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2.5 Allgemeines über die Apoptose
Die Apoptose oder der programmierte Tod von Zellen ist ein essentieller physiologischer Prozess, der wie die Proliferation für die Homöostase eines Organismus unabdingbar ist.
Störungen des geordneten Zusammenwirkens von Zellproliferation und Zelltod kann beispielsweise zur Tumorbildung führen. (ZIMMERMANN et al. 2001; KUMAR et al.
2005). Der programmierte Zelltod wurde 1842 bei der Beobachtung der Ontogenese von Wirbeltieren zum ersten Mal beschrieben (VOGT 1842). VOGT beobachtete, dass während der Entwicklung von Amphibien unerwünschte Gewebe (Schwanz, Schwimmhäute) durch Zelltod gezielt abgebaut werden. Der Begriff Apoptose taucht erstmals in den Untersuchungen von KERR et al. im Jahre 1972 auf. Die Apoptose spielt eine wichtige Rolle in der Embryogenese, bei Hormon-abhängigenen Rückbildungen beim Adulten, als Verteidigungsmechanismus in Immunreaktionen, bei Zellschäden, ausgelöst durch Tumorerkrankungen oder virale Infektionen oder andere Stimuli wie Hitze, Strahlung oder Chemikalien. Glukokortikoide können beispielsweise durch Bindung an intrazelluläre Rezeptoren Apoptose auslösen. Auch ein Entzug von Überlebens-, Wachstumsfaktoren und Zytokine, die an Oberflächenrezeptoren binden, können Apoptose induzieren. Beim Alterungsprozess besitzt die Apoptose eine tragende Rolle (KUMAR et al. 2005).
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Apoptotische Zellen sind durch spezifische morphologische und biochemische Veränderungen charakterisiert (ZIMMERMANN et al. 2001) Die morphologischen Veränderungen beinhalten das Schrumpfen von Zytoplasma und Zellkern. Ausserdem kondensiert das Chromatin und zerfällt in Fragmente. Des weiteren bilden sich Ausstülpungen der Plasma- und der Kernmembran, die sich als sogenannte „apoptotic bodies“ abschnüren.
Diese durch sogenanntes „blebbing“ abgeschnürten Vesikel und die geschrumpften Zellkörper werden dann von phagozytierenden Zellen beseitigt. (ZIMMERMANN et al. 2001; KUMAR et al. 2005). Ein wichtiges biochemisches Charakteristikum ist unter anderem die durch internukleosomale Spaltung der DNA entstandene typische „DNA-Leiter“. In der Elektrophorese isolierter DNA können die DNA- Fragmente als Leitermuster sichtbar gemacht werden und sind somit unterscheidbar von der unspezifisch umgebauten DNA nekrotischer Zellen (SARASTE u. PULKKI 2000). In der Zelle werden durch die obengenannten Stimuli die Caspasen (Cystein Aspartat-spezifische Proteasen) aktiviert. Diese liegen im Zytoplasma als Proenzyme vor und werden durch 2 spezifische Spaltungen zu voll funktionsfähigen Proteasen aktiviert. Prototyp der Caspasen ist das Interleukin-1ß converting enzyme (ICE; Caspase-1), welches verantwortlich ist für die Maturation der Proform von Il-1ß zu seiner biologisch aktiven Form. Das ICE oder die Caspase-1 ist homolog zu einem Gen namens ced-3 in dem Nematoden Caenorhabditis elegans. Bei den Säugetieren sind insgesamt 14 Gene der Familie der Caspasen bekannt (ZIMMERMANN et al. 2001). Die Caspasen gelten als evolutionsbiologisch konserviert und kommen beim Menschen, Insekten, Nematoden und Hydra vor (HENGARTNER 2000). Bei der sogenannten Caspase- Kaskade aktivieren Initiator-Caspasen (Caspase-2,-8,-9) dabei nachgeschaltete Effektor-Caspasen (Caspase-3,-6,-7), die dann durch die Spaltung wichtiger Zellproteine den Tod und die Degradation der Zelle herbeiführen (ZIMMERMANN et al. 2001).
Es existieren 2 Hauptwege der Caspase- Aktivierung. Der sogenannte intrinsische Weg wird über die Mitochondrien vermittelt (rezeptorunabhängig). Hier kommt es durch noch nicht genau bekannte Mechanismen zur Freisetzung von Cytochrom c und anderen pro-apoptotischen Faktoren wie Smac/DIABLO aus den Mitochondrien in das Zytoplasma (ZIMMERMANN et al. 2001). Dieser Weg kann ausgelöst werden durch Tumor-Suppressoren, wie beispielsweise p53, einem Transkriptionsfaktor, der durch Schädigung der DNA aktiviert wird. p53 stimuliert die Expression pro-apoptotisch wirkender Mitglieder der
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Bcl-2 Familie (z. B. Bax, Bad). Diese führen dann zur Freisetzung der pro-apoptotischen Faktoren– wie etwa Cytochrom c – aus dem mitochondrialen Intermembranraum. Es wirken jedoch viele toxische Substanzen wie z.B. Chemotherapeutika auch direkt auf die Mitochondrien und können so den intrinsischen Weg der Apoptose induzieren. Durch die Bindung von Cytochrom c und dATP an Apaf-1 (apoptotischer Protease-Aktivierungsfaktor-1) wird eine Konformationsänderung des Proteins verursacht. Durch diese Konformationsänderung wird die Proteinbindedomäne CARD (Caspase-Rekrutierungs-Domäne) von Apaf-1 zugänglich, so dass sie an die CARD Domäne der Procaspase-9 binden kann. Die Bildung dieses Heterodimers ist eine Voraussetzung für die autolytische Aktivierung der Caspase-9. Dieser Komplex wird Apoptosom genannt und stellt die aktive Form der Caspase-9 dar. Analog zu Caspase-8 beim extrinsischen Weg initiiert aktive Caspase-9 die Caspase-Kaskade. Eine Signalverstärkung dieses Weges wird innerhalb der Caspase-Kaskade durch Caspase-7 vermittelt, welche nicht nur Substrate spaltet, die an der Ausführung der Apoptose beteiligt sind, sondern ihrerseits auch die Caspase-9 aktiviert (ZIMMERMANN et al. 2001; HENGARTNER 2000; KUMAR et al. 2005).
Der extrinsische Weg wird durch Ligandenbindung an einen Todesrezeptor der TNF- Rezeptorfamilie z.B. Fas (CD95) eingeleitet. Ferner unterscheidet man zwischen aktiver (durch Aktivierung von Rezeptoren induziert) und passiver (ausgelöst durch Entzug von Wachstumsfaktoren z. B. Neurotrophine) Apoptose. Die sogenannten Todesrezeptoren besitzen in ihrem zytoplasmatischen Teil eine Todesdomäne (DD, „death domain“). Liganden sind zum Beispiel der Tumornekrosefaktor (TNF) oder Fas-Ligand (FasL) und andere Zytokine. Durch die induzierte Trimerisierung des Rezeptors bilden die Todesdomänen eine Struktur, an die nun Adaptermoleküle mit eigener Todesdomäne binden können. In einem ersten Schritt wird das „TNF-Rezeptor assoziierte Protein“ (TRADD) rekrutiert.
Anschließend bindet an die DD des TRADD das „Fas assoziierte Protein mit Todesdomäne“
(FADD). FADD besitzt neben der DD auch eine Todeseffektordomäne (DED, „death effector domain“), über welche sich die proCaspase-8 mit ihrer DED an den Komplex bindet. Diese kann sich nun durch die entstandene hohe lokale Konzentration autokatalytisch aktivieren.
Die aktive Caspase-8 löst ihrerseits die Caspase- Kaskade aus, wodurch in einer signalverstärkenden Rückkopplung weitere Caspase-8-Moleküle aktiviert werden und es
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letztendlich zu einer Aktivierung der Caspase-3 kommt (HENGARTNER 2000;
ZIMMERMANN et al. 2001; KUMAR et al. 2005).
2.5.1 Caspase-3
Die häufigste Caspase in der Zelle ist die Caspase-3. Die Caspase-3 ist hauptverantwortlich für die Mehrheit der apoptotischen Effekte, unterstützt wird sie dabei von der Caspase6 und -7 (ZIMMERMANN et al. 2001). Diese Effektorcaspasen führen zum apoptotischen Tod der Zelle. Sie aktivieren einerseits sekundäre Zielproteine (z. B. Caspase- aktivierte DNase, CAD, oder andere Caspasen) durch limitierte Proteolyse. Andererseits sind sie selbst aktiv am Abbau von Lamin (in der Zellkernmembran) und Actin (Teil des Zytoskeletts) beteiligt. Ein weiterer Aspekt ist die caspasevermittelte Unterdrückung der DNA-Reparatur (HENGARTNER 2000) Die Wege, die zu einer Aktivierung der Caspase-3 führen, können von der Cytochrom c Freisetzung aus den Mitochondrien und der Caspase-9 Funktion sowohl abhängig als auch unabhängig sein (PORTER u. JÄNICKE 1999). Caspase-3 ist essentiell für die normale Gehirnentwicklung. Caspase-3 knock-out Mäuse werden nur wenige Wochen alt.
Interessanterweise sind bei diesen Mäusen die Folgen des Fehlens von programmiertem Zelltod in Form einer Hyperplasie nur im Gehirn zu sehen, jedoch nicht in den anderen Organen. Die obengenannten Autoren sehen dies eventuell als Hinweis, dass die Caspase-3 im Zentrum eines essentiellen neuralen Todeswegs liegt (PORTER u. JÄNICKE 1999).
Caspase-3 ist als Vorstufe im Zytoplasma vorhanden und wird durch autoproteolytische Spaltung oder durch die Spaltung einer oder mehrerer Proteasen in das aktive heterotetramerische Enzym überführt. Die nicht-aktive Vorstufe der Caspase-3 besteht aus einer Prodomäne und einer grossen p17- und einer kleinen p12- Untereinheit. Bei der Aktivierung der Caspase-3 wird die Prodomäne abgespalten und die zwei Untereinheiten verbinden sich jeweils zu einem Molekül. So entsteht das (p17/p12)2 Tetramer mit einem Molekulargewicht von 52 kDa (TAWA et al. 2004).
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