Analyse der SurA-Peptid-Interaktion mittels ESR-Spektroskopie

Zur Vorbereitung der Analyse der SurA-Peptid-Interaktion mittels ESR-Spektroskopie wurden die gereinigten mit MTSSL-markierten Proteine in Konzentrationen von 100 – 300 µM mit einem zwei- (SurA_H68C) bzw. vierfachen (SurA_N227C und SurA_Q223C) molaren Überschuss an Peptid (Pep46 bzw. Pep71) für 2 h in Puffer A, pH 8,0 bei Raumtemperatur inkubiert. Der Einsatz geringerer Proteinkonzentrationen kann in einem zu geringen Signal-zu-Rausch Verhältnis resultieren, welches keine schlüssige Analyse der resultierenden Spektren zulässt [Hammarström et al., 2001]. Für die ESR-spektrokopische Untersuchung wurde ein Magnetfeld von 3195 bis 3295 Gauß [G] angelegt, wobei das Zentrum des Spektrums bei 3255 G lag. Jede Messung wurde mindestens dreimal durchgeführt.

Repräsentative Spektren sind in Abb. 14 gezeigt. Zur Veranschaulichung des Ortes der Cystein-Mutationen in Relation zum gebundenen PepC aus der Kristallstruktur [Xu et al., 2007] sind den ESR-Spektren kleine Darstellungen der Struktur der SurA-Proteine beigefügt, in denen die relevante Aminosäure markiert wurde.

ERGEBNISSE

Zu Anfang sollten die vorläufigen ESR-Analysen der SurA-Peptid-Interaktion mit den Varianten SurA_H68C, SurA_Q223C und SurA_N227C abgeschlossen werden. Hierfür galt es zunächst zu überprüfen, ob es sich bei Peptid Pep46 aus der LamB-Bibliothek tatsächlich um ein His-tag bindendes Peptid handelt (persönliche Kommunikation Dr. habil. S. Behrens-Kneip und Details siehe 4.1.1). Die Bindung von Pep46 an das in Position H68C mit MTSSL markierte SurA-Protein hatte in ersten ESR-spektroskopischen Analysen zu einer deutlichen Änderung des Spektrums geführt [Hennecke, 2006]. Dies hätte aufgrund der räumlichen Nähe der Position H68C im SurA-Protein zum C-terminalen His-tag auch durch eine Bindung des Peptides an den His-tag verursacht werden können. Um dieser Möglichkeit nachzugehen, wurde durch Thrombinspaltung ein His-tag freies SurA-H68C-Protein generiert und die Interaktion der MTSSL-markierten Proteine SurA_H68C-MTSSL mit und ohne His-tag mit den Peptiden Pep46 bzw. Pep71 vergleichend ESR-spektroskopisch untersucht (Abb. 14a & b).

Die ESR-Spektren der MTSSL-markierten SurA_H68C-Proteine mit und ohne C-terminalen His-tag sind identisch. Im Vergleich zum Spektrum der freien Radikalsonde (Abb. 13b) sind die Spektren etwas breiter und die äußeren peaks flacher, welches auf eine reduzierte Beweglichkeit der Sonde hinweist [Hoppe, 1982;

Hammarström et al., 2001; Steinhoff, 2004]. Lediglich der mittlere peak weist noch eine Ähnlichkeit zum Spektrum des freien Radikals auf. Die Anwesenheit der Peptide Pep46 und Pep71 resultierte bei keinem der beiden Proteine in einer signifikanten Änderung des Spektrums der Radikalsonde (Abb. 14a & b).

Damit konnten die zuvor für das SurA_H68C-Protein mit C-terminalem His-tag beobachteten Daten nicht bestätigt werden. Basierend auf diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass das Peptid Pep46 nicht in räumlicher Nähe zur Position H68 an SurA und mit großer Wahrscheinlichkeit auch nicht an den C-terminalen His-tag von SurA bindet.

Für das Protein SurA_Q223C-MTSSL konnte lediglich unspezifisches Rauschen, jedoch kein ESR-Spektrum der Radikalsonde erhalten werden (Abb. 14.c). Dies stimmt mit bisherigen Daten überein, und deutet darauf hin, dass sich diese Position nicht mit MTSSL markieren lässt, da sie im SurA-Gesamtprotein zu sehr in der Struktur verborgen liegt [Hennecke, 2006]. Aufgrund der Nähe dieser Position zu der postulierten Substratbindestelle in Parvulin-Domäne І, wurde die Q223C-Mutation für nachfolgende ESR-Analysen in die isolierte Domäne І von SurA eingeführt, um gegebenenfalls die durch die Peptidbindung induzierte Dimerisierung nachweisen zu können (siehe auch 4.1.1.2).

In vorangegangenen Analysen konnte für SurA_N227C aufgrund eines zu geringen Signal-zu-Rausch Verhältnisses kein signifikanter Effekt auf die Mobilität der Radikalsonde MTSSL erhalten werden (Dr. G.

Hennecke, unveröffentlichte Daten). Da sich auch diese Position in räumlicher Nähe zu der veröffentlichten Substratbindestelle in Domäne І befindet, wurde diese Variante bei höherer Proteinkonzentration erneut untersucht. Das erhaltene MTSSL-spezifische ESR-Spektrum zeigt, dass diese Position für eine Markierung zugänglich ist (Abb. 14d). Das ESR-Spektrum ohne Peptid weist im Vergleich zum freien MTSSL eine Verbreiterung und ein starkes Abflachen der äußeren peaks, in wesentlich stärkerem Ausmaß als es bei SurA_H68C der Fall ist, auf. Dies spricht für einen relativ hohen Immobilisierungsgrad der Radikalsonde [Hoppe, 1982; Hammarström et al., 2001; Steinhoff, 2004], bedingt durch die Nähe zu den umgebenden Aminosäureresten in der Proteinstruktur. Dennoch ist in

ERGEBNISSE

Anwesenheit von Pep46 eine leichte Verbreiterung des Spektrums durch eine Verschiebung des linken äußeren peaks zu erkennen. Dies spricht für eine weitere Verringerung der Mobilität der Radikalsonde, die durch eine Bindung des Peptides in der Umgebung der Sonde zu erklären ist. In Anwesenheit der Peptide Pep71 (Abb. 14d, blaue Linie), sowie Pep54 und Pep95 (data not shown) war keine Änderung der Spektren zu erkennen.

Die ESR-Analyse des in Position E238C mit MTSSL markierten SurA-Proteins ließ auf einen bereits hohen Immobilisierungsgrad der Sonde schließen. In Anwesenheit der Petide war keine weitere Veränderung der Spektren erkennbar (data not shown). Da diese Position im Bereich der postulierten Peptidbindestelle in Domäne Ι von SurA liegt, wurde diese Mutation auch in SurAІ untersucht.

Abb. 14: Untersuchung des Einflusses von Peptiden auf die Mobilität der Radikalsonde MTSSL in unterschiedlichen SurA-Cys-Mutanten. Gezeigt sind die ESR-Spektren des freien Elektrons der Radikalsonde MTSSL, mit der verschiedene SurA-Cys-Mutanten ortsspezifisch markiert wurden. Untersucht wurden die SurA-Cys-Mutanten (a) SurA_H68C mit C-terminalem His-tag, (b) SurA_H68C ohne C-terminalen His-tag, (c) SurA_Q223C und (d) SurA_N227C. Die SurA-Cys-Mutanten wurden für 1 h in Gegenwart von 1 mM MTSSL in Puffer A, pH 6,7 bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend laut Protokoll gereinigt. Die mit MTSSL-markierten Proteine wurden mit einem zwei- (a & b) bzw. vierfachen (c & d) molaren Überschuss an Peptid für 2 h in Puffer A, pH 8,0 bei Raumtemperatur inkubiert. Für die ESR-spektroskopische Untersuchung wurde ein Magnetfeld von 3195 bis 3295 Gauß [G] angelegt, wobei das Zentrum des Spektrums bei 3255 G lag. Jede Messung wurde mindestens dreimal durchgeführt und es werden repräsentative Spektren gezeigt (ohne Peptid = schwarz; mit Pep46 = rot; mit Pep71 = blau). (a & b) Die Spektren der Variante SurA_H68C-MTSSL weisen mit und ohne His-tag sowie in Anwesenheit der Peptide einen vergleichbaren Verlauf auf. Eine Bindung des Peptides Pep46 in der näheren Umgebung der Sonde in Position H68 von SurA oder an den C-terminalen His-tag konnte damit nicht bestätigt werden. (c) Für SurA_Q223C-MTSSL konnte auch bei höherer Proteinkonzentration und maximaler Verstärkung kein ESR-Signal erhalten werden, was übereinstimmend mit früheren Daten dafür spricht, dass diese Position im SurA-Gesamtprotein nicht mit MTSSL markierbar ist.

(d) Das Spektrum des Proteins SurA_N227C-MTSSL ist in Anwesenheit von Pep46 etwas verbreitert. Dies spricht für eine leicht verstärkte Immobilisierung der Radikalsonde MTSSL durch eine Peptidbindung in der näheren Umgebung.

ERGEBNISSE

4.1.3.3 Analyse der Interaktion der isolierten Parvulin-Domäne Ι von SurA mittels ESR-Spektroskopie