Generierung der Vektoren und des Proteinexpressionsstammes für die Versuche der

Für die Durchführung der Quervernetzungsversuche wurden zwei Arten von Plasmiden benötigt:

einerseits Vektoren, die für LamB-Polypeptide und das LamB-Protein kodieren, und andererseits Vektoren, welche für die Produktion von pBPA-enthaltenden SurA-Proteinen benötigt werden. Da sich während der ersten Versuche herausgestellt hat, dass die vorhandenen Poteinproduktionsstämme nicht für die Produktion von SurA-pBPA-Proteinen geeignet sind, wurde auch ein neuer Protein-Produktionsstamm benötigt und generiert.

4.3.1.1 Auswahl der LamB-Peptide

In den ESR- und Fluoreszenzspektroskopischen Versuchen konnte für das LamB-Peptid Pep46 eine Bindung an die Parvulin-Domäne І von SurA nachgewiesen werden (Kap. 4.1). Aus diesem Grund sollte dieses Peptid als Ausgangspunkt für die nachfolgenden Versuche verwendet werden.

Die zu verwendenden LamB-Fragmente sollten somit die Pep46-Sequenz enthalten und lang genug sein, um ausgehend von einer Bindung in der Parvulin-Domäne Ι von SurA bis in das Chaperon-Modul SurANCt zu reichen, damit man dort gegebenenfalls eine Quervernetzung mit der dort eingeführten künstlichen Aminosäure pBPA erhält. Die Abstände von SurAІ zum Chaperon-Modul SurANCt betragen 25 – 40 Ǻ und der Spalt innerhalb des Core-Moduls SurANІCt hat eine Länge von ~50 Ǻ [Bitto and McKay, 2003]. LamB ist ein Porin der äußeren Membran von E. coli und besteht aus 18 antiparallelen β-Strängen [Schirmer et al., 1995; Dutzler et al., 1996] und Peptide mit 7 Aminosäuren in β-Strang Konformation besitzen eine Länge von ca. 20 Ǻ [Bitto and McKay, 2003]. Ausgehend von der Annahme, dass auch Fragmente des LamB-Proteins wahrscheinlich weitestgehend eine β-Strang Konformation aufweisen werden, wurden Fragmente von 36 bzw. 59 Aminosäuren Länge ausgewählt, damit diese den Spalt des Chaperon-Moduls komplett durchspannen könnten. Auf dieser Basis wurden ausgehend von der Pep46-Sequenz in LamB (rot, Abb. 22) die Peptide Pep46-L (Pep46 mit einer einseitigen Verlängerung des Peptides in C-terminale Richtung, kurz PL) und L-Pep46-L (Pep46 mit beidseitiger Verlängerung des Peptides in C- und N-terminaler Richtung, kurz LPL) festgelegt. Die Primer für die Amplifikation der entsprechenden Sequenzabschnitte durch PCR wurden anhand der LamB-Gensequenz im Leseraster ausgewählt. Durch die gleichzeitige Einführung einer SacІ- Restriktionssite upstream und einer PstІ- Restriktionssite downstream wurde die nachfolgende Klonierung der Fragmente erleichtert.

ERGEBNISSE

Abb. 22: Lage und Aminosäuresequenz der Polypeptide innerhalb der Proteinsequenz. Die LamB-Polypeptide wurden ausgehend von der Sequenz des Peptides Pep46 (DVHMIDFYYWDIS, rot markiert) innerhalb der Gesamtsequenz von LamB ausgewählt. Das Peptid Pep46-L besitzt eine einseitige Verlängerung der Sequenz in C-terminaler Richtung (PL, gelb hinterlegt) und das Peptid L-Pep46-L besitzt Verlängerungen in N- und C-terminale-Richtung (LPL, blau hinterlegt). Die Signalsequenz des LamB-Proteins ist grün markiert.

4.3.1.2 Generierung der OMP-Polypeptid-kodierenden Vektoren pQE-PLStrep und pQE-LPLStrep Quervernetze Komplexe der SurA-Proteine mit den LamB-Fragmenten sollten später leicht und eindeutig identifiziert werden können, indem sowohl das SurA-Protein, als auch das LamB-Fragment unabhängig voneinander im Western Blot nachgewiesen werden können.

SurA lässt sich im Western Blot mit SurA- und mit His-tag-Antikörpern nachweisen, da die in den Versuchen verwendeten SurA-Varianten über einen C-terminalen His-tag verfügen. Diese zusätzliche Detektionsmöglichkeit ist notwendig, da der in der Arbeitsgruppe verwendete SurA-Antikörper lediglich SurA-Fragmente detektiert, die auch mindestens eine der beiden Parvulin-Domänen enthalten. Die isolierte Chaperondomäne SurANCt kann daher nur über den C-terminalen His-tag detektiert werden.

Der Nachweis des LamB-Proteins gestaltete sich schwieriger, da in der Arbeitsgruppe kein geeigneter Antikörper gegen LamB vorhanden war. Aus diesem Grund sollten die Fragmente und das LamB-Protein mit einem Strep-tag versehen werden. Um die entsprechenden Vektoren zu generieren, wurde zunächst ein 79 bp Fragment mit der multiple cloning site und dem Strep-tag ІІ (WSHPQFEK) durch SacI und HindІІІ aus dem Vektor pASKMalEStrep (eigene Arbeitsgruppe) herausgeschnitten. Durch Spaltung mit den gleichen Enzymen wurde der Vektor pQESurASac linearisiert und dabei das surA-Gen und die Sequenz des His-tags entfernt. Lediglich die Sequenz für das SurA-Signalpeptid blieb erhalten. Auf diese Weise könnten die LamB-Peptide gegebenenfalls auch für in vivo-Versuche im Periplasma produziert werden. Durch Klonierung des 79 bp Fragments in den linearisierten pQE-Vektor wurde der Vektor pQEStrep erhalten, der über das SurA-Signalpeptid, eine multiple cloning site und einen Strep-tag verfügte.

Dieser Vektor wurde durch Sequenzierung verifiziert.

Aus dem das lamB-Gen enthaltenden Vektor pPER99 [Rouviere and Gross, 1996] wurden die Fragmente PL (Primer Pep46_Sacfor_new und Pep46_LPst_rev_new), sowie LPL (Primer L_Pep46Sac_for und P46_LPst_rev_new) mit Fragmentgrößen von 140 bp bzw. 200 bp amplifiziert. Die gereinigten Fragmente wurden zunächst in den Vektor pCR^®2.1-TOPO ligiert. Die Fragment-Insertion wurde mittels Kolonie-PCR mit den PCR-Primern und die erfolgreiche Einführung der neuen Restriktionsschnittstellen für SacІ/PstІ mittels Testspaltungen überprüft. Nach Verifizierung der Plasmide durch Sequenzierung wurden die Vektoren pTOPO-PL#4 und pTOPO-LPL#2 erhalten. Die lamB-Genfragmente wurden

ERGEBNISSE

anschließend durch SacІ/PstІ-Spaltung in den Vektor pQEStrep umkloniert. Nach erfolgreicher Testspaltung mit NcoІ und HindІІІ wurden die Vektoren pQE-PLStrep#5 und pQE-LPLStrep#6.2 mittels Sequenzierung als positiv bestätigt.

Die oben beschriebenen Plasmide wurden generiert, da zunächst das in der Arbeitsgruppe bereits etablierte EcoPro^TM T7 System (Merck, Cat. No. 70876; vormals Novagen) zur in vitro Transkription/Translation verwendet werden sollte, welches effizient Proteine downstream sowohl von E. coli- als auch von T7-Promotoren synthetisiert. Zwischenzeitlich war die Produktion dieses Kits jedoch eingestellt worden. Als Alternative wurde das zellfreie System PURExpress^® In Vitro Protein Synthesis Kit der Firma NEB (Cat. No. E6800S) ausgewählt. Dieses Kit bietet den Vorteil gegenüber zellbasierten Kits, dass in seiner definierten Zusammensetzung kein SurA vorhanden ist [Shimizu et al., 2005]. So sind spätere Reaktionen mit bereits im Extrakt vorhandenem SurA ausgeschlossen. Mit diesem Kit ist es zusätzlich möglich, in vitro neu-synthetisierte Proteine durch Affinitätschromatographie von den Bestandteilen des Kits zu trennen, da diese Faktoren alle über einen His-tag verfügen [Shimizu et al., 2005].

Dieses System der zellfreien in vitro Transkription/Translation wurde bereits erfolgreich für Quernvernetzungs-Reaktionen mit pBPA-markiertem Trigger Faktor benutzt [Lakshmipathy et al., 2007].

4.3.1.3 Generierung der Vektoren pTOPO-PLStrep, pTOPO-LPLStrep und pTOPO-LamB

Für das PURExpress^® In Vitro Protein Synthesis Kit werden Vektoren benötigt, in denen die zu exprimierenden Gene unter Kontrolle des T7-Promotors stehen. Daher wurden die für das EcoPro^TM T7 System generierten pQE-Vektoren als Ausgangspunkt genommen, um die gewünschten Sequenzen in den Vektor pCR^®2.1-TOPO umzuklonieren.

Der in der Arbeitsgruppe vorhandene Vektor pTOPO-TolC SD7 wurde durch EcoRІ und HindІІІ linearisiert (~ 3000 bp) und mit den EcoRІ/HindІІІ-Fragmenten aus PLStrep (270 bp), pQE-LPLStrep (340 bp) bzw. pPER99 (1420 bp) ligiert. Zur Überprüfung der erhaltenen Klone wurde eine Kolonie-PCR mit den Primern M13U und M13R durchgeführt. Durch Sequenzierung wurden die Vektoren pTOPO-PLStrep#12, pTOPO-LPLStrep#4 und pTOPO-LamB#2 verifiziert.

In ersten Versuchen mit den Vektoren pTOPO-PLStrep, pTOPO-LPLStrep und pTOPO-LamB im PURExpress-Kit ließen sich im Western Blot mit dem Strep-tag-Antikörper keine Produkte nachweisen (data not shown). Hingegen war von den Plasmiden pTOPO-PLStrep und pTOPO-LPLStrep in E. coli generiertes Produkt mittels Western Blot mit dem Strep-tag-Antikörper in Zellrohextrakten nachweisbar (Abb. 23a). Daher wurde angenommen, dass die im in vitro-System erhaltene Konzentration der relativ kleinen Fragmente für die Detektion mittels Western Blots zu gering ist. Daher wurde die Analyse zunächst mittels Autoradiographie unter radioaktiver Markierung mit ³⁵S-Methionin (Hartmann Analytics) durchgeführt.

4.3.1.4 Autoradiographie von in vitro synthetisiertem LamB-Protein

Da die kleinen LamB-Fragmente PLStrep bzw. LPLStrep generell schwieriger nachzuweisen sind, als größere Protein-Fragmente bzw. Gesamtproteine, wurde zunächst ein Test mit dem LamB-kodierenden Vektor pTOPO-LamB, sowie dem YaeT-kodierenden Vektor pTOPO-YaeT unter Zugabe von ³⁵

S-ERGEBNISSE

Methionin durchgeführt. LamB und YaeT sind beides β-Fassartige Proteine der äußeren Membran von E. coli. LamB hat in seiner denaturierten monomeren Form eine Größe von ca. 47 kDa. YaeT wurde hier zusätzlich analysiert, da dieses integrale Außenmembranprotein mit ~ 90 kDa relativ groß ist und aufgrund der daraus resultierenden größeren Anzahl an Methionin-Resten leichter zu detektieren sein sollte. Für das PURExpress^® In Vitro Protein Synthesis Kit (NEB) wird eine Plasmidkonzentration von 250 ng/Reaktionsansatz empfohlen. Um die beste Plasmidkonzentration für die maximale Proteinausbeute zu erhalten, wurde der Vektor pTOPO-LamB in aufsteigenden Plasmidkonzentrationen von 50 ng bis 1 µg pro Versuchsansatz in einer Versuchsreihe eingesetzt.

Die Ansätze wurden wie unter 3.2.8 beschrieben, zusammen gegeben und für 2 h bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden mit einer 12,5 %igen SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend wie unter 3.4.3 beschrieben weiter behandelt. Das Imaging Plate wurde abschließend in einem BasReader (FLA-2000) abgescannt und die Bilder mit Hilfe der Software AIDA Image Analyzer gespeichert.

Wie in Abb. 23b zu sehen, erhält man mit 250 – 500 ng eingesetzten Plasmid die maximale Proteinmenge an LamB. Dies wird durch weitere Plasmidzugabe nicht weiter gesteigert. Generell konnten mit den Vektoren pTOPO-LamB und pTOPO-YaeT jedoch nur relativ geringe Mengen an Protein detektiert werden. Ein Grund könnte sein, dass der Vektor pCR^®2.1-TOPO (Invitrogen) keine T7-Terminator-Sequenz besitzt und es dadurch zu Kapazitätsverlusten kommen kann. Nach Rücksprache mit der Firma NEB wurden weitere Versuche mit verschiedenen PCR-Produkten und run off-Transkripten durchgeführt.

Diese führten jedoch zu keinem zufrieden stellenden Ergebnis.

Abb. 23: Detektion der Fragmente PL und LPL, sowie des Proteins. a) Immunodetektion der längeren LamB-Peptide PL und LPL. Die LamB-Peptide wurden in E. coli produziert und die Rohextrakte im Western Blot mit Strep-tag-Antikörpern analysiert. Hierbei konnten die Peptide erwartungsgemäß im Bereich der 10 kDa-Bande nachgewiesen werden. Im oberen Bereich des Western Blots sind noch weitere unspezifische Banden zu sehen, bei denen es sich vermutlich um Kreuzreaktionen handelt. b) Titration der Plasmidmenge von pTOPO-LamB zur Erhaltung der maximalen Ausbeute des Proteinproduktes im PURExpress^® In Vitro Protein Synthesis Kit (NEB) und autoradiographische Detektion. Als Kontrollvektor wurde pTOPO-YaeT analysiert, da das resultierende YaeT-Protein relativ groß ist und über eine große Anzahl an Methioninresten verfügt, die bei der Autoradiographie detektiert werden. Die größte Menge an LamB-Protein erhält man mit einer eingesetzen Plasmidkonzentration von 250 – 500 ng/Reaktionsansatz. Generell ist die erhaltene Proteinausbeute jedoch relativ gering.

ERGEBNISSE

4.3.1.5 Generierung der Vektoren pEXP5-CT/PLStrep, pEXP5-CT/LPLStrep und pEXP5-CT/LamB Um die Proteinausbeute weiter zu optimieren, wurde eine weitere Umklonierung der Genfragmente in den pEXP5-CT/TOPO^®-Vektor der Firma Invitrogen vorgenommen. Dieser optimierte Klonierungsvektor wird im Zusammenhang mit dem Expressway Mini Cell-Free E. coli Expression System angeboten (Invitrogen, pEXP5-CT/TOPO^®, #V960-06). Dieser T7-basierte Vektor ermöglicht laut Hersteller die schnelle, direkte Insertion von mit Taq-Polymerase amplifizierten PCR-Fragmenten und die anschließende Expression von rekombinanten Proteinen in Zell-freien Systemen oder in E. coli (Invitrogen, Benutzerhandbuch pEXP5-CT/TOPO^® TA Expression Kits, #V960-06).

Alternativ kann man mittlerweile auch das DHFR-Kontrollplasmid aus dem modifizierten PURExpress-Kit als Klonierungsvektor einsetzen, da dieser die erforderliche Zusammensetzung für eine maximale Proteinausbeute besitzt und darüber hinaus über eine multiple cloning site verfügt (NEB, #E6800S). Zum Zeitpunkt der Versuche stand diese Variante noch nicht zur Verfügung und die DNA-Sequenzen der LamB-abgeleiteten Fragmente Pep46-LStrep (PL) und L-Pep46-LStrep (LPL), sowie von Vollängen-LamB wurden in den pEXP5-CT/TOPO^®-Vektor integriert.

Die Gene für die LamB-Fragmente PLStrep (218 bp) und LPLStrep (284 bp) wurden mit den Primern YMLamB1 und YMLamB2 aus den Plasmiden pTOPO-PLStrep#12 bzw. pTOPO-LPLStrep#4 amplifiziert. Das lamB-Gen wurde mit den Primern YMLamB3 und YMLamB4 aus dem Vektor pTOPO-LamB#2 amplifiziert. Die gereinigten Fragmente wurden direkt in den Vektor pEXP5-CT/TOPO^® ligiert. Nach Kolonie-PCR mit den Primern LamB1 und T7TermRev für die Amplifikation der Fragmente PL (364 bp) bzw. LPL (430 bp), sowie mit den Primern LamB3 und T7TermRev für das LamB-Fragment (1491 bp) wurden die Vektoren CT/PLStrep#1, CT/LPLStrep#4 und pEXP5-CT/LamB#2 zusätzlich durch Sequenzierung bestätigt und für die weiteren Versuche eingesetzt.

4.3.2 In vitro Transkription/Translation von LamB-Polypeptiden und des LamB-Proteins