3 Material und Methoden
3.4 Immunhistochemische Färbemethoden
3.4.1 Einzelfärbungen
3.4.2 ABC-Methode an formalinfixiertem Paraffinmaterial
Zur immunhistochemischen Darstellung der Antigene wurde die Avidin-Biotin-Komplex Peroxidase- (ABC) Methode angewandt. Der unkonjugierte Primärantikörper bindet sich spezifisch an das nachzuweisende Antigen. Der Sekundärantikörper, welcher sich an den ersten Antikörper bindet, ist biotinyliert. Das dritte Reagenz ist der Peroxidase-konjugierte Avidin-Biotin-Komplex, bei dem die freien Stellen des Avidins und die hohe Affinität zu Biotin die Bindung an das Biotin des Sekundärantikörpers ermöglichen. Das Enzym Peroxidase wird mit einem Chromogen sichtbar gemacht und damit gleichzeitig auch das gesuchte Antigen.
3.4.3 Primäre und sekundäre Antikörper
Alle Primär- und Sekundärantikörper sind kommerziell erhältlich; die benutzten Verdünnungen der verwendeten Antikörper sind in Tabelle 3 und 4 aufgelistet. Nähere Angaben zu Herkunft und Herstellern befinden sich am Beginn der jeweiligen Rezepte.
3.4.4 Tertiärer Antikörper
Als tertiärer Antikörper wurden bei Verwendung des DAB-Detektionssystems Peroxidase-gekoppelte Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexe (Vector Laboratories, USA; ABC-Standard, PK-4000 und ABC-Elite, PK-6100) eingesetzt.
Material und Methoden 37
3.4.5
Nachweis des Ki-67- Antigens in der Synovialmembran
Marker für Proliferation:
Monoklonaler Maus- Anti- Mensch- Ki-67- Antigen- Antikörper Klon MIB-1 (DAKO CYTOMATION, Glostrup, Dänemark)
1.Tag:
1. Entparaffinierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe:
Essigsäurebutylester (3 x 5 Min.), Isopropylalkohol (5 Min.), 96%iger und 70%iger Alkohol (jeweils 5 Min.).
2. 30 Min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 0,5 % Wasserstoffperoxid (Merck, Darmstadt).
3. 3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
4. Demaskierung der Antigene 15 Min. in Citratpuffer (Quartett, Berlin) kochend in der Mikrowelle (Bauknecht, Schorndorf).
5. 3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
6. Objektträger auf Shandon Coverplates™ (Thermo Electron, Dreieich) und in Shandon Sequenza®-Slide Racks (Thermo Electron, Dreieich) überführen.
7. Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktivierten Ziegen-Normalserum in PBS; 20 Min. Inkubation bei Raumtemperatur.
8. Erstantikörper: 1:100 in PBS mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA, Serva, Heidelberg) verdünnter monoklonaler Maus- anti- Mensch- Ki-67- Antigen- Antikörper (DakoCytomation, Glostrup, Dänemark); Inkubation über Nacht bei 4°
C im Kühlschrank.
2.Tag:
9. 3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05 % Tween (Serva, Heidelberg).
10. Zweitantikörper: 1:200 in PBS mit 50% Hundeserum (am Vortag angesetzt) verdünnter biotinylierter Pferd- anti- Maus- IgG (H+L)- Antikörper (Vector, Burlingame, CA, USA); Inkubation 30 Min. bei Raumtemperatur.
11. 3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05% Tween.
Material und Methoden 38
12. Überschichten mit ABC-Reagenz (Vector, Burlingame, CA, USA, Zubereitung siehe Anhang unter 9.4.1.).
13. 3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer.
14. Überführen der Objektträger aus den Coverplates zurück in Küvetten.
15. Enzymhistochemische Reaktion: 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB, Fluka, Buchs, Schweiz, Zubereitung siehe Anhang); 5 Min. bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
16. 5 Min. spülen in PBS- Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
17. Verbringen in fliessendes Leitungswasser und 10 Min. spülen.
18 Gegenfärbung 30 Sekunden in Hämalaun nach Mayer (Roth, Karlsruhe).
19. 15 Min. bläuen in fließendem Leitungswasser.
13. Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe: 50%iger, 70%iger, 96%iger Alkohol für jeweils 3 Min., Isopropylalkohol (2 x 5 Min.), Essigsäurebutylester (3 x 5 Min.).
14. Eindecken der Gewebeschnitte mit Roti®-Histokitt (Roth, Karlsruhe).
3.4.6
Nachweis des aktiven Caspase-3- Antigens in der Synovialmembran
Marker für Apoptose:
Polyklonaler Kaninchen- anti-Mensch/Maus/Ratte- aktive Caspase-3 -Antikörper gegen ein Peptid des p 17 Fragmentes der humanen Caspase-3
(PROMEGA, Madison, WI, USA) 1. Tag:
1. Entparaffinierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe:
Essigsäurebutylester (3 x 5 Min.), Isopropylalkohol (5 Min.), 96%iger und 70%iger Alkohol (jeweils 5 Min.).
2. 30 Min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 0,5 % Wasserstoffperoxid (Merck, Darmstadt).
3. 3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
Material und Methoden 39
4. Demaskierung der Antigene 15 Min. in Citratpuffer (Quartett, Berlin) kochen in der Mikrowelle (Bauknecht, Schorndorf).
5. 3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer Objektträger auf Shandon Coverplates™ (Thermo Electron, Dreieich) und in Shandon Sequenza®-Slide Racks (Thermo Electron, Dreieich) überführen.
6. Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktivierten Ziegen-Normalserum in PBS; 20 Min.
Inkubation bei Raumtemperatur.
7. Erstantikörper: 1:6000 in PBS mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA, Serva, Heidelberg) verdünnter Polyklonaler Kaninchen anti Mensch aktive Caspase3 -Antikörper (PROMEGA, Madison, WI, USA); Inkubation über Nacht bei 4° C im Kühlschrank.
2. Tag:
8. 3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05 % Tween (Serva, Heidelberg)
9. Zweitantikörper: 1:200 (mit Adsorption des Zweitantikörpers in PBS mit 50%
Hundeserum am Vortag) verdünnter biotinylierter Ziege- anti- Kaninchen- IgG- Antikörper (VECTOR, Burlingame, CA, USA); am nächsten Tag Zentrifugieren des angesetzten Zweitantikörpers und Pipettieren des Überstandes und Überschichten.
Inkubation 30 Min. bei Raumtemperatur.
10. 3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05% Tween.
11. Überschichten mit ABC-Reagenz (Vector, Burlingame, CA, USA, Zubereitung siehe Anhang unter 9.4.1.).
12. 3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer.
13. Überführen der Objektträger aus den Coverplates zurück in Küvetten.
14. Enzymhistochemische Reaktion: 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB, Fluka, Buchs, Schweiz, Zubereitung siehe Anhang unter 9.4.1.); 5 Min. bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
15. 5 Min. spülen in PBS- Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
16. Verbringen in fließendes Leitungswasser und 10 Min. spülen.
17. Gegenfärbung 30 Sekunden in Hämalaun nach Mayer (Roth, Karlsruhe).
18. 15 Min. bläuen in fließendem Leitungswasser.
Material und Methoden 40
19. Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe: 50%iger, 70%iger, 96%iger Alkohol für jeweils 3 Min., Isopropylalkohol (2 x 5 Min.), Essigsäurebutylester (3 x 5 Min.).
20. Eindecken der Gewebeschnitte mit Roti®-Histokitt (Roth, Karlsruhe).
Tabelle 3: Rezepte für die Einfachfärbungen
Antikörper Vorbehandlung
Mit Hilfe einer Doppelfärbung wird die Art der proliferierenden, also Ki-67- positiv markierten Zelle, spezifiziert. In diesem Falle lassen sich anhand der beiden Doppelfärbungen proliferierende CD3- positive T-Zellen von proliferierenden IgG- positiven Plasmazellen unterscheiden. In Tabelle 4 befinden sich die Vorbehandlung und die jeweiligen benötigten Verdünnungen der Antikörper der Doppelfärbungen.