synovialmembran zu immigrieren. Dafür spricht auch, dass viele Plasmazellen bei dieser Untersuchung in Gefäßnähe oder auch intravasal beobachtet wurden.
Die starke Proliferationsaktivität der T-Lymphozyten bei den Hunden mit Kreuzbandriss und geringgradiger Synovialitis könnte für eine Entzündung im Frühstadium sprechen, dies ist jedoch lediglich eine Vermutung und kann aufgrund fehlender Daten, wie etwa der Zeitspanne zwischen Erkrankungsbeginn und Operationstermin, nicht bewiesen werden.
5.3.3 Proliferation der Entzündungszellen bei den Tieren mit Polyarthritis
Bei der Einfachfärbung mit dem Proliferationsmarker Ki-67 wiesen die Tiere mit Polyarthritis eine signifikant größere Anzahl an proliferierenden Entzündungszellen als die Vergleichstiere auf und eine signifikant geringere Anzahl im Vergleich mit KBR-Gruppe 3.Auch hier erfolgte durch zwei immunhistochemische Doppelfärbungen eine Identifikation der proliferierenden Entzündungszellarten.
Bei den Tieren mit Polyarthritis zeigen 9,9% der CD3- positiven T-Lymphozyten Proliferationsaktivität. Die Vergleichstiere weisen dazu im Vergleich keine proliferierenden CD3- positiven T-Lymphozyten auf und unterscheiden sich signifikant von der Gruppe der Tiere mit Polyarthritis. Insgesamt waren Ki-67CD3- positive Zellen vorwiegend disseminiert
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verteilt und teilweise auch perivaskulär gelegen. Die Auswertung der Summe der insgesamt proliferierenden undifferenzierten Entzündungszellen ergab nach Abzug der Summe der proliferierenden CD3- T-Lymphozyten und IgG- positiven Plasmazellen, dass ausserdem anscheinend eine andere Lymphozytenpopulation proliferierte. Dabei handelte es sich vermutlich um proliferierende B-Lymphozyten (CD22), welche in dieser Arbeit jedoch nicht weiter identifiziert worden sind.
Die Proliferationsaktivität gemessen an der Gesamtheit der IgG- positiven Plasmazellen war bei den Hunden mit Polyarthritis im Vergleich zu den KBR-Gruppen mit 26,3% am höchsten.
Zu den Vergleichstieren bestanden dabei signifikante Unterschiede.
Die vermehrte Proliferationsaktivität von IgG- positiven Plasmazellen bei den Hunden mit Polyarthritis ist vergleichbar mit Untersuchungsergebnissen aus der Humanmedizin. KRENN et al. (1996) demonstrierten am Beispiel der rheumatoiden Arthritis des Menschen, dass in der Synovialmembran proliferierende reife B-Zellen in Sekundärfollikeln, in kleinen follikulären Aggregaten mit dendritischen Retikulumzellen und nahe der synovialen Intima vorhanden sind. Auch wiesen die Autoren proliferierende T-Lymphozyten in Aggregaten, perivaskulär und sowohl in als auch nahe der Synovialdeckzellschicht nach. Die Autoren vermuteten, dass die Synovialmembran als Ort für Antigen-abhängige Proliferation und Maturation fungieren könnte. Bei der vorliegenden Untersuchung konnte weder bei den Hunden mit Kreuzbandriss noch bei den Tieren mit Polyarthritis ein Keimzentrums-ähnlicher Aufbau, wie er in Sekundärfollikeln vorkommt, gefunden werden, was zunächst gegen eine Antigen-abhängige Proliferation in der Synovialmembran spricht. Allerdings fiel bei den Untersuchungen von KRENN et al. (1996) die Anwesenheit follikulärer dendritischer Retikulumzellen in der Nähe von proliferierenden Lymphozyten auf. Auch bei den Untersuchungen von LEMBURG et al.
(2001) zeigten sich in der Subsynovialis von Hunden mit Kreuzbandriss und Polyarthritis MHCII- positive Zellen mit dendritischer Morphologie; ebenso wie bei HEWICKER-TRAUTWEIN et al. (1999) wurden diese in der Synovialmembran von Hunden mit rheumatoider Arthritis und degenerativen Arthropathien beschrieben. Denkbar ist eine Antigenpräsentation durch die dendritischen Zellen in der Synovialmembran mit einer nachfolgenden Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten. Die in der vorliegenden Arbeit nachgewiesene starke Proliferation der CD3- T-Lymphozyten bei KBR-Gruppe 1
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spricht für diese Theorie. Dendritische Zellen speziell waren nicht Gegenstand der vorgelegten Arbeit.
5.3.4 Apoptose der Entzündungszellen bei Hunden mit Kreuzbandriss und Hunden mit Polyarthritis
Apoptotische Entzündungszellen wurden mit Hilfe der Caspase-3 Einfachfärbung dargestellt und nicht weiter spezifiziert.
Insgesamt zeigte sich sowohl bei den Tieren mit Kreuzbandriss und den Tieren mit Polyarthritis eine sehr geringe Apoptose-Aktivität der Entzündungszellen, welche bei den Tieren mit Polyarthritis noch am stärksten ausgeprägt war. Signifikanzen zu den Vergleichstieren oder auch zwischen den einzelnen Gruppen waren nicht vorhanden. Bei den Tieren mit Kreuzbandriss wies die KBR-Gruppe 3 die höchste Anzahl an apoptotischen Zellen auf, die Apoptose der Entzündungszellen bei den beiden anderen KBR-Gruppen fiel geringer aus als bei den Vergleichstieren.
Mutmaßlich spielt die Apoptose von Entzündungszellen in der Pathogenese von Kreuzbandrissen und bei Polyarthritiden des Hundes eine untergeordnete Rolle. Die leicht erhöhte Anzahl apoptotischer Entzündungszellen bei den Tieren mit Polyarthritis deckt sich mit den Ergebnissen der Untersuchungen von HASUNUMA et al. (1998), die zeigten, dass bei synovialen T-Zellen bei der rheumatoiden Arthritis des Menschen sehr oft Apoptose vorhanden ist. Dazu zählen CD3-, CD4- und CD45 RO- positive T-Zellen. Weitere Untersuchungen bezüglich einer Spezifizierung der apoptotischen Entzündungszellen wären für eine genauere Aussage von Vorteil.
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