In den periplasmatischen Faltungswegen wirken zahlreiche Faltungshelferproteine, die zum einen die Proteinfaltung unterstützen bzw. Aggregation verhindern und zum anderen Proteine proteolytisch degradieren können. Im Folgenden werden einige der beteiligten periplasmatischen Faltungshelfer kurz vorgestellt. Eine ausführliche Beschreibung des in dieser Arbeit näher untersuchten periplasmatischen Chaperons SurA ist in Kapitel 1.5 zu finden.
1.3.1 Periplasmatische Peptidyl-Prolyl-Isomerasen (PPIasen)
Peptidyl-Prolyl-Isomerasen (PPIasen) katalysieren die cis-trans Isomerisierung der Peptidbindung zwischen einer Aminosäure X und einem nachfolgenden Prolin [Fischer and Aumuller, 2003]. Durch Beschleunigung dieses geschindigkeitslimitierenden Schrittes der Proteinfaltung erleichtern sie die effiziente Faltung und verkürzen somit signifikant die Zeitspanne bis zur korrekten Faltung [Ellis and Hartl, 1999]. Bekannte periplasmatische PPIasen sind die Proteine SurA [Rouviere and Gross, 1996], PpiD [Dartigalongue and Raina, 1998], PpiA (vormals RotA) [Liu and Walsh, 1990] und FkpA [Horne and Young, 1995]. Diese werden drei PPIase-Familien zugeordnet: den Parvulinen, den Cyclophilinen und den
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FK506-bindenden Proteinen (FKBP) [Rahfeld et al., 1994a; Gothel and Marahiel, 1999; Fischer and Aumuller, 2003].
Durch Sequenzhomologien zu Parvulin (Par10), einer kleinen PPIase aus E coli. [Rahfeld et al., 1994b] sind sowohl das SurA-Protein [Lazar and Kolter, 1996; Missiakas et al., 1996; Rouviere and Gross, 1996] als auch PpiD [Dartigalongue and Raina, 1998] den Parvulin-ähnlichen Peptidyl-Prolyl-Isomerasen zugeordnet worden. Zu dieser hoch-homologen Familie gehört auch das humane Protein Pin1 (hPin1) [Bayer et al., 2003]. Die Parvulin-ähnlichen Domänen dieser Proteine sind auch strukturell sehr ähnlich (Abb. 3). Ihre sogenannte Parvulin-Faltung besteht in der Regel aus vier antiparallelen β-Faltblättern, die von vier α-Helices umgeben werden (βα3βαβ2; [Fanghanel and Fischer, 2004]). Trotz dieser strukturellen Ähnlichkeiten verfügen nur Par10, die Parvulin-Domäne ІІ von SurA (SurAІІ) und hPin1 über eine nachweisbare PPIase-Aktivität [Rahfeld et al., 1994a; Rouviere and Gross, 1996; Yaffe et al., 1997]. Sowohl die isolierte Parvulin-Domäne І von SurA (SurAІ) als auch die Parvulin-Domäne von PpiD zeigen in vitro keine nachweisbare PPIase-Aktivität [Rouviere and Gross, 1996; Weininger et al., 2010].
Abb. 3: Struktureller Vergleich von PPIase-Domänen aus der Familie der Parvuline. Die Familie der Parvuline weist ausgeprägte Homologien in der Sequenz und der Struktur auf. Dargestellt sind aus Escherichia coli das Protein Par10 ([Kuhlewein et al., 2004]; PDB ID: 1JNS), sowie die Parvulin-Domänen І und ІІ von SurA (SurAІ bzw. SurAІІ; [Bitto and McKay, 2002]; PDB ID: 1M5Y) und die Parvulin-Domäne von PpiD ([Weininger et al., 2010]; PDB ID: 2KGJ). Die Parvulin-Domäne des humanen Pin1 (hPin1; [Bayer et al., 2003]; PDB ID: 1NMW) weist ebenfalls Homologien zu den Parvulin-ähnlichen Domänen aus E. coli auf. Trotz dieser strukturellen Ähnlichkeiten verfügen nur Par10, SurAІІ und hPin1 über eine nachweisbare PPIase-Aktivität.
SurA verfügt im Vergleich zu PpiA nur über eine geringe PPIase-Aktivität [Rouviere and Gross, 1996;
Behrens et al., 2001]. Die ursprünglich postulierte hohe PPIase-Aktivität von PpiD [Dartigalongue and Raina, 1998] ist für die Parvulin-ähnliche Domäne von PpiD nicht bestätigt worden und diese stimmt strukturell weitestgehend mit der PPIase-inaktiven Parvulin-Domäne І von SurA überein [Weininger et al., 2010]. Dahingegen sind PpiA und FkpA sehr PPIase-aktiv [Liu and Walsh, 1990; Arie et al., 2001]. Das Protein FkpA gehört zur Familie der FK506-bindenden Proteinen (FKBP) [Horne and Young, 1995] und PpiA ist ein Homolog zu den humanen Cyclophilinen [Liu and Walsh, 1990]. Insgesamt ist PpiA die aktivste, periplasmatische PPIase. Wird PpiA deletiert, führt dies zu einer fast nicht mehr nachweisbaren PPIase-Aktivität in E. coli [Kleerebezem et al., 1995]. Insgesamt hat die Funktion der periplasmatischen
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PPIasen jedoch keinen nennenswerten Einfluss auf die Faltung der OMPs und spielt in deren Assemblierung eine eher untergeordnete Rolle [Kleerebezem et al., 1995; Justice et al., 2005].
Die Annahme, dass die gleichzeitige Deletion von SurA und PpiD synthetisch letal ist [Dartigalongue and Raina, 1998] wurde in späteren Studien widerlegt ([Justice et al., 2005] und Arbeiten eigene AG). Auch die gleichzeitige Deletion aller vier periplasmatischen PPIasen hat keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen [Justice et al., 2005].
Die periplasmatischen PPIasen kommen sowohl als Einzeldomänen- als auch als Multidomänen-Proteine vor. Bei den Letzteren fungiert die zusätzliche Domäne oft als Chaperon und erhöht die Bindungsaffinität, in einigen Fällen auch die Selektivität der PPIase für Protein-Substrate [Scholz et al., 1997] oder führt zur Oligomerisierung der Proteine [Saul et al., 2004]. Schon seit längerem ist eine Chaperonfunktion für SurA [Behrens et al., 2001] und FkpA [Ramm and Pluckthun, 2000; Arie et al., 2001;
Ramm and Pluckthun, 2001] bekannt. Des Weiteren verfügt auch PpiD über eine Chaperon-Aktivität, die vermutlich einen frühen Schritt der Proteinfaltung der aus dem Cytoplasma translozierten Proteine unterstützt [Antonoaea et al., 2008; Stymest and Klappa, 2008; Matern et al., 2010].
1.3.2 Disulfidbrücken-Isomerasen
Bei der Faltung von Proteinen im Periplasma sind ebenfalls die Disulfid-Isomerasen DsbA und DsbC beteiligt, die Disulfidbrücken bei Proteinen mit Cysteinresten sowohl schaffen als auch isomerisieren können [Eppens et al., 1997; Messens and Collet, 2006; Gleiter and Bardwell, 2008]. Elektronen werden durch das Protein DsbD aus dem Cytoplasma über die innere Membran in das Periplasma transportiert.
Die Elektrone werden dazu genutzt Cysteinreste bestimmter Proteine in einem reduzierten Zustand zu halten [Katzen and Beckwith, 2000]. DsbA gehört zu den Thiol-Oxidasen und katalysiert bspw. die Formierung einer Cysteinbindung im Porin PhoE während des Transits durch das Periplasma [Eppens et al., 1997]. Hierbei werden die Cystein-Reste von DsbA oxidiert [Kadokura et al., 2004].
Die Protein-Disulfid-Isomerase DsbC benötigt für die vollständige Funktion als Isomerase die Anwesenheit von DsbD [Katzen and Beckwith, 2000]. Während der oxidativen Faltung der periplasmatischen Proteine mit Cystein-Resten korrigiert DsbC von DsbA falsch gebildete Disulfid-Brücken [Messens and Collet, 2006; Gleiter and Bardwell, 2008]. Hierbei werden nicht-native Disulfide reduziert und die korrekten Bindungen können durch DsbA wieder hergestellt werden [Shouldice et al., 2010]. DsbC ist ebenfalls an der Biogenese von LptD beteiligt [Denoncin et al., 2010] und weist in vitro zusätzlich eine signifikante Chaperon-Aktivität auf [Chen et al., 1999]. Die Zellen von surA und dsbC deletierten Mutanten wachsen sehr langsam, bleiben klein und weisen bei niedrigen Temperaturen einen Wachstumsdefekt auf. Dieser Phänotyp kann durch die Isomerase-Aktivität, jedoch nicht durch die Chaperon-Aktivität, von DsbC komplementiert werden [Denoncin et al., 2010].
1.3.3 Die periplasmatische Protease DegP
Das periplasmatische Protein DegP besitzt sowohl eine Protease-Funktion für ungefaltete und fehlgefaltete Proteine als auch eine Chaperon-Funktion [Spiess et al., 1999], wobei postuliert wird, dass die Protease-Funktion die wichtigere Rolle spielt [CastilloKeller and Misra, 2003]. Eine Beteiligung an der
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OMP-Assemblierung wird angenommen, da eine degP surA-Doppelmutation in einem letalen Phänotyp resultiert [Rizzitello et al., 2001]. Aus diesem Grund wird vermutet, dass DegP zusammen mit Skp in einem zu SurA parallelen Faltungsweg agiert.
1.3.4 Das periplasmatische Chaperon Skp
Das 17 kDa kleine periplasmatische Protein Skp verfügt über eine generelle Chaperonaktivität [Chen and Henning, 1996; Missiakas et al., 1996]. Der strukturelle Aufbau des periplasmatischen Chaperons Skp besteht aus drei langen α-helikalen Tentakel-ähnlichen Strukturen, die von einer zentralen β-Fass Struktur ausgehen und Ähnlichkeit mit einer Qualle aufweist (siehe Abb. 2) [Korndorfer et al., 2004; Walton and Sousa, 2004]. In dem es Proteine in dieser Quallen-ähnlichen Struktur einschließt, verhindert Skp die Aggregation der Proteine auf dem Weg durch das Periplasma [Walton et al., 2009]. Somit kann das Skp-Protein der Klasse der sogenannten „holding“ (= haltenden) Chaperone zugeordnet werden [Stirling et al., 2003; Walton and Sousa, 2004]. Diese Klasse steht im Gegensatz zu den „folding“ (= faltenden) Chaperonen, die die Proteinfaltung aktiv unterstützen [Stirling et al., 2003].