Analyse der Funktionalität und der Sekundärstruktur des Proteins SurAΙ_M231C

wie in Kap. 4.1.3 beschrieben, eine Interaktion des Proteins SurAΙ_M231C-MTSSL mit Peptiden in der ESR-Spektroskopie analysiert wurde. In den Untersuchungen konnte jedoch keine Interaktion mit den verwendeten Peptiden nachgewiesen werden. Daraufhin wurde einerseits die Kapazität des Proteins SurAΙ_M231C zur Bindung von Peptid in einem Fluoreszenz-basierten Assay, andererseits die Ausprägung der Sekundärstruktur mittels Cicular Dichroism Spectroscopy (CD-Spektroskopie) untersucht.

4.1.4.1 Analyse der Sekundärstrukturen der Proteine SurAІ und SurAІ_M231C mittels Circular Dichroism Spectroscopy (CD-Spektroskopie)

Das Defizit von SurAΙ_M231C zur Bindung von Peptid könnte durch eine durch die Mutation M231C induzierte Änderung der Protein-Konformation zu erklären sein. Um dies näher zu untersuchen wurden die Proteine SurAІ und SurAІ_M231C anhand ihrer Sekundärstruktur miteinander verglichen.

Eine geeignete Methode für die Analyse der Sekundärstruktur ist die Circular Dichroism Spectroscopy (CD-Spektroskopie). Mit ihrer Hilfe kann man Aussagen darüber treffen, ob zwei Proteine gleich bzw. ähnlich gefaltet sind und den Gehalt an gefalteten und ungefalteten Bereichen miteinander vergleichen [Simpson, 2008]. Aus der Intensität und dem Verlauf von CD-Signalen ist es möglich Rückschlüsse über konformationelle Änderungen zu treffen [Kelly, 2006]. Da in der Arbeitsgruppe die dafür notwendige Expertise nicht vorhanden war, wurden diese Versuche in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von PD Dr. Jörg Kleinschmidt (Fachbereich Biologie: Biophysik der Faltung von Membranproteinen, Universität Konstanz, heute Kassel) durchgeführt.

Um aussagekräftige CD-Spektren zu erhalten, müssen die Proteine möglichst rein und in einem Puffer gelöst sein, der möglichst wenig im UV-Bereich absorbiert [Kelly et al., 2005]. Daher wurden die in E. coli rekombinant produzierten und chromatographisch mittels IMAC und Gelfiltration gereinigten Proteine über Nacht gegen 10 mM HEPES, pH 8,0 dialysiert. Die Messung der CD-Spektren und die anschließende Auswertung erfolgten durch PD Dr. Kleinschmidt und seine Mitarbeiter an der Universität Konstanz (heute Kassel).

SurAІ und SurAІ_M231C wiesen in der CD-Spektroskopie eine vergleichbare Linienform auf (Abb. 16).

Dies spricht dafür, dass Wildtyp und Mutante die gleiche Sekundärstruktur besitzen und aus diesem Grund sehr wahrscheinlich auch identisch gefaltet sind. Unterschiede in der Amplitude können aller Wahrscheinlichkeit nach auf leicht unterschiedliche Konzentrationen der Proteine zurückzuführen sein.

Aufgrund des ungleich höheren Signal-zu-Rausch Verhaltens im Bereich 195 – 200 nm des Protein-CD- Spektrums weist das Wildtyp-SurAІ-Protein eine etwas veränderte Linienform auf. Hierbei handelt es sich um ein Artefakt, welches bisher nicht eliminiert werden konnte (persönliche Kommunikation mit PD Dr.

J. Kleinschmidt).

Die detailliertere Analyse der Zusammensetzung der Sekundärstruktur ergab für beide Proteine einen β-Faltblatt-Anteil von etwa 29 – 32 %, welches weitestgehend mit dem Wert aus der Kristallstruktur übereinstimmt (ca. 28 %). Die α-helikalen Anteile betrugen zwischen 15 – 16 %.

ERGEBNISSE

Abb. 16: Sekundärstrukturanalyse von SurAІ und SurAІ_M231C mittels Circular Dichroism Spectroscopy (CD-Spektroskopie). Dargestellt sind die CD-Spektren von SurAІ und SurAІ_M231C, die nach der Analyse in der Abteilung von PD Dr. J. Kleinschmidt (Universität Konstanz) erhalten wurden. Aus der vergleichbaren Linienform kann man schließen, dass SurAІ-Wildtyp und SurAІ_M231C die gleiche Sekundärstruktur aufweisen. Unterschiede in der Amplitude sind wahrscheinlich auf leicht unterschiedliche Konzentrationen der beiden Proteine zurückzuführen. Bei der, aufgrund des höheren Signal-zu-Rausch Verhältnisses im Bereich 195 – 200 nm veränderten Linienform von SurAІ handelt es sich um ein Artefakt.

Möglicherweise ist die CD-Analyse hier nicht ganz korrekt, denn laut der Kristallstruktur erhält man einen höheren Anteil an α-Helices (ca. 35 %). Dies könnte jedoch auch durch Fehlinterpretationen des verwendeten Programms zur Analyse der Kristallstruktur begründet werden, da dieses möglicherweise kurze Turns fälschlicherweise als Helices identifiziert (persönliche Kommunikation PD Dr. J.

Kleinschmidt).

Da beide Proteine in dieser Analyse weitestgehend in ihrer Sekundärstruktur übereinstimmen, wurde eine Störung der Faltung als Grund für die nicht messbare Peptidbindung ausgeschlossen.

4.1.4.2 Analyse der Interaktion von SurAІ und SurAІ_M231C mit fluoreszenzmarkierten Peptiden Zur Überprüfung, ob SurAІ_M231C noch in der Lage ist Peptide zu binden, wurde ein Fluoreszenz-basierter Assay durchgeführt. In der Dissertation von Gerrit Hennecke und in verschiedenen anderen Publikationen wurde gezeigt, dass ein IAANS-markiertes Peptid genutzt werden kann, um eine Interaktion mit einem Protein zu beobachten [McCarty et al., 1996; Mayer et al., 2000; Patzelt et al., 2001;

Hennecke, 2006]. Das Fluorophor IAANS (2-(4-iodoacetamido) Anilino-Naphtalen-6-Sulfonsäure) ist für Bindungsstudien von Peptiden an Proteine geeignet, da es in Wasser eine relativ geringe Fluoreszenz aufweist. Die Intensität der Fluoreszenz steigt jedoch rapide an, wenn das Fluorophor in eine weniger polare Umgebung überführt wird, was man als extrinsische Fluoreszenz bezeichnet [Freifelder, 1982].

IAANS wurde durch chemische Synthese an das C-terminale Cystein des Peptides Pep46 (DVHMIDFYYWDISC) gekoppelt. Dieses Peptid entstammt einer LamB-Peptid-Bibliothek, besitzt ein Ar-x-Ar-Motiv (Ar = aromatische Aminosäure) und ist als starker SurA-Binder identifiziert worden [Hennecke, 2006]. Bindet solch ein Fluorophor-markiertes Peptid an SurAІ, sollte sich die

ERGEBNISSE

Quantenausbeute Q, also das Verhältnis von emittierten zu absorbierten Photonen, erhöhen. Es wurde in Fluoreszenz-basierten Kompetetions- und Affinitätsstudien bereits gezeigt, dass Pep46-IAANS eine spezifische Bindung sowohl mit SurA, als auch mit der Parvulin-Domäne ІІ defizienten Variante SurANІCt eingeht [Hennecke, 2006].

Zunächst wurden SurAІ und SurAІ_M231C rekombinant produziert. Von SurAІ_M231C wurde eine Hälfte mit dem spin-label MTSSL markiert, die andere Hälfte lag ungelabelt vor. Die Versuche wurden nach zusätzlicher Reinigung mittels Gelfiltrations-Chromatographie durchgeführt. Für die Untersuchung der Interaktion durch Fluoreszenzspektroskopie wurden Ansätze der Proteine SurAІ, SurAІ_M231C bzw.

SurAІ_M231C-MTSSL (jeweils 400 nM) mit und ohne Peptid Pep46-IAANS (400 nM) bzw. die Peptide ohne Protein für 1 h bei 30°C inkubiert. Im Anschluss wurde das Emissionsspektrum von 350 – 600 nm nach Anregung der Proben bei 335 nm gemessen (Fluoreszenzspektrophotometer RF-5301 PC, Shimadzu). Das Maximum der Emission lag bei ca. 450 nm. Die dargestellte Fluoreszenzintensität ist die Differenz zwischen dem gemessenen Wert und der Fluoreszenzintensität des jeweiligen markierten Peptids ohne die Zugabe von Protein [McCarty et al., 1996].

Die Proteine SurAІ, SurAІ_M231C bzw. SurAІ_M231C-MTSSL zeigten bei den Messungen keine Eigenfluoreszenz (Abb. 17). Die Kombination von SurAІ mit Pep46-IAANS führte zu einem starken Anstieg der Fluoreszenz, was auf einen Protein-Peptid-Komplex schließen lässt.

Abb. 17: Analyse der Interaktion von IAANS-markiertem Peptid mit SurAІ-Proteinen. Dargestellt sind die Fluoreszenzspektren von SurAІ, SurAІ_M231C bzw. SurAІ_M231C-MTSSL mit dem fluoreszenzmarkierten Peptid Pep46-IAANS (DVHMIDFYYWDISC-Pep46-IAANS) nach Abzug des Spektrums des markierten Peptids ohne Protein. Die Proteine wurden in äquimolaren Mengen mit den IAANS-markierten Peptiden (je 400 nM) zur Erzeugung von Protein-Peptid-Komplexen für 1 h bei 30°C in F-Puffer inkubiert. Der SurAІ-Pep46-IAANS-Komplex führte zu einem starken Anstieg der Fluoreszenz-Intensität, was ein Zeichen für die Bindung des Peptides an diese Domäne ist. Für die Varianten mit der M231C-Mutation wurde ein wesentlich geringerer Fluoreszenz-Wert beobachtet. Somit ist diese Variante signifikant in ihrer Fähigkeit Peptide zu binden eingeschränkt.

ERGEBNISSE

Diese Ergebnisse, in Kombination mit den Daten aus der ESR-Spektroskopie, deuten stark darauf hin, dass sich die Interaktionsstelle für Pep46 in der PPIase-Domäne І von SurA befindet. Für die Proteine SurAІ_M231C und SurAІ_M231C-MTSSL zusammen mit Pep46-IAANS war nur ein moderater Anstieg der Fluoreszenz zu beobachten. Das Maximum der Quantenausbeute war ca. 4 – 7-mal niedriger als bei der unmutierten Variante SurAІ. Dies spricht dafür, dass SurAІ_M231C in geringem Maße in der Lage ist, Peptid zu binden. Aber die Mutation M231C schränkt die Fähigkeit zur Peptidbindung vermutlich so stark ein, dass diese in der EPR-Spektroskopie nicht mehr zu detektieren ist.

4.2 Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen mittels des