Nachweis von STEC

Zum Nachweis von STEC stehen heutzutage kulturelle, molekularbiologische und immunologische Verfahren mit etlichen Vor- und Nachteilen zur Verfügung, von denen nachfolgend nur einige wichtige exemplarisch erwähnt werden. Während man nach bekannt werden des ersten EHEC-Ausbruches primär die Diagnostik von O157-Serovaren vorantrieb, ist man mittlerweile daran interessiert, eine praktikable Serovar-übergreifende Diagnostikmethode zu etablieren. Dies jedoch erschwert einen traditionell kulturellen Nachweis, da STEC eine hohe biochemische Ähnlichkeit zur physiologischen Darmflora aufweisen und sowohl in klinisch Erkrankten wie auch in Reservoirwirten nur einen kleinen Anteil der vorhandenen E. coli ausmachen (1/300 Bakterien) (KARCH et al. 1996a). Somit stößt auch der Einsatz von Selektivmedien aufgrund des starken Überwiegens der Begleitflora in Stuhl- und Kotproben an Grenzen.

2.2.2.1 Direkter Erregernachweis

Eine beliebte Diagnostikmethode, die i.d.R. zum Nachweis von O157:H7 genutzt wird stützt sich auf die Tatsache, dass dieser Serotyp im Gegensatz zu 95% der physiologischen E. coli-Flora kein Sorbit verstoffwechseln kann. So wachsen Sorbitol negative STEC-Stämme auf dem altbewährten Sorbitol-McConkey-Agar, der als einzige Kohlenhydratquelle Sorbit enthält, als farblose bis graue Kolonien, während Sorbitol positive Stämme als pink-farbene Kolonien erscheinen. Um die Spezifität des Nährmediums zu steigern werden diesem häufig zusätzlich Antibiotika, wie z.B.

Cefixim und Tellurit zugesetzt, welche das Wachstum der Begleitflora hemmen (ZADIK et al. 1993). Allerdings sind mittlerweile eine große Anzahl an sorbitfermentierenden STEC-Serovare bekannt, welche sich auf dem beschriebenen Nährmedium von komensaler Darmflora nicht unterscheiden, was die kulturelle

Identifikation solcher Stämme auf diesem Nährboden unmöglich macht (KARCH et al. 1996a).

Eine Alternative stellt der Enterohämolysin-Agar dar, bei dem man sich die Ausprägung des enterohämolytischen Phänotyps zu Nutze macht. Die meisten non-O157-STEC-Stämme hämolysieren, ebenso wie das Serovar O157:H7, gewaschene Schaf- oder Humanerythrozyten in Abhängigkeit von Calcium und bilden auf dem Enterohämolysin-Agar eine inkomplette Hämolysezone um die Bakterienkolonie. Da laut BETTELHEIM (1995) und BEUTIN (1989) eine enge Assoziation zwischen Shigatoxin- und Enterohämolysinproduktion besteht, sieht BETTELHEIM in dem Enterohämolysin-Agar eine adäquate Diagnostikmethode zur Identifizierung von STEC-Isolaten. Allerdings prägt nur jedes vierte EHEC-Isolat den hämolytischen Phänotyp aus, die anderen sind oft Träger des sog. „stillen“ EHEC-Hämolysin Gens und zeigen auf dem Enterohämolysin-Agar deshalb keine Hämolysezone. Sie entziehen sich somit der Detektion (KARCH et al. 1996a).

Des Weiteren stehen heutzutage sog. chromogene Nährmedien zur Verfügung, die neben Sorbit chromogene Substrate für Glucuronidase und/oder ß-D-Galactosidase als Marker einsetzten. Allerdings sind diese Nährmedien sehr teuer, was den Einsatz beschränkt.

2.2.2.2 Immunomagnetische Separation (IMS)

Bei der immunomagnetische Separation (IMS) handelt es sich eher um eine Anreicherungsmethode als um ein Nachweisverfahren. Für die IMS werden magnetische Partikel, die mit Antikörper gegen spezifische Oberflächenantigene behaftet sind, sog. immunomagnetische Beads, eingesetzt. Diese Beads binden an das entsprechende O-Antigen und lassen sich durch Anlegen eines magnetischen Feldes separieren. Durch mehrmaliges Waschen werden begleitende Keime entfernt.

Mit dem sehr sensitiven Verfahren ist es möglich 100 EHEC pro Gramm Stuhl in Gegenwart von 10⁷ nicht enterohämorrhagischen E. coli zu detektieren. Jedoch kann man auch mit dieser Methode keine EHEC-Reinkultur gewinnen, so dass der Einsatz eines Selektivmediums auch hier nicht ausbleibt (KARCH et al. 1996a; KARCH et al.

1996b). Waren bis vor kurzem nur immunomagnetische Beads für

Oberflächenantigene der O157-Serogruppe kommerziell erhältlich, so sind mittlerweile auch Beads für die Serovare O111, O145, O26 und O103 im Handel.

2.2.2.3 Toxinnachweis

Die Bildung von Shigatoxinen ist allen STEC gemein, weshalb der Toxin- bzw. der Toxingennachweis von größtem diagnostischem Interesse ist. Ziel ist es deshalb, eine Erregerisolierung kombiniert mit einem Toxin- und/ oder Toxingennachweis zu liefern (www.rki.de, Informationsblätter für Ärzte). Zur Detektion von Shigatoxin bzw.

stx stehen folgende gut etablierte Methoden zu Verfügung:

Verozelltoxizitätstest: Verozellen werden hierbei mit dem Kulturüberstand überschichtet und nach ca. 48-72 h Inkubation die cytotoxischen Effekte an den Verozellen beurteilt. Der Test ist in Kombination mit einem Neutralisationstest sehr sensitiv und spezifisch, allerdings auch sehr zeitintensiv (FRIEDRICH et al. 2002).

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)/ Enzymimmunoassay (EIA): ELISA- oder EIA-Testsysteme sind in großer Variation kommerziell erhältlich. Sie sind schnell und einfach anzuwenden und weisen in Kombination mit anderen Screeningverfahren (PCR, Verozelltoxizitätstest) oder einem kulturellen Nachweis eine ausreichende Sensitivität und Spezifität auf. Die meisten erhältlichen Testsysteme arbeiten mit zwei monoklonalen Stx-Antikörpern. Der erste ist fest auf dem Testsystem fixiert, an ihm bindet das Antigen. Der zweite Antikörper ist mit einem Enzym (Meerrettich-Peroxidase oder Alkalische Phosphatase) gekoppelt, was nach Bindung mit dem Antigen und nach Zugabe eines spezifischen Substrates zu einer Farbreaktion führt. Die Toxine Stx 1 und Stx 2 können von den meisten Testsystemen getrennt voneinander nachgewiesen werden.

Colonyblot: Der Colonyblot eignet sich sowohl zum Toxingen-Nachweis als auch gleichzeitig zum Erregernachweis. Mittels einer Shigatoxin-spezifischen Gensonde kann auf Nitrocellulosemembran gebundene, stx-tragende Bakterien-DNA sichtbar gemacht werden. Dies geschieht durch radioaktive Markierung oder enzymatische Reaktionen (HULL et al. 1993; KARCH H. et al. 1986). Die als stx-positiv identifizierten Kolonien können von der geblotteten Agarplatte isoliert werden. Das Verfahren ist sensitiv, jedoch auch recht zeitintensiv und deshalb für die Routinediagnostik nur bedingt geeignet.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR): Die PCR ist eine weitverbreitete, nicht nur in der STEC-Diagnostik genutzte Methode, die in den meisten Diagnostiklaboren routinemäßig eingesetzt wird. Ebenso wie der ELISA oder EIA kann die PCR zur Serovar- unabhängigen Toxingen-Diagnostik eingesetzt werden. Diverse Protokolle wurden zu diesem Zweck bereits etabliert (FRANCK et al. 1998a; MONDAY et al.

2007; PATON u. PATON 1998; WANG et al. 2002).

Da die EHEC/STEC-Diagnostik bundesweit nicht einheitlich geregelt ist, wurde im Jahre 2000 ein sog. Stufenplan der EHEC-Diagnostik vom Arbeitskreis „EHEC“ des Robert-Koch Instituts (RKI), dem Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) mit Unterstützung der Fachgruppe

„Gastrointestinale Infektionen“ der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) entwickelt (FRUTH et al. 2000). Der Plan sieht folgende drei Diagnostikstufen vor:

Stufe 1: Screening auf Shigatoxinbildner durch Anreicherung der Probe in einem EHEC-Direktmedium mit anschließendem Toxinnachweiß mittels ELISA. Im positiven Fall wird eine Verdachtsdiagnose an das zuständige Gesundheitsamt gestellt und Stufe 2 des Plans wird eingeleitet.

Stufe 2: Isolierung und Charakterisierung der EHEC-Bakterien. Der ELISA-Befund wird durch PCR bestätigt und durch einen Colony-Immunoblot wird das entsprechende Agens isoliert. Eine Serotypisierung folgt.

Stufe 3: Typisierung der Erregerisolate zu epidemiologischen Zwecken durch Lysotypie, Bestimmung des Pulsefeld-Gelelektrophoresemusters, Bestimmung weiterer Virulenzfaktoren oder Antibiotikaresistenzbestimmungen etc.