Isolierung von Proteinen aus E. coli

3.4.4.1 Isolierung von Proteinen aus dem Periplasma von E. coli im präparativen Maßstab

Aus einer Einzelkolonie des entsprechenden Produktionsstamm wurde eine 50 ml Vorkultur in mit Antibiotikum komplementiertem LB-Medium hergestellt. Von dieser Kultur wurden 10 – 15 ml verwendet, um eine 1 l Kultur von mit Antibiotikum komplementiertem LB-Medium anzuimpfen und diese bei 37°C auf einem Schüttler bei 115 Upm zu inkubieren. Zur besseren Belüftung der Kultur wurden 3 l-Schikanekolben verwendet. Bei einer OD600 von 0,2 – 0,25 wurde die Proteinproduktion durch Zugabe des Induktors Tetrazyklin in einer Endkonzentration von 10 µg/ml gestartet. Wegen der Tetrazyklin-Resistenz des verwendeten Stammhintergrundes konnte dieses Antibiotikum verwendet werden. Das weitere Wachstum erfolgte bei 30°C bis zu einer OD600 von mindestens 1. Im Anschluss wurden die Zellen in gekühlten Zentrifugenbechern geerntet (Avanti, 9.000 Upm, 15 min, 4°C). Ab diesem Punkt wurde immer auf Eis und mit gekühlten Puffern gearbeitet, um die Stabilität der Proteine zu gewährleisten. Das Zellpellet wurde in 50 – 100 ml Sucrose-Puffer resuspendiert und für 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation (Avanti, 9.000 Upm, 10 min, 4°C) wurde das Feuchtgewicht der Zellen bestimmt und diese in 10 ml Sucrose-Puffer pro Gramm Feuchtgewicht aufgenommen. Nach Zugabe von

METHODEN

Lysozym (Endkonzentration 10 µg/ml) und 0,5 M EDTA, pH 8,0 (Endkonzentration 1 mM) folgte ein 30minütige Inkubation. Die dadurch destabilisierte äußere Membran wurde durch Zufügen von 1 M MgSO4 (Endkonzentration 20 mM) wieder stabilisiert. Durch anschließende Zentrifugation (Avanti, 14.000 Upm, 30 min, 4°C) wurden unlösliche Proteine und Spherolblasten entfernt und der klare Überstand mit der periplasmatischen Fraktion in ein 50 ml Falcon Röhrchen überführt. Bis zur weiteren Verwendung wurde dies auf Eis gelagert.

3.4.4.2 Isolierung von Proteinen aus dem Cytoplasma von E. coli im präparativen Maßstab

Die Produktion und Isolation der Proteine aus dem Cytoplasma erfolgte weitgehend wie unter 3.4.4.1 für die Isolierung aus dem Periplasma beschrieben. Zusätzliche wurde nach der Destabilisierung der äußeren Membran durch Lysozym und EDTA auch die innere Membran aufgeschlossen. Hierzu wurde die Zellsuspension nach der 30minütigen Inkubation auf Eis in ein 50 ml Tube BigB Lysing Matrix (MP Biochemicals) überführt. Der Zellaufschluss erfolgte in einem Zellhomogenisator (Fast Prep^®-24, MP) in 4 Zyklen bei Stufe 6,0 für 30 sek mit jeweils 5 min Pause auf Eis. Nach Entfernung der BigB Lysing Matrix (Heraeus Multifuge, 4.000 Upm, 5 min, 4°C) wurde der Überstand nochmals zentrifugiert (Avanti, 14.000 Upm, 30 min, 4°C). Der geklärte Überstand wurde in ein 50 ml Falcon Röhrchen überführt und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert.

3.4.4.3 Isolierung von pBPA-Proteinen aus dem Periplasma von E. coli im präparativen Maßstab

Aus einer Einzelkolonie des mit den entsprechenden Plasmiden transformierten Produktionsstammes YM10219 wurde eine 50 ml Vorkultur in mit Antibiotikum komplementiertem LB-Medium hergestellt.

Von dieser Kultur wurden 20 ml abzentrifugiert (Heraeus Multifuge, 4000 Upm, 10 min) und das Pellet in 5 ml LB-Medium resuspendiert. 1 l LB-Medium wurde in einem 3 l Schikanekolben für ca. 1 h bei 37°C vorgewärmt. Dieser Schritt ist wichtig, da pBPA ausfällt, wenn das Medium kalt ist oder der Kolben nicht direkt nach der Zugabe geschwenkt wird (eigene Beobachtungen & [Farrell et al., 2005]). Nach Komplementierung mit den Anibiotika Ampicillin (100 µg/ml) und Chloramphenicol (25 µg/ml) und der unnatürlichen Aminosäure pBPA (0,2 mM), wurde das Medium beimpft und die Kultur bei 37°C auf einem Schüttler (115 Upm) inkubiert. Bei einer OD600 von 0,6 – 0,8 wurde die Proteinproduktion durch Zugabe der Induktoren Arabinose (0,2 %, für pEVOL-pBpF) und Tetrazyklin (10 µg/ml, für pASK-Vektoren) gestartet. Wegen der Tetrazyklin-Resistenz des verwendeten Stammhintergrundes konnte dieses Antibiotikum verwendet werden. In eigenen Versuchen hat sich gezeigt, dass man eine höhere Protein-Ausbeute erhielt, wenn beide Induktoren zugesetzt wurden. Das weitere Wachstum erfolgte über Nacht (ca. 14h) bei 30°C und 115 Upm.

Die nachfolgende Präparation der pBPA-haltigen Proteine erfolgte wie unter 3.4.3.1 (Periplasma) bzw.

3.4.3.2 (Cytoplasma) beschrieben.

METHODEN

3.4.5 Reinigung von Proteinen

3.4.5.1 Reinigung über immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie (IMAC)

Die Aufreinigung über immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie (IMAC) erfolgte für Proteine mit einer terminalen Oligohistidinsequenz. Hierzu wurden ca. 4 ml Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia) zweimal mit mindestens 10 ml H2Odd gewaschen. Anschließend wurde die Säulenmatrix mit 1 Vol 100 mM Nickelchlorid-Lösung schwenkend 5 min inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit mindestens 10 ml H2Odd folgte die Äquilibrierung mit Sucrose-Puffer. Die Bindung der in Sucrose-Puffer gelösten Proteine an die vorbereitete Säulenmatrix erfolgte über Nacht kühl schwenkend.

Am nächsten Tag wurde diese Suspension in eine leere Säule gegeben. Zunächst wurde die Säulenmatrix mit den gebundenen Proteine mit jeweils 250 ml Puffer A, pH 8,0 mit 0, 5 bzw. 10 mM Imidazol gewaschen. Anschließend wurden die Proteine schrittweise durch steigende Imidazol-Konzentration in Puffer A, pH 8,0 eluiert. Die Elution erfolgte mit je 15 ml 15, 20 und 40 mM sowie je 10 ml 80, 150 und 300 mM und 5 ml 500 mM Imidazol. Aliquots ausgewählter Fraktionen wurden mit SDS-PAGE analysiert. Die Säulenmatrix wurde wie beschrieben regeneriert, bevor sie wieder verwendet werden konnte.

3.4.5.2 Proteinreinigung mittels Gelfiltrations-Chromatographie

Zur weiteren Reinigung der Proteine und um ein Dialysieren zu vermeiden, wurde zusätzlich zur IMAC-Reinigung eine Gelfiltrations-Chromatographie durchgeführt. Diese Art der IMAC-Reinigung beruht auf dem Prinzip der Auftrennung nach Molekülgröße. Die verwendete Säulenmatrix (Superdex, GE Healthcare) besteht aus einem aus vernetztem Dextran und Agarose porenhaltigen Material, welches ein längere Verweildauer von kleineren Molekülen bedingt [Kågedal, 1991]. So werden kleinere Moleküle später eluiert als größere Moleküle, die nicht so tief in die Matrix eindringen können. Dieses Verfahren stellt eine schonende Möglichkeit zur Reinigung von Proteinen dar, da im Gegensatz zu HPLC-Methoden keine Denaturierung der Proteine stattfindet und das Protein in einem adäquaten Puffer ohen zusätzliche Lösungsmittel eluiert wird.

Für die Auftrennung wurde eine Superdex 200 10/30 Säule (GE Healthcare) an eine Äkta Explorer (GE Healthcare) angeschlossen, die den Puffer über die Säule gepumpt hat. Es wurden 250 bzw. 500 µl Fraktionen gesammelt, mittels SDS-PAGE analysiert und die Protein enthaltenden Fraktionen eingeengt.

Für die SurA-Variante SurA_H68C-Thrombin-His wurde die Gelfiltrationssäule mit Thrombinspaltpuffer äquilibriert und die Gelfiltration, sowie die Analyse per SDS-PAGE, wie oben beschrieben durchgeführt.

Im Anschluss wurden die SurA-Fraktionen vereinigt und über Nacht die Spaltung durch Thrombin durchgeführt, um den C-terminalen His-tag des Proteins zu entfernen. Ungespaltene SurA-His-Proteine und der abgespaltende His-tag wurden durch IMAC entfernt. Das Thrombin wurde durch Bindung an pABA entfernt. Die Proben wurden danach über Nacht gegen Puffer A, pH 8,0 dialysiert.

METHODEN

3.4.5.3 Konzentration von Proteinlösungen mit Centriprep-Konzentratoren

Um Proteinlösungen unter nicht-denaturierenden Bedingungen einzukonzentrieren, wurden Centriprep-Konzentratoren unterschiedlichen Volumens mit einer adäquaten molekularen Ausschlussgröße eingesetzt. Die einzuengende Proteinlösung wurde direkt auf die Membran des Centriprep-Konzentrators (Millipore) gegeben und nach Herstellerangaben bis zum gewünschten Volumen in einer Heraeus Multifuge bei 4°C zentrifugiert.

3.4.5.4 Dialyse von Proteinlösungen

Für die Umpufferung einer Proteinlösung wurde diese in einen Dialyseschlauch mit einer Ausschlussgröße von 12.000 M (Roth) überführt, fest verschlossen und über Nacht im Kühlraum im 1.000fachen Volumen des gewünschten Puffers leicht gerührt.

3.4.5.5 Lagerung der SurA-Proteine

Die gereinigten Proteine wurden als wässrige Lösung in Eppendorf Reaktionsgefäßen für einige Tage bis Wochen auf Eis gelagert.