3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Analysewaage, (80-400g) Sartorius (Hannover) Analysewaage, BA 61 (0-60g) Sartorius (Hannover B
Bio-Linker®BLX (cross linker) über LTF-Labortechnik (Wasserburg) Blotpapier, Whatman (3mm) Schleicher&Schuell (Dassel) Bunsenbrenner FIREBOY plus Integra Bioscience (Gießen)
E
Eismaschine, SPR 75 Nordcap New Brunswick Scientific (Edison, USA)
Elektrophoresekammer (DNA) OWL (Porthmouth, USA) F
Filterspitzen TipOne® (steril 0,1-1000µl) Starlab (Ahrensburg) G
Gefrierschrank (-80°C), Sorvall® Heraeus, Kendro (Hanau) Geldokumentationsgerät, IMAGO B&L Systems (Marsen, Niederlande) H
Hybridisierungsofen/-flasche Biometra (Göttingen) K
Kühlbox Cool Fun AS-15 Waeco (Emsdetten) Kühlschrank (4,0°C) Liebherr
Kühlzentrifuge, Sorvall® RC6 Du Pont (Bad Homburg) mit Rotor SA600
M
Magnethalterung IBA (Göttingen) Magnetrührer, LR 12, Mettler Landgraf (Hannover) Mikrowelle Panasonic (Hannover)
Mikrotiterplatte (96-well) Sarstedt (Nümbrecht) N
Nitrocellulosemembran, Protran BA85 Schleicher & Schuell (Dassel) P
Pipetteboy TECNOMARA (Fernwald)
Pipetten Eppendorf (Tespe)
Pipetten Gilson (Frankreich)
R
Reagenzglas-Rotator GFL (Burgwedel) Reaktionsgefäße 1,5ml, 2,0ml Sarstedt (Nümbrecht) Reaktionsgefäße 0,2ml mit Deckel Bioplastics (Niederlande) (Thin-wall 8-tube strip)
S
Schüttelinkubator, Innova 4000 New Brunswick Scientific Slot-Blot-Apparatur Hybri.Slot 24 Biometra (Göttingen) Spannungsgerät, PowerPac 300 Biorad (München)
Sterilbank, NUAIRE® Biologial Zapf Instrumente (Sarstedt) Safety Cabinets
Sterilfilter (0,45µm) Millipore (Eschborn) T
Thermocycler, Mastercycler Eppendorf (Tespe) Tischzentrifuge, Centrifuge 5415 C Eppendorf (Tespe) V
Vortex Heidolph (Hannover)
W
Wasserbad (Schüttel-) GFL (Burgwedel) Z
Zentrifugenröhrchen (PP 15ml) Greiner Bio-One (Frickenhausen) 3.1.2 Chemikalien und Reagenzien
A
Agar Agar Oxoid (Hampshire, England)
Agarose Biozym Scientific (Hess. Oldendorf) Albumin-Fraktion V (BSA) Roth (Karlsruhe)
A. bidest (DNase/RNase u. Endotoxin-frei) Sigma (Deisenhofen) Anti-Digoxigenin-POD (poly), Fab Fragments Roche (Mannheim) B
Bacto®-Trypton Becton Dickson (Heidelberg)
Borsäure Roth (Karlsruhe)
Bromphenolblau Merck (Darmstadt) C
Cefixime-Tellurite selective supplement Oxoid (Hampshire, England)
Chloroform Roth (Karlsruhe)
Citronensäure-Monohydrat Merck (Darmstadt)
CTAB Sigma (Deisenhofen)
(Hexadexyltrimethylammoniumbromid, 99%) D
Digoxigenin-11-dUTP Roche (Mannheim) DNA-Marker 100 bp Roth (Karlsruhe) Dynabeads Invitrogen (Karlsruhe) E
EDTA Sigma (Deisenhofen)
Ethanol abs. Roth (Karlsruhe) Ethidiumbromid Sigma (Deisenhofen) F
K
Kaliumchlorid Roth (Karlsruhe) L
Lysozym Roth (Karlsruhe)
M
Magermilchpulver Sucofin (EDAKA, Hannover) N
Natriumchlorid Roth (Karlsruhe)
Natriumacetat Merck (Darmstadt)
Natriumhydroxid Plätzchen Merck (Darmstadt) Nucleotidtriphosphate (dNTPs) Roth (Karlsruhe) P
Phenol Roth (Karlsruhe)
Polyvinylpyrrolidon Roth (Karlsruhe) Proteinase K Merck (Darmstadt) R
RNase A Sigma (Deisenhofen)
S
Salzsäure Sigma (Deisenhofen)
SDS (Sodiumdodecylsulfat) Roth (Karlsruhe) T
TMB ready-to-use substrate Serva (Heidelberg) Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Merck (Darmstadt) Tris (hydroxylmethyl)-aminomethan Roth (Karlsruhe)
Tween®20 Roth (Karlsruhe)
3.1.3 Nährmedien
Columbia-Schafsblut-Agar Oxoid (Hampshire, England) Gassner-Selektivagar Oxoid (Hampshire, England) SMAC-Agar Oxoid (Hampshire, England) CT-SMAC-Agar Oxoid (Hampshire, England)
LB-Agar-Platten 1% (w/v) Bacto®-Trypton
0,5% (w/v) Hefeextrakt
1% (w/v) NaCl
1,5% Agar Agar
LB-Medium 1% (w/v) Bacto®-Trypton
0,5% (w/v) Hefeextrakt
1% (w/v) NaCl
GN-Bouillon Merck (Darmstadt)
3.1.4 Puffer und Lösungen
Blockpuffer 5% Magermilchpulver (w/v) 9,9 mM Tris
150 mM NaCl
0,005% Tween 20 (v/v)
pH 8,0
CTAB 4,1g NaCl
10g CTAB
A. dest ad 100ml
100x Denhardt’s Lösung 2% (w/v) Ficoll
2% (w/v) Polyvinylpyrrolidon
2% (w/v) BSA Fraktion V
Die Lösung wurde steril filtriert (Filter 0,45µm) und bei -20°C gelagert.
Denaturierungspuffer 0,5 N NaOH 1,5 M NaCl,
autoklaviert Hybridisierungspuffer SSC 6x
Denhardt’s Lösung 5 x
SDS 0,5% (w/v) EDTA pH 7,5 2mM
IMS-Waschpuffer 0,138 M NaCl 0,0027 M KCl 0,05% Tween 20 pH 7,4, autoklaviert
6 x Ladepuffer für DNA 0,25% (w/v) Bromphenolblau
0,25% (w/v) Xylencyanol
30% (v/v) Glyzerin Neutralisierungspuffer 1,5M NaCl
0,5 M Tris/HCl (pH 7,4)
autoklaviert
20x SSC 3 M NaCl
0,3 M Natriumcitrat autoklaviert
10 x TBE 0,9 M Tris-HCl (pH 7,5)
0,9 M Borsäure
20 mM Na-EDTA (pH 8,0)
pH 7,5, autoklaviert
10 x TBST 0,1 M Tris
1,5 M NaCl
0,05% (v/v) Tween 20
pH 8, autoklaviert
TEN-Puffer 100µl Lysozym (100mg/ml)
50 µl Tris 1 M (pH 8,0)
2 µl EDTA 0,5 M (pH 8,0)
25 µl NaCl 4M
823 µl A. dest.
TMB-Puffer 0,82% (w/v) Natriumacetat
0,315% (w/v) Citronensäure-
Monohydrat pH 5,0
Waschlösungen für Colony Blots
Waschlösung 1 SSC 2 x
SDS 0,1% (w/v) autoklaviert
Waschlösung 2 SSC 1 x
SDS 0,1% (w/v) autoklaviert
Waschlösung 3 SSC 0,2 x
SDS 0,1% (w/v) autoklaviert
3.1.5 Herkunft des Untersuchungsmaterials und Probennahme
Für die epidemiologische Studie wurden insgesamt 126 zoologische Gärten, Wildparks und Freizeitparks mit Tieranteil ausgewählt. Die Einrichtungen wurden mit Hilfe des Internets ausfindig gemacht und schriftlich um eine Teilnahme gebeten.
Eine besondere Hilfestellung gab die Internetseite www.zoo-infos.de der Zoodatenbank Bielefeld, erstellt von der Zoo-AG-Bielefeld der Universität Bielefeld.
Eine Zusage erteilten 56 Einrichtungen, 13 Einrichtungen erteilten eine Absage und 57 Einrichtungen gaben keine Rückmeldung. Die 56 teilnehmenden Betriebe wurden anhand ihrer Betriebsstruktur in zoologische Parks (Zoo), Wildtierparks und Freitzeiteinrichtungen mit Tieranteil geschichtet. Da rund 40% der angeschriebenen Parks ihre Teilnahme an der Studie zusagten, wurde die zweite Schichtung der Stichprobengröße „Parks“ so vorgenommen, dass Deutschland zunächst anhand der Parkdichte in drei geographische Teile (Region 1, Region 2 und Region 3) unterteilt wurde (Abbildung 1). Aufgrund der relativ hohen Parkdichte in Nordrhein-Westfalen und der gleichzeit relativ geringen Parkdichte in Baden-Württemberg wurden diese beiden in geographisch unterschiedlichen Bereichen Deutschlands liegende Regionen in dieser Studie zu einer Region zusammengefasst.
Abb. 1: Schichtung Deutschlands in drei Regionen
In jeder Region sollte von jeder Parkart ein Anteil von 40% beprobt werden. Jeder Park wurde im Abstand von 14 Tagen zweimal beprobt. Im Beprobungszeitraum von Mai bis Ende August 2008 wurden 24 Parks beprobt, von April bis Mitte Oktober 2009 wurden 32 Parks beprobt. Die Kotproben aus den Streichelgehegen selbst stammten von Tierarten, die von den Besuchern gefüttert und/oder angefasst werden konnten. Dies +waren zum größten Teil Ziegen und Schafe aber auch Schweine, Kaninchen, Meerschweinchen, Pferde und Ponies, Esel, Rinder, Lamas, Damwild, Geflügel und Kängurus. Des Weiteren wurde in jedem Park, soweit möglich, ein Fliegenfänger aufgehängt und davon jeweils zehn Fliegen zur mikrobiologischen Untersuchung herangezogen. Die Ermittlung des Stichprobenumfangs pro Streichelzoo erfolgte vor dem Hintergrund einer Auswahl ohne Zurücklegen bei endlichen Gesamtheiten mit Hilfe des Models der Hypergeometrischen Verteilung.
Bei vorgegebener Größe des Streichelzoos wurde dazu die Prävalenz von 20% mit einer relativen Genauigkeit von 10%, d.h. absolut zwei Prozentpunkte, vorgegeben und somit für jeden Streichelzoo individuell ein erforderlicher Stichprobenumfang bei einer Sicherheitswahrscheinlichkeit von mindestens 95% festgelegt. Die Realisierung erfolgte unter Verwendung des Statistikprogrammpakets R (www.r-project.org/).
Insgesamt wurden somit im Jahr 2008 566 Kotproben und 17 Fliegenproben
untersucht. Im Jahre 2009 waren dies 951 Kotproben und 24 Fliegenproben. Die Kotproben wurden als Sammelkotproben vom Gehegeboden in sterilen Plastikröhrchen gesammelt. Bevorzugt wurde frisch abgesetzter Kot gesammelt, wobei die Zuordnung zu einem bestimmten Individuum nicht gegeben war. Die Proben wurden bis zur Aufarbeitung und Untersuchung im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule bei 4 °C transportiert und gelagert. Zusätzlich wurden von den Parks Fragebögen zu den Themen Gehege- und Gesundheitsmanagement der Tiere sowie Hygiene und Besucherverpflegung beantwortet. Die Auswertung der Fragebögen in Zusammenhang mit dem Erregervorkommen erfolgte mit Hilfe des Fisher’s exact test in dem Statistikprogramm SAS 9.3. Bei dem Fisher’s exact test handelt es sich um einen Signifikanztest auf Unabhängigkeit in der Kontingenztafel welcher auch bei kleinen Stichprobenzahlen verlässliche Ergebnisse liefert.
3.2 Methoden
Direkt nach Ankunft wurden die einzelnen Kotproben jeweils mit 3 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung versetzt und homogenisiert. Falls eine Weiterverarbeitung am selben Tag nicht möglich war, wurden die Proben bei 4 °C bis zum darauf folgenden Tag gelagert.
Von den Fliegenfängern wurden 10 Fliegen je Fänger entnommen und in 2 ml physiologische Kochsalzlösung verbracht. Auch diese wurden, falls eine Weiterverarbeitung am selben Tag nicht möglich war, bei 4 °C gelagert. Die Fliegen wurden vor der Weiterverarbeitung zusammen mit 4-6 Glaskugeln homogenisiert.
Dieses Homogenat wurde bei Raumtemperatur abzentrifugiert und der Überstand verworfen.
3.2.1 STEC-Isolierung
3.2.1.1 Bearbeitung der 583 Proben von 2008
Die Isolierung mittels immunomagnetischer Separation (IMS) erfolgte sowohl 2008 als auch 2009 nach KARCH et al. (1996b). Von der zu untersuchenden Kotprobe/
Fliegenprobe wurden ca. 1 g Kot bzw. 1 ml Fliegensuspension in 10 ml GN-Bouillon
überführt. Die Proben wurden bei 37 °C und 150 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 4 h schüttelnd inkubiert. Anschließend wurden 100 µl der GN-Bouillon direkt auf einer SMAC-Platte fraktioniert ausgestrichen. Weiterhin wurden die STEC mittels immunomagnetischer Separation isoliert. Dazu wurden die 566 Kotproben und 17 Fliegenproben wie folgt bearbeitet: Es wurden 20 µl der Anti-O157-Dynabeads in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und 1000 µl der inkubierten GN-Bouillon hinzu pipettiert. Die Reaktionsgefäße wurden bei Raumtemperatur für 10 min im Reagenzglas-Rotator schwenkend inkubiert. Anschließend wurden sie in eine Magnethalterung gestellt und 3 min ohne Rotation inkubiert. Die Dynabeads hafteten sich nun zusammen mit den an ihnen gebundenen Bakterien an die Reaktionsgefäßwand an. Der Überstand wurde abgenommen und 1000 µl IMS-Waschpuffer dazugegeben. Nach der Entfernung des Magneten erfolgte eine dreiminütige Inkubation, worauf sich erneut eine Inkubation mit Magneten anschloss.
Der Waschvorgang wurde insgesamt dreimal wiederholt und die an den Dynabeads gebundenen Bakterien schließlich in 50 µl IMS-Waschpuffer aufgenommen, von denen 25 µl auf einer SMAC-Platte und 25 µl auf einer CT-SMAC-Platte fraktioniert ausgestrichen wurden. Die Platten wurden bei 37 °C für 18-24 h bebrütet. Nach der Bebrütungszeit wurden STEC-verdächtige Kolonien, d.h. Bakterien die auf SMAC und CT-SMAC-Platten sorbitolnegativ wuchsen (auf SMAC gräulich-farbloses Wachstum, auf CT-SMAC gräuliches Wachstum mit dunkelgrauem bis schwarzem Zentrum) auf Columbia-Schafsblut-Agar, Gassner-Selektivagar und CT-SMAC-Agar subkultiviert und bei 37 °C für 18-24 h bebrütet. Je nach Anzahl STEC-verdächtiger Kolonien wurden bis zu 20 Einzelkolonien subkultiviert. Zeigten die Subkulturen sowohl auf der CT-SMAC als auch auf Gassner-Selektivagar STEC typisches Wachstum und wuchsen sie auch auf Columbia-Schafsblut-Agar in E.coli-typischen Kolonien, wurden die Subkulturen in einem Gemisch aus gleichen Teilen LB-Medium und 50%igem Glycerin bei -70 °C in Mikrotiterplatten eingefroren. Die Isolate wurden, bevor sie in Form von Tupfern zur Serotypisierung an das Robert Koch-Institut nach Wernigerode geschickt wurden, mittels einer Multiplex-PCR auf die Virulenzgene stx1, stx2, eae und hlyA getestet (siehe 3.2.7).
3.2.1.2 Bearbeitung der 975 Proben von 2009
Zunächst wurden auch hier 1 g Kot bzw. 1 ml Fliegensuspension in 10 ml GN-Bouillon überführt und bei 37 °C und 150 rpm für 4 h schüttelnd inkubiert. Die immunomagnetische Separation erfolgte jedoch zusätzlich zu O157 Dynabeads mit O103, O145, O111 und O26 erweiterten Dynabeads. In 1,5 ml Reaktionsgefäßen wurden jeweils 5 µl O103, O145, O111, O26 und O157 Dynabeads vorgelegt und 250 µl GN-Bouillon dazu pipettiert. Ab hier wurde die Separation wie oben beschrieben durchgeführt. Allerdings wurden nach der Bebrütungszeit keine Einzelkolonien subkultiviert. Die Platten wurden komplett mit insgesamt 1 ml LB-Bouillon abgeschwemmt und im Verhältnis 1:1 mit 50%igem Glycerin bis zur Weiterverarbeitung eingefroren.
3.2.2 Herstellen der PCR-Sonde
Zur Detektion der im Genom evtl. vorhandenen Virulenzgene wurde zunächst eine Gensonde erstellt. Die Herstellung der DIG-11-UTP markierten Sonde erfolgte mittels einer Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion, wobei die Reagenzien laut Herstellerangaben (Roche diagnostics mbH Deutschland) eingesetzt bzw. auf einen 50 µl PCR-Ansatz umgerechnet wurden. Als Template dienten 50 ng chromosomale DNA des Referenzstammes EDL933.
Tab. 1: Verwendete Primer (FRANCK et al. 1998b):
Virulenzfaktor Primersequenz 5’-3’ Produktgröße (bp)
GenBank Nummer
Stx1 (forward) TTCGCTCTGCAATAGGTA 555 Z36899
Stx1 (reverse) TTCCCCAGTTCAATGTAAGAT
Stx2 (forward) GTGCCTGTTACTGGGTTTTTCTTC 118 L11078 Stx2 (reverse) AGGGGTCGATATCTCTGTCC
Intimin (forward) ATATCCGTTTTAATGGCTATCT 425 Z11541 Intimin (reverse) AATCTTCTGCGTACTGTGTTCA S90827
Die Primer für die DIG-Sonde wurden von der Firma Biomers.net (Ulm) synthetisiert und als Lyophilisate geliefert. Die Primer wurden in Wasser gelöst (jeweils 100 µM) und bei -20 °C gelagert.
Der Primer-Mix wurde wie folgt zusammengesetzt:
Primer-Mix DIG1 Primer-Mix DIG2 dH2O 70 µl dH2O 70 µl stx1-1 10 µl stx1-2 10 µl stx2-1 10 µl stx2-2 10 µl eae-1 10 µl eae-2 10 µl
Der DIG-dNTP-Ansatz wurde folgendermaßen hergestellt:
dATP (25 µmol/100 mM) 5 µl dCTP (25 µmol/100 mM) 5 µl dGTP (25 µmol/100 mM) 5 µl dTTP (25 µmol/100 mM) 4,75 µl DIG-11-UTP (1 mM) 25,0 µl
Der Mastermix wurde in 0,2 ml Reaktiongefäßen nach folgendem Pipettierprotokoll in angegebener Reihenfolge hergestellt:
Reagenz Menge/Einzelansatz
dH2O 27,0 µl
10xPCR-Puffer (-MgCl2) 5,0 µl MgCl2 (1,5 mM) 1,5 µl DIG-dNTP-Mix (1 mM) 5,0 µl Primer-Mix 1 (10 µM) 5,0 µl Primer-Mix 2 (10 µM) 5,0 µl Taq-Polymerase (5 U/µl) 0,5 µl Template-DNA (50 ng) 1,0 µl Gesamtmenge/Einzelansatz 50,0 µl
Die Ziel-DNA wurde in einem Thermocycler der Firma Eppendorf nach folgendem
Nach Beendigung des Programms wurden die Ansätze im Thermocycler auf 7 °C gehalten.
Zur Kontrolle der Sonde wurden vor dem Einsatz im Hybridisierungsschritt aus jedem Ansatz jeweils 5 µl für 90 min bei 130 V in einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt (siehe 3.2.8) und dokumentiert.
3.2.3 Präparation chromosomaler DNA
Um die Sensitivität der einzelnen Sonden testen zu können, wurde aus dem Referenzstamm EDL933 nach folgendem Protokoll chromosomale DNA präpariert:
Der Referenzstamm EDL933 wurde 8-12 h bei 37 °C auf einer Blutplatte angezüchtet. Material von einer Kolonie wurde in 6 ml LB-Medium überführt und 8-12 h schüttelnd bei 37 °C inkubiert. Von dieser Bakteriensuspension wurden 5 ml in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert und für 10 min bei 4 °C und 8000 rpm (Kühlzentrifuge, Sorvall® RC6, Rotor SA600) zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Das Pellet wurde in 275 µl TEN-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 10 µl RNAse und 275 µl A.dest. inkubierte der Ansatz für 30 min bei 37 °C im Wasserbad. Im Anschluss wurden 15 µl 20%iges SDS sowie 10 µl Proteinase K (20 mg/ml) zugesetzt. Der Ansatz wurde gut gemischt und erneut bei 37 °C für 1 h im Wasserbad inkubiert. In dieser Zeit wurde das CTAB auf 50 °C erwärmt. Der Probe wurden nun 125 µl 4 M NaCl zugegeben, der Ansatz gut gemischt und schließlich 80 µl CTAB hinzugefügt. Der Ansatz wurde für 10 min im Wasserbad bei 65 °C erwärmt. Nach Ablauf der Inkubationszeit erfolgte eine Extraktion mittels Zugabe von 780 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1). Die Probe wurde vorsichtig gemischt. Die entstehende milchig-trübe Suspension wurde für 8
min bei 12000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden 2 flüssige Phasen und eine feste Interphase sichtbar, von denen lediglich die oberste (wässrige) Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt wurde; der Rest wurde verworfen. Es folgte eine weitere Extraktion mit 780 µl Phenol/Chlorophorm/Isoamylalkohol (25:24:1) und ein weiterer Zentrifugationsschritt (8 min, 12000 rpm). Die oberste Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß pipettiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 500 µl Isopropanol präzipitiert und durch nachfolgende Zentrifugation bei 12000 rpm für 30 min pelletiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 500 µl 80%igen Ethanols und anschließende Zentrifugation gewaschen und das DNA-Pellet bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet. Zur Lagerung wurde das Pellet in TE-Puffer oder A. dest resuspendiert und bei -20 °C eingefroren.
3.2.4 Testen der Sensitivität für die stx1-, stx2- und eae-Sonden
Da zur Sensitivität der in dieser Arbeit eingesetzten Sonden in einer DIG-markierten Southern-Hybridisierung keinerlei Daten vorlagen, wurde dies zunächst experimentell untersucht. Dazu wurden Verdünnungsreihen der chromosomalen DNA des Referenzstammes EDL933 mit den Konzentrationen 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 25 ng und 12,5 ng sowie mit 100 ng, 50 ng, 25 ng, 12,5 ng, 6,25 ng und 3,125 ng hergestellt. Eine Nitrocellulosemembran wurde auf die Größe der Slot-Blot-Apparatur Hybri.Slot 24 zugeschnitten und in 20 x SSC für 5-10 min äquilibriert. In dieser Zeit wurden die DNA-Verdünnungen in 10 µl A. dest. aufgenommen und jeweils mit 30 µl Denaturierungspuffer versetzt. Diese Ansätze wurden für 15 min bei 100 °C denaturiert, anschließend direkt auf Eis gestellt und jeweils 40 µl 20 x SSC hinzu gegeben. An die Hybri.Slot-Apparatur wurde ein Vakuum angelegt, die Nitrocellulosemembran eingespannt und die Slots mit je 80 µl 20 x SSC gespült.
Nachdem in den Vertiefungen keine Flüssigkeit mehr zu sehen war, wurde das komplette Volumen der DNA-Verdünnungen in die Slots pipettiert und gewartet, bis das Vakuum die gesamte DNA-Menge auf die Membran gezogen hatte. Die Slots wurden erneut mit 80 µl 20 x SSC gespült und das Vakuum final für 5 min aufrechterhalten. Die Membran wurde aus der Apparatur entfernt und auf Whatman Filterpapier getrocknet. Die DNA wurde im Crosslinker mit UV-Licht auf der Membran fixiert. Anschließend wurde die Membran wie unter 3.2.6 beschrieben
weiterverarbeitet. Die niedrigste DNA-Konzentration, bei der eine enzymatische Farbreaktion sichtbar war, wurde dokumentiert.
3.2.4.1 Prinzip der enzymatischen Farbreaktion
Um virulenzgentragende Bakterien-DNA, welche auf einer Nitrocellulosemembran fixiert ist, sichtbar machen zu können, bedient man sich der Bindung einer markierten Sonde an die DNA; die Sonde wird anschließend durch Antikörper detektiert und durch eine enzymatische Farbreaktion sichtbar gemacht. Die DNA-Sonde wurde wie bereits in 3.2.2 beschrieben hergestellt, wobei die beiden konkurrierenden Nukleotide dTTP und DIG-11-dUTP im Verhälnis 65% zu 35% vorlagen und in die Sonde eingebaut wurden. Die Sonde wurde in der Southern-Hybridisierung an die Ziel-DNA gebunden. Der im Anschluss benutzte polyklonale Schaf-Anti-Digoxigenin-spezifische Antikörper war Meerrettichperoxidase-gekoppelt. Durch dreimaliges Waschen nach der Antikörperreaktion wie in 3.2.6 beschrieben wurde nicht gebundenes Konjugat entfernt. Das chromogene Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) wurde hinzugegeben. Dessen enzymatische Umsetzung resultierte in einer blauen Farbreakion.
3.2.5 Colony-Blot
Die Proben aus dem Jahr 2009 wurden mittels Colony-Blot weiterverarbeitet. Dazu wurden die Bakterienabschwemmungen aufgetaut und gevortext. 2 µl der Abschwemmung wurden in ein mit 2,5 ml sterilem NaCl gefülltes Flachbodenglas gegeben und die Trübung wurde auf McFarland 0,5 eingestellt. Aus dieser Suspension wurden 10 µl in 10 ml steriles NaCl überführt und gut gevortext. Daraus wurden nun 10 µl mit einem Einmalspatel auf LB-Platten ausplattiert und über 8-12 h bei 37 °C bebrütet. Drei Plastiktabletts (ca. 30 x 40 cm) wurden mit 3 mm Whatman Filterpapier ausgelegt und mit Denaturierungspuffer, Neutralisierungspuffer und 2 x SSC durchtränkt. Als nächstes wurden runde Nitrocellulosemembranen beschriftet und auf die bewachsenen LB-Platten aufgelegt. Die Position der Membranen wurde durch einen Kanüleneinstich markiert. Die Membranen wurde für 5 min auf den Platten belassen und anschließend mit einer Pinzette luftblasenfrei, mit dem anhaftenden Koloniematerial nach oben, auf den mit Denaturierungspuffer
durchtränkten Filter verbracht und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde die Nitrocellulosemembran auf das mit Neutralisierungspuffer getränkte Filterpapier gelegt und ebenfalls 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Als letztes wurde die Membran auf den mit 2 x SSC getränkten Filter gelegt und ebenfalls 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Nitrocellulosemembranen wurden abschließend auf trockenem Filterpapier für mindestens 30 min getrocknet. Die DNA wurde nach dem Trocken durch UV-Bestrahlung im Crosslinker auf der Membran fixiert.
3.2.6 Southern-Hybridisierung
Vor der eigentlichen Hybridisierung wurden die Membranen in A.bidest angefeuchtet und für 2 min in 2 x SSC äquilibriert. Anschließend wurden gläserne Hybridisierungsröhren mit 10 ml Hybridisierungspuffer und den Membranen bestückt und bei 65 °C 2 h im Hybridisierungsofen unter ständiger Rotation prähybridisiert. 30 µl der PCR-Sonde wurden zur Denaturierung 15 min bei 100 °C in einem Reaktionsgefäß gekocht und anschließend 5 min auf Eis gestellt. Nach Ablauf der Prähybridisierungszeit wurde der Hybridisierungspuffer abgegossen und 3 ml frischer Hybridisierungspuffer zusammen mit 30 µl denaturierter DNA-Sonde in die Hybridisierungsröhre gegeben. Über Nacht wurden die Sonden bei 65 °C im Hybridisierungsofen unter ständiger Rotation an die DNA hybridisiert. Am nächsten Tag wurden die Membranen drei Mal für jeweils 30 min mit Waschpuffer 1, Waschpuffer 2 und Waschpuffer 3 mit absteigender Salzkonzentration gewaschen.
Anschließend wurden die Membranen mit 50 ml Blockpuffer für eine Stunde geblockt. Dem folgte dreimaliges Waschen für jeweils 5 min mit 1 x TBST. Nach dem Waschen wurden 10 µl Anti-Digoxigenin-Antikörper vom Schaf, konjugiert mit polymerisierter Merrettichperoxidase, und 10 ml 1 x TBST in die Glasröhren gegeben und bei Raumtemperatur unter ständiger Rotation inkubiert. Nach einer Stunde wurde zweimal für 5 min mit 50 ml 1 x TBST und anschließend für 5 min mit 50 ml TMB-Puffer gewaschen. Danach wurde mit 10 ml gebrauchsfertiges TMB-Substrat unter Sichtkontrolle inkubiert, bis sich eine blaue Farbreaktion der gebundenen DNA zeigte. Die Reaktion wurde mit A.bidest abgestoppt, die Membranen aus der Glasröhre entnommen und zwischen zwei Filterpapieren getrocknet. Von den
hybridisierenden Kolonien (Farbreaktion im Colony-Blot) wurde Material von den ursprünglichen LB-Platte entnommen (maximal fünf Kolonien pro Platte), und in Mikrotiterplatten in 200 µl eines Gemisches aus gleichen Teilen LB-Mediums und 50%igem Glycerin eingefroren. Zu einem späteren Zeitpunkt wurden diese Isolate in einer Multiplex-PCR auf die drei Virulenzgene stx1, stx2 und eae hin untersucht.
3.2.7 DNA-Analyse mittels Multiplex-PCR 3.2.7.1 PCR-Kontrolle der Isolate 2008
Die 2008 gewonnenen Isolate wurden in einer Multiplex-PCR (modifiziert nach [FRANCK et al. 1998a]) auf die Virulenzgene stx1, stx2, eae und hlyA getestet. Die dafür verwendeten Primer wurden bereits in Punkt 3.2.2 Tabelle 1 aufgelistet. Das zusätzlich an dieser Stelle getestete Hämolysin A so wie die interne Amplifikationskontrolle für das Enzym Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (gapdh) sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tab. 2: Verwendete Primer
Virulenzfaktor Primersequenz 5’-3’ Produktgröße (bp)
GenBank Nummer
hlyA-F (forward) ACGATGTGGTTTATTCTGGA 165 NC_009602 hlyA-R (reverse) CTTCACGTGACCATACATAT
gapdh-F (forward) AAAGGCGCTAACTTCGACAA 359 NC_000913 gapdh-R (reverse) GCAGCTTTTTCCAGACGAA
Für die mPCR wurden zunächst die tiefgefrorenen Isolate aufgetaut und auf Columbia-Schafblutagar über Nacht bei 37 °C angezüchtet. Für die mPCR wurden die Primer auf eine Endkonzentration von 100 µM eingestellt. Es wurden folgende Primermischungen hergestellt:
Primermix 1: Primermix 2:
dH2O 187,5 µl dH2O 187,5 µl stx1-1 12,5 µl stx1-2 12,5 µl stx2-1 12,5 µl stx2-2 12,5 µl
eae-1 12,5 µl eae-2 12,5 µl
hlyA-F 12,5 µl hlyA-R 12,5 µl
gapdh-F 12,5 µl gapdh-R 12,5 µl
Zur Erstellung des Templates wurden 100 µl dH2O in einem Eppendorfgefäß vorgelegt und mit einer Pipettenspitze voll Koloniematerial (max. ½ stecknadelkopfgroße Menge) eine homogene Bakteriensuspension hergestellt.
Dieses Homogenat wurde später als Template in der mPCR verwendet.
Der Mastermix wurde nach folgendem Pipetierschema erstellt:
Reagenz Menge/Einzelansatz
dH2O 10,625 µl
10xPCR-Puffer 2,5 µl
MgCl2 1,0 µl
dNTPs 0,625 µl
Primer-Mix1 2,5 µl
Primer-Mix2 2,5 µl
Taq-Polymerase 0,25 µl
Template 5,0
Gesamtmenge/Einzelansatz 25,0 µl
Die Ziel-DNA wurde in einem Thermocycler nach folgendem Programm amplifiziert:
initiale Denaturierung 94 °C 5:00 min Denaturierung 94 °C 1:00 min
Anlagerung 57 °C 1:15 min 29 Zyklen
Extension 72 °C 1:45 min
finale Extension 72 °C 5:00 min
Danach wurde mit den Proben wie in Abschnitt 3.2.8 verfahren.
3.2.7.2 PCR- Kontrolle der Isolate 2009
Zur Kontrolle der mit Hilfe des Colony-Blots identifizierten Isolate wurde eine Multiplex-PCR zur Detektion der Virulenzgene stx1, stx2, und eae durchgeführt (modifiziert nach [FRANCK et al. 1998c]). Die dafür verwendeten Primer wurden bereits in Punkt 3.2.2 aufgelistet. Zusätzlich wurden Primer für das Enzym Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase als interne Amplifikationskontrolle eingesetzt (GenBank Accession number: NC_000913). Als Template-DNA diente lysiertes Koloniematerial der eingefrorenen Isolate, welche zuvor in 100 µl LB-Medium für 8-12 h bei 37 °C angezüchtet wurden. Als Postitivkontrolle diente auch hier lysiertes Koloniematerial des Isolates E. coli EDL933.
Die einzelnen Primer wurden auf eine Endkonzentration von 100 µM eingestellt und der Primermix wie folgt zusammengesetzt:
Primermix 1: Primermix 2:
dH2O 214,2 µl dH2O 214,2 µl
stx1-1 25,0 µl stx1-2 25,0 µl
stx2-1 3,6 µl stx2-2 3,6 µl
eae-1 3,6 µl eae-2 3,6 µl
eae-1 3,6 µl eae-2 3,6 µl