Vorkommen von Shigatoxin-bildenden und enteropathogenen Escherichia coli in
deutschen Streichelzoos
INAUGURAL - DISSERTAION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet)
vorgelegt von Tanja Bauer Bad Säckingen
Hannover 2013
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. G.-F. Gerlach
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Prof. Dr. G.-F. Gerlach
2. Gutachter: Univ.-Prof.Dr. L. Kreienbrock
Tag der mündlichen Prüfung: 21.05.2013
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... 5
Abbildungsverzeichnis ... 9
Tabellenverzeichnis ... 11
Abkürzungsverzeichnis ... 13
1 Einleitung ... 17
2 Literatur ... 19
2.1 Escherichia coli ... 19
2.1.1 Taxonomie ... 19
2.1.2 Epidemiologie und Bedeutung ... 19
2.1.3 Pathogene Escherichia coli ... 20
2.2 STEC/VTEC und EHEC ... 21
2.2.1 Virulenzfaktoren ... 22
2.2.2 Nachweis von STEC ... 25
2.2.3 Epidemiologie von STEC/EHEC beim Menschen ... 28
2.2.4 EHEC-Erkrankungen beim Menschen ... 31
2.2.5 Epidemiologie von STEC bei Tieren ... 33
2.2.6 EHEC/STEC in Streichelzoos ... 35
2.3 Haltung von Tieren in Streichelzoos ... 37
2.3.1 Zoologische Gärten, Tierparks, Tiergärten ... 37
2.3.2 Wildparks, Wildgehege ... 38
2.3.3 Freizeitparks mit Tieranteil ... 39
2.3.4 Streichelzoos, Streichelgehege ... 39
3 Material und Methoden ... 41
3.1 Material ... 41
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 41
3.1.2 Chemikalien und Reagenzien ... 42
3.1.3 Nährmedien ... 44
3.1.4 Puffer und Lösungen ... 45
3.1.5 Herkunft des Untersuchungsmaterials und Probennahme ... 47
3.2 Methoden ... 49
3.2.1 STEC-Isolierung ... 49
3.2.2 Herstellen der PCR-Sonde ... 51
3.2.3 Präparation chromosomaler DNA ... 54
3.2.4 Testen der Sensitivität für die stx1-, stx2- und eae-Sonden ... 55
3.2.5 Colony-Blot... 56
3.2.6 Southern-Hybridisierung ... 57
3.2.7 DNA-Analyse mittels Multiplex-PCR ... 58
3.2.8 Gelelektrophorese ... 61
4 Ergebnisse ... 63
4.1 Charakterisierung der beprobten Parks ... 63
4.1.1 Gehaltene Tierarten ... 63
4.1.2 Ställe und Gehege ... 64
4.1.3 Gehegehygiene und Management ... 65
4.1.4 Weitere Angaben zu den beprobten Gehegen ... 66
4.1.5 Statistische Auswertung der Fragebögen ... 66
4.2 Nachweis von STEC aus Proben des Jahres 2008 ... 66
4.2.1 Nachweis von STEC aus Kaninchen (Wildpark 105) ... 67
4.2.2 Nachweis von STEC aus Ziegen (Wildpark 107) ... 68
4.2.3 Nachweis von STEC aus Schafen (Wildpark 110) ... 68
4.2.4 Isolation von STEC mittels verschiedener Anzucht-Methoden ... 69
4.3 Nachweis von STEC/EPEC aus Proben des Jahres 2009 ... 70
4.3.1 Auswertungen auf Probenebene ... 72
4.3.2 Auswertungen auf Parkebene ... 75
4.3.3 Serotypisierung von STEC Isolaten ... 75
4.3.4 Virulenzgene in STEC Isolaten ... 78
4.3.5 Auswertung auf Isolatebene ... 88
4.3.6 Vergleich des STEC/EPEC Nachweises zwischen der ersten Beprobung der Zoos und der Nachuntersuchung ... 89
4.4 Auswertung der Parkarten und Regionen ... 92
4.4.1 Jahr 2008 ... 92
4.4.2 Jahr 2009 ... 93
5 Diskussion ... 95
5.1 Material und Methoden ... 95
5.2 Parkmanagement ... 98
5.3 STEC/EPEC Prävalenz ... 101
5.4 Vorkommen von Serogruppen ... 104
5.5 Vorkommen von Virulenzgenen ... 106
5.6 Wiederfindungsrate einzelner Serogruppen in Streichelgehegen ... 109
5.7 Parkarten und Regionen ... 110
5.7.1 Jahr 2008 ... 110
5.7.2 Jahr 2009 ... 111
6 Schlussfolgerung ... 113
7 Zusammenfassung ... 117
8 Summary ... 121
Literaturverzeichnis ... 127
Danksagung ... 145
Anhang I (Statistische Auswertung der Fragebögen) ... 147
Anhang II (Deskriptive Auswertung der Fragebögen) ... 151
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schichtung Deutschlands in drei Regionen ... 48 Abb. 2: Untersuchter Probenumfang im Jahr 2008 ... 67 Abb. 3: Untersuchter Probenumfang im Jahr 2009 ... 71 Abb. 4: Anzahl positiver Proben der einzelnen Tierarten sowie aller Proben in
Prozent der einzelnen Parks. ... 72 Abb. 5: Die häufigsten vorkommenden Serogruppen prozentual in 32
beprobten Zoos. ... 77 Abb. 6: Die häufigsten vorkommenden Serogruppen prozentual in 32
beprobten Zoos bei Ziegen, Schafen und Schweinen ... 78 Abb. 7: Verteilung der Virulenzmuster der im Jahr 2009 getesteten Zoos. ... 80 Abb. 8: Die häufigsten Serogruppen bezogen auf die serotypisierte
Gesamtprobenzahl ... 84 Abb. 9: Die am häufigsten vorkommenden Serogruppen in den jeweiligen
Postleitzahlengebieten. ... 86 Abb. 10: Serogruppenverteilung bei den Tierarten Ziege, Schaf und Schwein ... 87 Abb. 11: Verteilung der Virulenzmuster anhand der 256 in der Kontroll-PCR
untersuchten Proben ... 88 Abb. 12: Anzahl der Isolate der häufigsten Serogruppen ... 89
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Verwendete Primer (FRANCK et al. 1998): ... 51
Tab. 2: Verwendete Primer ... 58
Tab. 3: Tier- und Zoozahlen der Jahre 2008 und 2009. ... 64
Tab. 4: Detektierte STEC im Jahr 2008 ... 69
Tab. 5: Übersicht STEC-Isolate aus im Jahr 2008 beprobten Streichelgehegen .. 69
Tab. 6: Anzahl STEC Isolate nach verschiedenen Isolierungs-Methoden ... 70
Tab. 7: Wiederfindungsrate des Virulenzgens stx1 in PCR 1 vs. PCR 2 ... 73
Tab. 8: Wiederfindungsrate des Virulenzgens stx2 in PCR 1 vs. PCR 2 ... 74
Tab. 9: Wiederfindungsrate von eae in PCR 1 vs. PCR 2 ... 74
Tab. 10: Anzahl positiver Zoos je Serogruppe und Tierart ... 76
Tab. 11: Virulenzgenkombinationen der Serogruppen ... 82
Tab. 12: Auftreten der Serogruppen in geographischer Abhängigkeit. ... 85
Tab. 13: Übersicht zum Verlauf des STEC/EPEC-Nachweises in der ersten und zweiten Beprobung in ausgewählten Gehegen. ... 90
Tab. 14: Übersicht zur Wiederfindungsrate einzelner Serogruppen in den Tierarten ... 92
Tab. 15: Statistische Auswertung der Fragebögen mit Hilfe des Fisher’s exact test ... 147
Tab. 16: Deskriptive Auswertung der Fragebögen ... 151
Abkürzungsverzeichnis
μl Mikroliter
μM Mikromolar
A Adenin
APEC Aviär-pathogene Escherichia coli Aqua bidest Aqua bidestillata
bp Basenpaare
C Cytosin
cDNA complementary DNA
cm Zentimeter
d Tag
DIN Deutsches Institut für Normung e.V.
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynucleotidtriphosphat eae (eae) Intimin (kursiv: Genbezeichnung) EAEC Enteroaggregative Escherichia coli E. coli Escherichia coli
EDEC Edema Disease Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EHEC Enterohämorrhagische Escherichia coli EIEC Enteroinvasive Escherichia coli
EPEC Enteropathogene Escherichia coli espP Gen für Serinprotease et al. (lat. et alli) und andere
etp Gencluster für Typ II- Sekretionssystem
evtl. eventuell
ExPEC extraintestinale pathogene Escherichia coli FAE Follikel-assoziiertes Gewebe
g Gramm
G Guanin
GALT gut associated lymphoid tissue Gb3 Globotriacylceramid-Rezeptor
GKZ Gesamtkeimzahl
GN gram-negativ
h Stunde
ha Hektar
HC Hämorrhagische Colitis
H-Antigene Geißel-Antigene
HlyA (hlyA) Hämolysin A (kursiv: Genbezeichnung)
HUS Hämorrhagisches Urämisches Syndrom i.d.R. in der Regel
Ig Immunglobulin
IMS Immunomagnetische Separation katP Gen für Katalase-Peroxidase
kb Kilobase(n)
KbE Kolonien bildende Einheiten
kDa Kilodalton
KOH Kalium-Hydroxid
LB lysogeny broth
LEE locus of enterocyte effacement
LFGB Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch
LPS Lipopolysaccharide
mg Milligramm
min Minuten
ml Milliliter
mm Millimeter
mM Millimolar
MNEC Meningitis-assoziierte Escherichia coli MRB modifizierte Rappaport-Bouillon mRNA messenger Ribonukleinsäure
mTSB modifizierte Trypton-Soja-Bouillon
n absolute Zahl
ng Nanogramm
O-Antigene Oberflächenantigene
o.ä. oder Ähnliches
PBS phosphate buffered saline (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PCR Polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)
PLZ Postleitzahl
PSB peptone-sorbitol-bile
RKI Robert- Koch Institut
RNA Ribonukleinsäure
rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT reverse transcription
s Sekunde
SDS Sodiumdodecylsulfat
SF Sorbitol fermentierend
SMAC Sorbitol-MacConkey
sog. sogenannte(r)
ssp. Subspezies
STEC Shigatoxin-bildende Escherichia coli Stx (stx) Shigatoxin (kursiv: Genbezeichnung)
T Thymin
TA Tierarzt
Taq Thermus aquaticus
TBA Tris-Bor-EDTA-Puffer
TSA Trypton-Soja-Agar
TSB Tryptone-Soja-Bouillon
TTP trombotisch-trombozytopenische Purpura
U Unit
u.a. unter anderem
UPEC Uropathogene Escherichia coli
Urea Harnstoff
Ure Urease
UV-Licht Ultraviolettes Licht
V Volt
v.a. vor allem
VTEC Verotoxin-bildende Escherichia coli
vWF von-Willebrand-Faktor
WHO World Health Organization
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
1 Einleitung
Escherichia coli ist Teil der natürlichen Mikroflora des Intestinaltraktes von Säugern und Vögeln. Einige Stämme jedoch sind in der Lage, ernsthafte Erkrankungen in Mensch und Tier auszulösen. Diese pathogenen Stämme werden in sechs Pathogenitätsgruppen unterteilt, abhängig von ihren Virulenzeigenschaften.
Die 1977 erstmals von KONOWALCHUK et al. (1977) beschriebenen Shiga Toxin- bildenden Escherichia coli (STEC) sind eine Gruppe davon. In Zusammenhang mit menschlichen Erkrankungen wurden STEC erstmals 1983 von RILEY et al. (1983) beschrieben, als 47 Personen bei einem Ausbruch in Oregon und Michigan an hämorrhagischer Colitis erkrankten. Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) stellen eine Untergruppe der STEC dar, welche in der Lage ist, aufgrund ihrer Virulenzfaktoren hämorrhagische Colitis (HC) und das hämolytisch urämische Syndrom (HUS) im Menschen hervorzurufen. Die meisten Ausbrüche sind mit der Serogruppe O157 assoziiert, aber auch so genannte non-O157 Stämme wurden aus an HUS Erkrankten isoliert (MELLMANN et al. 2008).
Infektionen mit EHEC/STEC erfolgen meist über kontaminierte Lebensmittel oder durch Mensch zu Mensch Übertragungen (BOUDAILLIEZ et al. 1997). Vor allem rohe oder ungenügend erhitzte Fleischprodukte von Wiederkäuern, wie Hack oder Mett, und Rohmilchprodukte führen immer wieder zu EHEC-Ausbrüchen (RANGEL et al. 2005). STEC wurde bereits in verschiedenen Haus- und Wildtieren nachgewiesen, kleine und große Wiederkäuer jedoch stellen das Erregerhauptreservoir da. WERBER et al. (2007) publizierten den Kontakt von Kindern mit Wiederkäuern als prinzipielles Infektionsrisiko. In North Carolina, Florida und Arizona (DEBROY u. ROBERTS 2006) sowie in den Niederlanden (HEUVELINK et al. 2002) konnten Erkrankungen bei Kindern auf den Besuch im Streichelzoo, und dem damit verbundenen Streicheln von kleinen Wiederkäuern, zurückgeführt werden. In wieweit STEC in deutschen Streichelzoos verbreitet ist, ist nicht bekannt, da repräsentative epidemiologische Untersuchungen zuvor noch nicht durchgeführt wurden.
Ziel dieser vom Zoonoseverbund FBI-Zoo geförderten Arbeit war es, eine flächendeckende, deutschlandweite Prävalenzerhebung von STEC in Streichelzoos
durchzuführen. Gleichzeitig wurde durch Erhebung eines Fragebogens versucht, potentielle Faktoren, die ein vermehrtes STEC/EPEC-Vorkommen in deutschen Streichelzos begünstigen und somit eine potenielle Übertragungsgefahr auf den Menschen erhöhen könnten, zu eruieren.
2 Literatur
2.1 Escherichia coli 2.1.1 Taxonomie
Escherichia coli aus der Familie der Enterobacteriaceae wurde 1885 erstmalig von dem Kinderarzt Dr. Theodor Escherich aus dem Stuhl Neugeborener isoliert. Es handelt sich um ein gramnegatives, fakultativ anaerobes Stäbchenbakterium, welches zwischen 2,0-6,0 µm lang und 1,1-1,5 µm breit ist. Auf einfachem Columbia- Schafblutagar wachsen E. coli in Form relativ großer (2-5 mm), grauer, feucht- glänzender Kolonien mit glattem Rand (smooth-[S]-Form). Es kommen jedoch auch Formen, die trockene Kolonien mit einem gezahnten Rand aufweisen (rough-[R]- Form) oder schleimproduzierende Formen vor (ROLLE u. MAYR 2002). Alle E. coli sind Oxidase negativ, Katalase positiv und in der Lage, Glukose unter Säurebildung abzubauen. In der Regel können sie Laktose, Sorbitol und weiterhin Arabinose, Maltose, Trehalose, Mannit und Glycerin verstoffwechseln. E. coli werden anhand ihrer Oberflächen (O)-, Kapsel (K)- sowie Geißel (H)-Antigene nach einem modifizierten Kaufmann-Schema in verschiedene Serovare eingeteilt. Mittlerweile sind 181 verschiedenen O-Antigene bekannt. Die O-Antigene definieren die Serogruppe, während die verschiedenen Kombinationen aus O- und H-Antigenen den Serotyp eines E. coli Isolates festlegen (NATARO u. KAPER 1998). E. coli Erreger sind gegenüber horizontalem Gentransfer sehr empfänglich, weshalb sie eine große phänotypische und genetische Variabilität aufweisen.
2.1.2 Epidemiologie und Bedeutung
Escherichia coli treten als Kommensalen in der menschlichen und tierischen Flora des hinteren Dünndarms sowie des Dickdarms (mit Ausnahme von Meerschweinchen, Chinchillas und körnerfressenden Ziervögeln) auf und haben neben der Beteiligung an Abbauprozessen auch in der Produktion von Vitaminen ihre physiologische Aufgabe (ROLLE u. MAYR 2002). Davon abzugrenzen sind Isolate, die aufgrund der Ausbildung verschiedener Faktoren als virulent angesehen werden müssen. Bestimmte Serogruppen treten zwar gehäuft mit bestimmten
klinischen Syndromen auf, jedoch ist nicht das serologisch reaktive Antigen per se für die Virulenz des Isolates verantwortlich.
2.1.3 Pathogene Escherichia coli
Die Virulenz bestimmter E. coli-Isolate ist v.a. auf Endo-, Entero- und Cytotoxine sowie Adhäsionsfaktoren zurückzuführen und nur Isolate mit bestimmten Kombinationen von Virulenzfaktoren (Pathotyp) können persistieren und klinische Erkrankungen auch in nicht vorgeschädigten Individuen auslösen. Dazu gehören Pathotypen, welche Darm- und Durchfallerkrankungen, Harnwegsinfektionen sowie Sepsis und Meningitis auslösen.
Bei den humanpathogenen Darm- und Durchfallerregern sind bisher sechs Kategorien bekannt: Die enteropathogenen E. coli (EPEC), die enterohämorrhagischen E. coli (EHEC), enterotoxische E. coli (ETEC), enteroaggregative E. coli (EAEC) sowie enteroinvasive E. coli (EIEC) und diffus adhärente E. coli (DAEC). E. coli-Pathotypen, welche mit extraintestinalen Infektionen in Zusammenhang stehen, werden allgemein als ExPEC bezeichnet, wovon uropathogene E. coli (UPEC) am frequentesten vorkommen. Immer häufiger werden jedoch auch mit Sepsis und Meningitis assoziierte E. coli (MNEC) diagnostiziert.
EPEC, ETEC und EHEC können nicht nur im Menschen, sondern auch in Tieren klinisch apparente Infektionen auslösen, wobei vorrangig Jungtiere betroffen sind. Im Einzelnen können bei Tieren die Colienteritis, die Colidiarrhoe sowie die Coliseptikämie und die Ödemkrankheit der Schweine unterschieden werden.
Zusätzlich sind geflügelpathogene E. coli (APEC) bekannt, die v.a. bei Puten und Hühnern zu Septikämien, Perikarditiden und primären Atemwegsinfektionen sowie der Coligranulomatose führen können (KAPER et al. 2004).
Die Colienteritis wird durch enteropathogene E. coli (EPEC) und Shigatoxin-bildende E. coli (STEC) durch das Anheften und Zerstören der Mikrovilli, sowie bei STEC durch das Freisetzten von Toxinen ausgelöst. Es kommt zu schleimigen, evtl.
Blutbeimengungen aufweisenden, Durchfällen mit fibrinös-hämorrhagischer Entzündung des Darms. Meist handelt es sich bei den STEC-Stämmen um die
Serogruppe O118 (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007). Auf STEC, eine Gruppe, der die EHEC untergeordnet sind, wird später noch genauer eingegangen.
Die Colidiarrhoe tritt meist in den ersten Lebenswochen bei Kälbern, Lämmern und Ferkeln auf und wird durch enterotoxische E. coli verursacht. Die ETEC exprimieren Adhäsionsfaktoren, mit deren Hilfe sie sich an die Enterozyten anheften können. Des Weiteren bilden sie sog. hitzelabile (LT) und/ oder hitzestabile (ST) Enterotoxine, die zu einer sekretorischen Diarrhö führen (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007;
ROLLE u. MAYR 2002).
Die Coliseptikämie kommt besonders bei Kälbern, Lämmern, Ferkeln, Fohlen und Welpen in den ersten Lebenstagen vor. Durch bestehende Abwehrschwäche verläuft die Infektion mit septikämischen E. coli-Stämmen (meist der Serogruppen O26, O86, O115 und O78) akut oder perakut (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007).
Die Ödemkrankheit der Schweine wird von einer eigenen Gruppe STEC-Stämmen ausgelöst, die auch als EDEC (Edema Disease E. coli) bezeichnet wird und denen die Bildung des Shigaoxin-Typs 2e (Stx 2e) sowie die Ausbildung adhäsiver F18 Fimbrien gemein ist. Das Stx 2e gelangt über die Darmschleimhaut in den Blutkreislauf und schädigt die Endothelzellen der kleinen Arterien und Arteriolen, was zur erhöhten Gefäßpermeabitität und schließlich zu Ödemen führt. Nicht selten bilden sie zusätzlich zu Stx 2e auch α-Hämolysin und andere Enterotoxine. Die am häufigsten mit diesem Krankheitsbild assoziierten Serogruppen sind O138, O139 und O141 (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007; ROLLE u. MAYR 2002).
2.2 STEC/VTEC und EHEC
Im Jahr 1977 beschrieben KONOWALCHUK et al. (1977) erstmals das Vorkommen eines Toxins in cytotoxischen E. coli, welches Vero-Zellen in Kultur beeinflusste und deshalb von ihm als Verotoxin bezeichnet wurde. O’BRIEN et al. zeigten, dass sich Verotoxin mit Antitoxin gegen Shigella dysenteriae, Shigatoxin 1, neutralisieren lässt (O'BRIEN et al. 1982) und schließlich publizierten O’BRIEN et al., dass beide Toxine identisch sind (O'BRIEN u. LAVECK 1983). Demzufolge wird heutzutage in der Nomenklatur STEC und VTEC synonym verwendet. STEC sind meldepflichtig nach der Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten.
EHEC sind im Gegensatz zu STEC nicht direkt über das Vorliegen bestimmter Virulenzgene definiert, vielmehr wird diese Untergruppe der STEC vorrangig durch das im Menschen hervorgerufene Krankheitsbild definiert. Aufgrund der hohen genetischen Variabiliät der E. coli Isolate empfiehlt das RKI auf nationaler Ebene jedes STEC-Isolat als potentiellen EHEC anzusehen. Als EHEC definitiv bezeichnet werden sollen jedoch nur Isolate, welche aus erkrankten Menschen isoliert wurden (KARCH, persönliche Mitteilung). Die infektiöse Dosis von STEC/EHEC für den Menschen ist extrem gering und liegt bei 10-100 Bakterien (KAPER et al. 2004).
EHEC sind nach §7 Infektionsschutzgesetz meldepflichtig.
2.2.1 Virulenzfaktoren
In den Untersuchungen der letzten Jahre zur Virulenz von STEC wurde das Augenmerk vermehrt auf die Kombination von Virulenzgenen und Mechanismen gelegt, die ein STEC-Isolat zu einem hochpathogenen, humanen EHEC-Isolat machen. Unbestritten bleibt, dass die Produktion von Shigatoxinen zwar essentiell ist, nicht aber allein für die Virulenz verantwortlich gemacht werden kann. Eine große Anzahl weiterer Virulenzfaktoren wurde beschrieben; die meisten von ihnen sind auf mobilen genetischen Elementen, wie z.B. Plasmiden, Pathogenitätsinseln oder temperenten lambdoiden Phagen kodiert (CAPRIOLI et al. 2005).
2.2.1.1 Shigatoxine
Zur Familie der Shigatoxine gehören die beiden nicht immunologisch kreuzreaktiven Hauptgruppen Shigatoxin 1 (Stx 1) und Shigatoxin 2 (Stx 2), deren Strukturgene im ca. 60 kb großen Genom lambdoider Phagen, lokalisiert liegen. Stx 1 ist zu 98%
identisch mit dem von S. dysenteriae produzierten Toxin, während Stx 2 nur zu 55%
Homologie zeigt. Während Stx 1 nur geringe Sequenzvariationen aufweist, wurden von Stx 2 bereits die Varianten Stx 2c, Stx 2d, Stx 2e sowie Stx 2f mit jeweils modifizierten antigenetischen oder biologischen Eigenschaften beschrieben. So ist z.B. bekannt, dass Stx 2 und Stx 2c vermehrt von Isolaten produziert werden, welche aus HUS-Patienten stammen (KARCH 2001). Stx 2e und Stx 2f hingegen werden häufig von Tierisolaten gebildet, welche in diesen Fällen für den Menschen selten pathogen sind. In der Pathogenese der Ödemkrankheit der Schweine spielt Stx 2e
eine wichtige Rolle, Stx 2f-produzierende Isolate stammen meist vom Geflügel (CAPRIOLI et al. 2005).
Die Shigatoxine zählen zu den Ribosomen-inaktivierenden Proteinen und bestehen aus einer A- und einer B-Untereinheit. Die 32 kDa große A-Untereinheit besteht aus einem 28 kDa großen A1-Peptid und einem 4 kDa großen A2-Peptid, welche über eine Disulfidbrücke verbunden sind. Das A1-Peptid besitzt enzymatische Aktivität, während das A2-Peptid für die Bindung an die B-Untereinheit zuständig ist. Die B- Untereinheit besteht aus einem Pentamer von fünf identischen, 7,7 kDa großen Einheiten und bindet das Toxin an den Globotriasylceramid-Rezeptor (Gb3) auf eukariotischen Zelloberflächen. Das Holotoxin wird über Endocytose in die Zelle geschleust und verhindert dort die Proteinbiosynthese der Zelle, was schließlich zu deren Tod führt (FRIEDRICH 2002).
2.2.1.2 EHEC-Hämolysin
Aus pathogener Sicht für den Menschen am bedeutendsten ist die O157- Serogruppe. Fast alle EHEC O157-Stämme besitzen ein großes Virulenzplasmid (pO157) von 90 kb, auf dem die unterschiedlichsten zusätzlichen Virulenzfaktoren lokalisiert sind. Unter anderem trägt es das EHEC hly Gen für das EHEC-Hämolysin, das katP Gen für eine bifunktionelle Katalase-Peroxidase (BRUNDER et al. 1996), das espP Gen kodierend für eine Serinprotease und das etp Gencluster, welches für ein Typ-II-Sekretionssystem kodiert (KARCH 2001). Im Gegensatz zu dem Virulenzplasmid der O157:H7-Stämme besitzen jene der non-O157-Stämme meist nicht das komplette Spektrum an Virulenzgenen (KARCH 2001).
Bei dem EHEC-Hämolysin handelt es sich um ein 107 kDa großes porenbildendes Zytotoxin der RTX-Familie (repeats in toxin), das im Wildtyp sowohl frei als auch zellassoziiert vorkommt (KARCH et al. 1996a). Seine definitive Rolle in der Pahogenese von EHEC-Infektionen ist noch nicht ganz geklärt. Es ist jedoch denkbar, dass durch die Lyse der Erythrozyten in vivo Hämoglobin freigesetzt wird und E. coli als Eisenquelle dient und somit wachstumsfördernd auf diese wirkt.
Ebenso kann das Toxin bovine Leukozyten lysieren, jedoch nicht humane (NATARO u. KAPER 1998).
2.2.1.3 EAST1
Bei EAST1 handelt es sich um ein Toxin, welches erstmals in einem enteroaggregativen E. coli-Stamm (EAEC) eines an Diarrhö erkrankten Kindes entdeckt wurde (SAVARINO et al. 1991). Mittlerweile wurde EAST1 jedoch auch in anderen pathogenen E. coli wie EHEC, EPEC, DAEC oder ETEC und in Salmonellen gefunden. Auch in Nutztieren, v.a. in Schweinen und Rindern konnten EAST1- positive Isolate bereits detektiert werden. Das kodierende Gen astA liegt entweder direkt im Bakterienchromosom oder auf einem Plasmid, häufig in mehreren Kopien.
EAST1 ist ein 4,1 kDa großes Molekül, das aus 38 Aminosäuren besteht (VEILLEUX u. DUBREUIL 2006). Das hitzestabile Toxin EAST1 weißt 50% Identität mit der enterotoxischen Dömane des hitzestabilen Toxins STa auf, jedoch sind die beiden Toxine immunologisch gesehen verschieden (SAVARINO et al. 1991). Welche Rolle EAST1 in der Pathogenese von EHEC-Infektionen spielt ist noch nicht geklärt, allerdings ist es möglich, dass nichtblutige Durchfallerkrankungen, wie sie bei einigen EHEC-Patienten auftreten, durch EAST1 bedingt sind (NATARO u. KAPER 1998).
2.2.1.4 Adhäsionsfaktoren
Für die Adhärenz von EHEC an das Darmepithel sind zahlreiche Faktoren mit ihren zuständigen Genen beschrieben. Am besten untersucht und in fast allen EHEC- Stämmen vorkommend ist die 43 kb große Pathogenitätsinsel LEE (locus of enterocyte effacement). Durch die auf ihr kodierten Proteine sind EHEC in der Lage sich sehr fest an die Darmepithelzellen anzuheften und dort typische A/E-Läsionen („attaching and effacing“) zu verursachen. Die A/E-Läsionen sind durch zytoskelettalen Umbau, der Zerstörung der Mikrovilli und einer engen Bindung zwischen Bakterium und Epithelzellmembran gekennzeichnet (CAPRIOLI et al.
2005). Der LEE besitzt drei funktionale Regionen. Auf der ersten Region sind Gene für ein Typ-III-Sekretionssystem lokalisiert. Die mittlere Region beherbergt das eae- Gen. Das eae-Gen kodiert für das 94 bis 97 kDa große Außenmembranprotein Intimin, welches den EHEC zur Adhärenz dient. Gleichzeitig ist auf diesem funktionalen Modul das tir-Gen lokalisiert, welches den Translokationsrezeptor für Intimin (Tir) stellt. Der Rezeptor wird über das Typ-III-Sekretionssystem in die
Plasmamembran der Zielzelle verbracht, so dass das Intimin daran binden kann. Das dritte funktionelle Modul codiert für die Sekretionsproteine EspA, EspB und EspD, welche Teil des Typ-III-Sekretionssystems sind (CAPRIOLI et al. 2005; KARCH 2001).
2.2.2 Nachweis von STEC
Zum Nachweis von STEC stehen heutzutage kulturelle, molekularbiologische und immunologische Verfahren mit etlichen Vor- und Nachteilen zur Verfügung, von denen nachfolgend nur einige wichtige exemplarisch erwähnt werden. Während man nach bekannt werden des ersten EHEC-Ausbruches primär die Diagnostik von O157-Serovaren vorantrieb, ist man mittlerweile daran interessiert, eine praktikable Serovar-übergreifende Diagnostikmethode zu etablieren. Dies jedoch erschwert einen traditionell kulturellen Nachweis, da STEC eine hohe biochemische Ähnlichkeit zur physiologischen Darmflora aufweisen und sowohl in klinisch Erkrankten wie auch in Reservoirwirten nur einen kleinen Anteil der vorhandenen E. coli ausmachen (1/300 Bakterien) (KARCH et al. 1996a). Somit stößt auch der Einsatz von Selektivmedien aufgrund des starken Überwiegens der Begleitflora in Stuhl- und Kotproben an Grenzen.
2.2.2.1 Direkter Erregernachweis
Eine beliebte Diagnostikmethode, die i.d.R. zum Nachweis von O157:H7 genutzt wird stützt sich auf die Tatsache, dass dieser Serotyp im Gegensatz zu 95% der physiologischen E. coli-Flora kein Sorbit verstoffwechseln kann. So wachsen Sorbitol negative STEC-Stämme auf dem altbewährten Sorbitol-McConkey-Agar, der als einzige Kohlenhydratquelle Sorbit enthält, als farblose bis graue Kolonien, während Sorbitol positive Stämme als pink-farbene Kolonien erscheinen. Um die Spezifität des Nährmediums zu steigern werden diesem häufig zusätzlich Antibiotika, wie z.B.
Cefixim und Tellurit zugesetzt, welche das Wachstum der Begleitflora hemmen (ZADIK et al. 1993). Allerdings sind mittlerweile eine große Anzahl an sorbitfermentierenden STEC-Serovare bekannt, welche sich auf dem beschriebenen Nährmedium von komensaler Darmflora nicht unterscheiden, was die kulturelle
Identifikation solcher Stämme auf diesem Nährboden unmöglich macht (KARCH et al. 1996a).
Eine Alternative stellt der Enterohämolysin-Agar dar, bei dem man sich die Ausprägung des enterohämolytischen Phänotyps zu Nutze macht. Die meisten non- O157-STEC-Stämme hämolysieren, ebenso wie das Serovar O157:H7, gewaschene Schaf- oder Humanerythrozyten in Abhängigkeit von Calcium und bilden auf dem Enterohämolysin-Agar eine inkomplette Hämolysezone um die Bakterienkolonie. Da laut BETTELHEIM (1995) und BEUTIN (1989) eine enge Assoziation zwischen Shigatoxin- und Enterohämolysinproduktion besteht, sieht BETTELHEIM in dem Enterohämolysin-Agar eine adäquate Diagnostikmethode zur Identifizierung von STEC-Isolaten. Allerdings prägt nur jedes vierte EHEC-Isolat den hämolytischen Phänotyp aus, die anderen sind oft Träger des sog. „stillen“ EHEC-Hämolysin Gens und zeigen auf dem Enterohämolysin-Agar deshalb keine Hämolysezone. Sie entziehen sich somit der Detektion (KARCH et al. 1996a).
Des Weiteren stehen heutzutage sog. chromogene Nährmedien zur Verfügung, die neben Sorbit chromogene Substrate für ß-D-Glucuronidase und/oder ß-D- Galactosidase als Marker einsetzten. Allerdings sind diese Nährmedien sehr teuer, was den Einsatz beschränkt.
2.2.2.2 Immunomagnetische Separation (IMS)
Bei der immunomagnetische Separation (IMS) handelt es sich eher um eine Anreicherungsmethode als um ein Nachweisverfahren. Für die IMS werden magnetische Partikel, die mit Antikörper gegen spezifische Oberflächenantigene behaftet sind, sog. immunomagnetische Beads, eingesetzt. Diese Beads binden an das entsprechende O-Antigen und lassen sich durch Anlegen eines magnetischen Feldes separieren. Durch mehrmaliges Waschen werden begleitende Keime entfernt.
Mit dem sehr sensitiven Verfahren ist es möglich 100 EHEC pro Gramm Stuhl in Gegenwart von 107 nicht enterohämorrhagischen E. coli zu detektieren. Jedoch kann man auch mit dieser Methode keine EHEC-Reinkultur gewinnen, so dass der Einsatz eines Selektivmediums auch hier nicht ausbleibt (KARCH et al. 1996a; KARCH et al.
1996b). Waren bis vor kurzem nur immunomagnetische Beads für
Oberflächenantigene der O157-Serogruppe kommerziell erhältlich, so sind mittlerweile auch Beads für die Serovare O111, O145, O26 und O103 im Handel.
2.2.2.3 Toxinnachweis
Die Bildung von Shigatoxinen ist allen STEC gemein, weshalb der Toxin- bzw. der Toxingennachweis von größtem diagnostischem Interesse ist. Ziel ist es deshalb, eine Erregerisolierung kombiniert mit einem Toxin- und/ oder Toxingennachweis zu liefern (www.rki.de, Informationsblätter für Ärzte). Zur Detektion von Shigatoxin bzw.
stx stehen folgende gut etablierte Methoden zu Verfügung:
Verozelltoxizitätstest: Verozellen werden hierbei mit dem Kulturüberstand überschichtet und nach ca. 48-72 h Inkubation die cytotoxischen Effekte an den Verozellen beurteilt. Der Test ist in Kombination mit einem Neutralisationstest sehr sensitiv und spezifisch, allerdings auch sehr zeitintensiv (FRIEDRICH et al. 2002).
Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)/ Enzymimmunoassay (EIA): ELISA- oder EIA-Testsysteme sind in großer Variation kommerziell erhältlich. Sie sind schnell und einfach anzuwenden und weisen in Kombination mit anderen Screeningverfahren (PCR, Verozelltoxizitätstest) oder einem kulturellen Nachweis eine ausreichende Sensitivität und Spezifität auf. Die meisten erhältlichen Testsysteme arbeiten mit zwei monoklonalen Stx-Antikörpern. Der erste ist fest auf dem Testsystem fixiert, an ihm bindet das Antigen. Der zweite Antikörper ist mit einem Enzym (Meerrettich-Peroxidase oder Alkalische Phosphatase) gekoppelt, was nach Bindung mit dem Antigen und nach Zugabe eines spezifischen Substrates zu einer Farbreaktion führt. Die Toxine Stx 1 und Stx 2 können von den meisten Testsystemen getrennt voneinander nachgewiesen werden.
Colonyblot: Der Colonyblot eignet sich sowohl zum Toxingen-Nachweis als auch gleichzeitig zum Erregernachweis. Mittels einer Shigatoxin-spezifischen Gensonde kann auf Nitrocellulosemembran gebundene, stx-tragende Bakterien-DNA sichtbar gemacht werden. Dies geschieht durch radioaktive Markierung oder enzymatische Reaktionen (HULL et al. 1993; KARCH H. et al. 1986). Die als stx-positiv identifizierten Kolonien können von der geblotteten Agarplatte isoliert werden. Das Verfahren ist sensitiv, jedoch auch recht zeitintensiv und deshalb für die Routinediagnostik nur bedingt geeignet.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR): Die PCR ist eine weitverbreitete, nicht nur in der STEC-Diagnostik genutzte Methode, die in den meisten Diagnostiklaboren routinemäßig eingesetzt wird. Ebenso wie der ELISA oder EIA kann die PCR zur Serovar- unabhängigen Toxingen-Diagnostik eingesetzt werden. Diverse Protokolle wurden zu diesem Zweck bereits etabliert (FRANCK et al. 1998a; MONDAY et al.
2007; PATON u. PATON 1998; WANG et al. 2002).
Da die EHEC/STEC-Diagnostik bundesweit nicht einheitlich geregelt ist, wurde im Jahre 2000 ein sog. Stufenplan der EHEC-Diagnostik vom Arbeitskreis „EHEC“ des Robert-Koch Instituts (RKI), dem Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) mit Unterstützung der Fachgruppe
„Gastrointestinale Infektionen“ der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) entwickelt (FRUTH et al. 2000). Der Plan sieht folgende drei Diagnostikstufen vor:
Stufe 1: Screening auf Shigatoxinbildner durch Anreicherung der Probe in einem EHEC-Direktmedium mit anschließendem Toxinnachweiß mittels ELISA. Im positiven Fall wird eine Verdachtsdiagnose an das zuständige Gesundheitsamt gestellt und Stufe 2 des Plans wird eingeleitet.
Stufe 2: Isolierung und Charakterisierung der EHEC-Bakterien. Der ELISA-Befund wird durch PCR bestätigt und durch einen Colony-Immunoblot wird das entsprechende Agens isoliert. Eine Serotypisierung folgt.
Stufe 3: Typisierung der Erregerisolate zu epidemiologischen Zwecken durch Lysotypie, Bestimmung des Pulsefeld-Gelelektrophoresemusters, Bestimmung weiterer Virulenzfaktoren oder Antibiotikaresistenzbestimmungen etc.
2.2.3 Epidemiologie von STEC/EHEC beim Menschen
Aufmerksam auf STEC/EHEC beim Menschen wurde man erstmals 1982 während eines Ausbruches in Oregon und Michigan, USA, als 47 Menschen nach einem Besuch in einer Fastfoodkette an abdominalen Krämpfen, anfänglich wässriger und später blutiger Diarrhö litten. Aus ihren Stühlen konnten Shigatoxin-produzierende E.
coli des Serotyps O157:H7, der EHEC-Prototyp, isoliert werden (RILEY et al. 1983).
Seitdem werden immer wieder Ausbrüche mit diesem Zoonoseerreger verzeichnet.
E. coli O157:H7 ist deutschlandweit mit fast 50% der am häufigsten ursächlich mit
der Erkrankung Hämolytisch urämisches Syndrom (HUS) assoziierte Serotyp (Gerber et al. 2002; Karch et al. 2005). In den USA ist dieser Serotyp laut Untersuchungen sogar an ca. 95% der HUS-Fälle beteiligt (Karch et al. 2005). O157:H7 ist mittlerweile weltweit Ursache für diverse EHEC-Ausbrüche v.a. in Industrieländern wie Nordamerika, Japan und Europa. Einer der bisher größten war der von FUKUSHIMA et al. (1999) in Sakai City beschriebene Fall, bei dem es zu über 12.000 erkrankten Schulkindern kam.
Der neuste und bisher schwerste EHEC-Ausbruch in Deutschland wurde im Frühjahr 2011 verzeichnet. Von Mai bis Juli wurden insgesamt 3842 offizielle Erkrankungsfälle gemeldet, die mit dem EHEC-Serotyp O104:H4 in Verbindung standen, wobei 2987 Fälle akuter Gastroenteritis sowie 855 HUS-Fälle dokumentiert wurden. Gemessen an den HUS-Erkrankungszahlen handelt es sich um den bisher größten Ausbruch weltweit. Anders als bei den bisherigen Ausbrüchen waren v.a. Erwachsene, darunter vermehrt Frauen betroffen. Die Mortalität der HUS-Erkrankten betrug 4,1%
(35), die der Gastroenteritis-Erkrankten 0,6% (18). Der Ausbruch fand v.a. in den nördlichsten fünf Bundesländern Deutschlands statt, obwohl Infektionen aus allen Bundesländern berichtet wurden. Als Infektionsvehikel konnten Bockshornkleesprossen aus einem Betrieb in Niedersachsen identifiziert werden (RKI EHEC-ABSCHLUSSBERICHT 2011).
In den meisten Fällen sind die Infektionen nahrungsmittelassoziiert, wobei Rindfleischprodukte, insbesondere unzureichend erhitztes Hack und Mett, im Fordergrund stehen (GRIFFIN u. TAUXE 1991a). Ausbrüche wurden allerdings auch durch Rohmilch und Rohmilchprodukte, Kopfsalat, Kartoffeln und unpasteurisierten Apfelsaft verursacht (ARMSTRONG et al. 1996; CODY et al. 1999). Im Jahr 1994 erkrankten 20 Menschen in Washington und Kalifornien nach dem Verzehr von geräucherter, vorgeschnittener Salami, woraufhin E. coli O157:H7 aus zwei der Charge entnommenen Salamiproben isoliert werden konnte. Untersuchungen zeigten, dass der Räuchervorgang zwar die Vermehrung von EHEC in der Salami verhindert, die vorhandenen Mikroorganismen jedoch nicht abgetötet werden (ALEXANDER 1995). Der größte mit Trinkwasser in Verbindung stehende Ausbruch ereignete sich im Jahr 2000 in Kanada. Etwa 2300 Menschen infizierten sich mit
O157:H7 verseuchtem Wasser, wovon sieben starben (HOLME 2003). Auch hier ist bekannt, dass E. coli O157:H7 nach einer 12-wöchigen Wasserpassage lediglich seine Kultivierbarkeit, jedoch nicht seine Infektiösität verliert (KARCH et al. 1999).
Der bis 2011 größte europäische Ausbruch ereignete sich 1996 in Schottland, bei dem 20 Menschen starben, nachdem sie alle Fleisch aus derselben Fleischerei konsumiert hatten (DUNDAS et al. 2001). BOUDAILLIEZ et al. (1997) beschrieben die zwischenmenschliche Infektion durch klassische Schmierinfektionen bei einem O111-EHEC-Stamm als durchaus ernstzunehmendes, potentielles Risiko.
Obwohl die meisten EHEC-Ausbrüche mit den genannten Risikofaktoren in Verbindung stehen und schlussendlich darauf zurückzuführen sind, treten bis zu 80%
der diagnostizierten O157-STEC-Infektionen sporadisch. In einer Fall-Kontrollstudie untersuchten WERBER et al. (2007) neben kontaminierten Lebensmitteln weitere, mögliche Infektionsquellen, die mit sporadischen EHEC-Infektionen im Menschen in Zusammenhang stehen. Sie kamen zu dem Schluss, dass sowohl Risikofaktoren als auch die Verteilung der Serotypen abhängig von der Altersgruppe differieren. So stellen der Verzehr von Rohmilch und das Spielen im Sandkasten ebenso wie das Streicheln von großen und kleinen Wiederkäuern bei Kindern unter drei Jahren ein erhöhtes Risiko dar, wohingegen sich bei Kindern zwischen drei und neun Jahren eine Korrelation zwischen Erkrankung und Schwimmen in nicht gechlortem Wasser (Teich, See, privater Swimmingpool) zeigte. Bei Kindern ab zehn Jahren konnte der Konsum von Lammfleisch und Streichmettwurst als hauptsächlicher Risikofaktor identifiziert werden (WERBER et al. 2007). O’BRIEN et al. (2001) befragten in einer englischen Fall-Kontrollstudie 369 Patienten nach ihren Expositionen im Beruf, Haushalt und Freizeit in den letzten fünf Tagen vor ihrer EHEC-Erkrankung. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass die Gefahr einer STEC-O157-Infektion signifikant höher war, wenn die Patienten Kontakt zu landwirtschaftlicher Umgebung, mit oder ohne Tierkontakt, hatten.
Bei E. coli O157:H7 handelt es sich um jenen Serotypen, der am häufigsten mit schweren Erkrankungen in Verbindung steht, inzwischen jedoch sind eine Vielzahl weiterer Serogruppen bekannt, welche aufgrund ihrer Virulenzfaktoren zu pathogenen Veränderungen beim Menschen führen. Die große Variabilität der
STEC-Serovare, welche in Europa mit Erkrankungen assoziiert sind, konnte in anderen Kontinenten und Gebieten bisher nicht nachgewiesen werden. Zirka 80%
der durchfallassoziierten STEC gehören sog. non-O157 Serogruppen an, hauptsächlich O26, O103, O111, O113 und O145. Der O26:H11/ NM-Serotyp ist nach O157 derjenige in Europa, welcher am häufigsten in Verbindung mit Erkrankungen nachgewiesen wird. Eine Studie in Deutschland zeigte, dass rund 1/7 aller EHEC-Isolate, welche von HUS-Patienten isoliert werden, diesem Serotyp angehören (GERBER et al. 2002). Bei der zweithäufigsten non-O157 EHEC Serogruppe handelt es sich in Deutschland um die O145-Serogruppe. Zusammen mit EHEC O26 waren diese beiden Serogruppen in den Jahren 1997-2005 für rund 88% der HUS-Fälle in Deutschland verantwortlich (Stand 2005). Die Rolle der non- O157-Stämme wird jedoch wahrscheinlich immer noch unterschätzt, da die meisten Labore routinemäßig nicht auf non-O157 Serogruppen untersuchen und auch sorbitolfermentierende Isolate (wie z.B. SF EHEC O157:NM) auf Sorbitol-McConkey- Selektivagar selten oder gar nicht diagnostiziert werden (KARCH et al. 1999).
2.2.4 EHEC-Erkrankungen beim Menschen
In den letzten 30 Jahren konnten sich EHEC weltweit und kontinuierlich ausbreiten und treten mittlerweile nach Salmonellen, Campylobacter und Yersinien als vierthäufigster bakterieller Enteritiserreger in Erscheinung (http://www3.rki.de/SurvStat/QueryForm.aspx, letzter Zugriff 30.03.2013). Oft verlaufen EHEC-Infektionen asymptomatisch und unbemerkt, nicht selten jedoch sind sog. YOPIs (young, old, pregnant, immunosuppressed), d.h. junge, alte, schwangere sowie immunsupprimierte Menschen von intestinalen und extraintestinalen Folgekomplikationen betroffen. Das Krankheitsbild entwickelt sich nach einer Inkubationszeit von 3-4 Tagen, abhängig von der Infektionsdosis (KARCH et al. 2005).
2.2.4.1 Hämorrhagische Colitis (HC)
Die HC ist eine Dickdarmentzündung mit zunächst wässriger, später wässrig-blutiger Diarrhö, die bei 20% der infizierten Kinder und der infizierten über 65-Jährigen auftritt und als Risikofaktor für weitere Komplikationen gilt. Sie ist neben der Diarrhö durch
abdominale Krämpfe, Übelkeit, Erbrechen und Fieber gekennzeichnet (KARMALI 1989).
2.2.4.2 Hämolytisch-Urämisches Syndrom (HUS)
Das HUS ist eine extraintestinale Folgekomplikation der HC, die sich bei 5-10% der manifest Erkrankten entwickelt. Die Inzidenz liegt in Deutschland und Österreich zwischen 0,7 bis 1,0/100.000 Kinder unter 15 Jahren. In Argentinien liegt diese bei über 20/100.000. Erfahrungsgemäß treten die meisten HUS-Fälle bei Kindern zwischen dem ersten und fünften Lebensjahr auf, obwohl die Erkrankung generell jede Altersgruppe betreffen kann (ZIMMERHACKL et al. 2002).
Das sich zunächst bessernde klinische Erscheinungsbild der anfänglichen Diarrhö entwickelt sich bei einem kompletten HUS binnen einer Woche zu einem Symptomtrias, welcher aus einer hämolytischen Anämie, akutem Nierenversagen und einer Thrombozytopenie besteht (TARR et al. 2005). Die Letalität liegt bei 1-3%, zwei Drittel der Erkrankten werden dialysepflichtig und bei bis zu 50% kommt es noch nach 10 bis 15 Jahren zu Folgeerkrankungen wie z.B. chronischer Niereninsuffizienz, arterieller Hypertonie oder Proteinurie. Neben dem kompletten HUS werden auch inkomplette Verläufe in Form von isolierter hämolytischer Anämie mit Pankreatitis oder nicht selten zentralnervösen Störungen als Folge gesehen (ZIMMERHACKL et al. 2002).
Hauptauslösender Faktor für das HUS sind die von STEC gebildeten Shigatoxine.
Über die Darmwandbarriere gelangen sie in den Blutstrom und mit diesem schließlich zur Niere. Shigatoxine binden an Glykosphingolipid-Rezeptoren der Zielzelle, in erster Linie an Globotriaosylzeramid (Gb3), welches in Nierenendothelzellen besonders präsent ist und hemmen somit die Proteinbiosynthese der Zelle. Die Endothelzellen werden geschädigt und der von- Willebrand-Faktor (vWF) wird freigesetzt, was zur Aktivierung der Gerinnungskaskade führt. Zusammen mit der Endothelschädigung und Freilegung der Basalmembran werden Thrombozyten verbraucht und es kommt zu einer generalisierten Thrombozytopenie. Durch das lokale Wirken der Toxine an den Nierenepithelzellen werden diese ebenfalls zerstört, wodurch es zu tubulären Nekrosen und somit zu einer eingeschränkten Nierenfunktion kommt.
2.2.4.3 Thrombotisch-thrombozytopenische Purpura (TTP)
Die TTP, nach ihrem Erstbeschreiber auch Morbus Moschkowitz genannt, weist klinisch sehr viele Gemeinsamkeiten mit dem HUS auf. In beiden Fällen handelt es sich um eine mikrovaskuläre Störung aufgrund von Thrombozytenaggregationen, welche jedoch mit großer Wahrscheinlichkeit auf unterschiedlichen pathologischen Auslösern beruht. Bei der thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura aggregiert freigesetzter von-Willebrand-Faktor. Der für die Proteolyse zuständige „vWF- cleavage factor“ wird allerdings durch Antikörper gehemmt, so dass es zur lokalen Thrombenbildung kommt (FURLAN et al. 1998). Die beschriebene Symptomtrias besteht aus einer Thrombozytopenie und damit verbundenen Hautpetechien sowie durch die mechanische Schädigung und Zerstörung der Erythrozyten aus einer Anämie. Im Gegensatz zum HUS sind von der TTP häufiger Erwachsene betroffen, deren Krankheitsbild von neurologischen Dysfunktionen (z.B. Ausfälle der Motorik, Sensibilität, des Bewusstseins, der Sprache sowie der Sehkraft) dominiert wird.
Trotzdem treten immer wieder Formen der TTP auf, bei denen es zu schwerwiegenden Nierenproblematiken kommt und gleichzeitig werden auch immer wieder Formen des HUS mit extrarenalen Komplikationen beschrieben, weshalb eine exakte Trennung der Syndrome oft schwer ist (GRIFFIN u. TAUXE 1991b).
2.2.5 Epidemiologie von STEC bei Tieren
Shigatoxin-produzierende Escherichia coli wurden bereits in vielen unserer Haus- und Wildtiere, sowie in deren Produkten nachgewiesen. Untersuchungen zu Übertragungswegen und den Ursachen menschlicher Infektionen mit STEC haben gezeigt, dass eine Übertragung auf den Menschen durch Kontakt zu Tieren und deren Umwelt möglich ist (HEUVELINK et al. 2002; O'BRIEN et al. 2001). Als wichtigste Infektionsquelle werden große und kleine Wiederkäuer angesehen, welche in großer Zahl asymptomatische Ausscheider sind (BLANCO et al. 2003b; ORDEN et al. 2003). Die Zahl von STEC in Wiederkäuerexkrementen variiert unter Umständen abhängig vom Alter der Tiere. In Infektionsversuchen mit O157 konnte gezeigt werden, dass die Ausscheidungsrate bei Kälbern höher und länger andauernd war als in erwachsenen Rindern und dass die Ausscheidungsrate nach dem Absetzen
überwiegend anstieg (CRAY, JR. u. MOON 1995). Die Prävalenz von STEC in Rindern ist ebenso abhängig von der Jahreszeit. Höhere Ausscheidungsraten wurden in den warmen Sommermonaten verzeichnet, ebenso wie höhere Erkrankungsraten beim Menschen (CHAPMAN et al. 1997). Prävalenzstudien über das Vorkommen von STEC in europäischen Rinderbständen sprechen von bis zu 83% positiv getesteter Herden. Die dabei am häufigsten isolierten Serovare waren O8, O20, O22, O77, O113, O126 und O162 (CAPRIOLI et al. 2005). BEUTIN et al.
veröffentlichten 1993 eine Studie über die Prävalenz von STEC rund um Berlin in sieben verschiedenen, gesunden Haustierarten. Von 720 Tieren waren 208 (28,9%) STEC positiv, das entsprach 66% der untersuchten Schafe, 56,1% der Ziegen, 21,1% der Rinder, 7,5% der Schweine sowie 13,8% der Katzen, 4,8% der Hunde und
<0,7% der Hühner (BEUTIN et al. 1993). In einer Veröffentlichung aus dem Jahre 2000 sprechen ZSCHOCK et al. (2000) von einer STEC-Prävalenz in Hessen von 18,0% bei Rindern, 32,1% bei Schafen und 75,3% bei Ziegen (ZSCHOCK et al.
2000). Eine Prävalenzstudie von OPORTO et al. (2008) in Nordspanien an 345 Viehherden (17 Schweineherden, 122 Milchschafherden, 124 Mastrinderherden und 82 Milchkuhherden) ergab eine Prävalenz des Serotyps O157:H7 von 8,7% der Schafherden, 7,0% der Milchkuhherden sowie 1,6% der Mastrinderherden. Das Vorkommen von non-O157 STEC-Stämmen war vergleichbar mit den Ergebnissen von ZSCHOCK et al. (in Schafherden 50,8%, in Milchkuhherden 20,7%, in Mastrinderherden 46,0%). Bei den Schweinen konnten weder O157:H7 positive noch non-O157 positive Herden identifiziert werden. Um die Präsenz von Shigatoxin- produzierenden E. coli in Legehennen zu evaluieren, untersuchten DIPINETO et al.
(2006) vier intensiv geführte Legehennenbetriebe in Süditalien. Zwischen November 2004 und November 2005 wurden die Betriebe dreimal beprobt und 720 Proben mit Hilfe der immunomagnetischen Separation und einer Multiplex-PCR auf STEC untersucht. Von den 720 untersuchten Proben waren lediglich 26 (3,6%) positiv, welche aus 50% der Betriebe (2 von 4) stammten. Dennoch sehen DIPINETO et al.
in Hühnern eine neue potentielle Quelle für EHEC-Übertragungen auf den Menschen. In einem Infektionsversuch konnten SCHOENI und DOYLE (1994) die Langzeitkolonisation und Langzeitausscheidung von O157:H7 in Hühnern zeigen,
sowie die Kontamination der Eierschalen mit O157:H7 belegen. Dementsprechend gehen auch diese Autoren davon aus, dass Hühner möglicherweise neue Überträger dieses Humanpathogens sein könnten. HOGG und Kollegen (2009) beschrieben in einem Fallbericht STEC-Übertragungen von Hunden auf Menschen, nachdem diese mit den Hunden intensiven Kontakt hatten. Aus ihren Stühlen konnten nicht- sorbitolfermentierende STEC der Seroguppe O157 isoliert werden, ebenso wie aus Kotproben der zwei Hofhunde. Dieser Report zeigte, dass auch Haustiere, die nicht zu den klassischen Reservoirtieren gehören, sondern nur als Kurzzeitvektoren angesehen werden, durchaus STEC auf den Menschen übertragen können. Im Gegensatz dazu publizierten PIERARD et al. (1999) eine negative Korrelation zwischen Kontakt zu Hunden und STEC-Infektionen. Die Autoren diskutierten eine mögliche Immunität, die durch die Langzeitexposition mit geringen Dosen niedrigpathogener STEC (z.B. Intimin negative Stämme) ausgehend von den Hunden erlangt werden könnte. Als neues Reservoirtier für STEC beschrieben GARCIA und FOX (2003) Hauskaninchen, erworben von einem kommerziellen Händler, sowie SCAIFE et al. (2006) Wildkaninchen. Ausschlaggebend für die Untersuchungen von SCAIFE et al. waren Besucher eines Wildtierparks, die sich im Sommer 2001 mit EHEC O157 infizierten. Die Wildkaninchen im Park teilten sich das Gehege mit O157 positiven Rindern und so untersuchte SCAIFE et. al. 16 Rinderherden, die eng zusammen mit Wildkaninchenpopulationen lebten. In sieben der 16 Farmen waren die Rinder O157 positiv und in sechs dieser sieben konnten auch die Wildkaninchen als positiv identifiziert werden. Da Kaninchen oft als Streicheltiere in Zoos gehalten werden, oder aber Wildkaninchen in Tierparks oft Zugang zu Picknickwiesen haben, könnten auch Kaninchen potentielle STEC- Überträger sein.
2.2.6 EHEC/STEC in Streichelzoos
Immer wieder wird von EHEC-Ausbrüchen durch Tierkontakt, insbesondere durch große und kleine Wiederkäuer, in Streichelzoos und durch Tierkontaktzonen auf Bauernhöfen berichtet. Trotzdem gibt es bisher nur wenige flächendeckende epidemiologische Studien über die potentielle Gefahr der Streichelzoos als Übertragungsweg. HEUVELINK et al. (2002) beschrieben 2002 den Zusammenhang
eines 17-Monate alten, an HUS erkrankten Jungen mit einem vorangegangenen Besuch eines Streichelzoos. STEC O157-Stämme konnten aus drei Ziegen und drei Schafen dieses Zoos isoliert werden. Durch Pulsfeld-Gelelektrophorese konnte gezeigt werden, dass sich die Isolate weder untereinander noch von dem Humanisolat des Jungen unterschieden. Daraufhin untersuchten HEUVELINK zwölf weitere niederländische Streichelzoos und identifizierte drei davon als STEC-positiv.
Eine epidemiologische Studie führten ebenfalls HEUVELINK und Kollegen (2007) durch, als sie zwischen 2002 und 2004 307 Streichelzoos in den Niederlanden auf darmpathogene Erreger untersuchten. Als STEC-O157 positiv erwiesen sich rund 12% der untersuchten Institutionen. Allein in den Jahren 2004 und 2005 wurden in North Carolina, Florida und Arizona drei EHEC-Ausbrüche beschrieben, die jeweils mit dem Besuch von Streichelzoos und dem damit verbundenen Wiederkäuerkontakt assoziiert waren. Infektionsquellen waren Ziegen, Schafe und Rinder. In North Carolina erkrankten 108 Menschen, in Florida handelte es sich um 63 Erkrankte und zwei Erkrankungen traten in Arizona auf (DAVIES 2005). Im Jahre 2009 veröffentlichte der Morbidity and Mortality Weekly (ALELIS 2009) einen Bericht über einen STEC-O157 Ausbruch in einem Streichelzoo in Florida im Jahr 2007. Sieben Kinder einer Tagesferienfreizeit zeigten intestinale Symptome, nachdem sie Kontakt zu den Streicheltieren hatten. Bei nachfolgenden Untersuchungen konnten aus Stuhlproben von vier der Patienten ebenso wie aus Ziegenkot und Bodenproben aus dem Streichelzoo O157-STEC mit identischem Pulsfeld-Gelelektrophorese Profil isoliert werden (ALELIS 2009). Auch WERBER et al. (2007) identifizierte in seiner Fall-Kontrollstudie das Streicheln von Wiederkäuern als potentielle Gefahrenquelle.
Im Gegensatz dazu untersuchten KEEN et al. (2007) in den Sommern 2003 und 2004 Streichelzoos in durch die Association of Zoos and Aquariums (AZA) akkreditierten Zoos in den USA und kamen zu einer nur sehr geringen STEC-O157 Prävalenz von 0,1% der Proben (1 aus 997). Dies erklärten sie unter anderem mit dem standardisierten Management, den hohen Hygienestandards, routinemäßiger Quarantäne der Tiere sowie dem geringeren Infektionsdruck durch das Fehlen angrenzender Landwirtschaft der AZA-akkreditierten Zoos.
Da die Tiere in der Regel symptomlose Reservoire der Erreger sind, ist es für Tierparkbetreiber besonders schwer, infizierte Tiere zu identifizieren, weshalb Besucher auf die bestehende Transmissionsgefahr hingewiesen werden und zur Vermeidung von Risikoverhalten angehalten werden sollten. Inwiefern Besucher solches Risikoverhalten ausüben, haben MCMILLIAN et al. (2007) und WEESE et al.
(2007) in ihren Beobachtungsstudien untersucht. Sie fanden heraus, dass nur ca.
38% der Besucher die vorhandenen Händedesinfektionsmittel bzw.
Handwaschbecken benutzen, und dass dies abhängig von der Lokalität dieser war.
Erfreulicherweise verhielten sich Kinder vorbildlicher als Erwachsene. Trotzdem stellten MCMILLIAN et al. (2007) fest, dass 49% der Besucher unmittelbar nach dem Streicheln der Tiere mit den Händen auch ihr Gesicht berührten sowie 22% in den Gehegen aßen oder tranken. Einige Eltern gaben ihren Kindern im Gehege sogar Babyfläschchen (in 50% der Zoos), Schnuller (in 71% der Zoos) oder Trinklerntassen (in 56% der Zoos). Aufgrund des fehlenden Bewusstseins der Bevölkerung im Hinblick auf die Zoonosegefahr ist eine Sensibilisierung sowohl der Besucher als auch der Parkbetreiber indiziert und nötig.
2.3 Haltung von Tieren in Streichelzoos
2.3.1 Zoologische Gärten, Tierparks, Tiergärten
Die Bezeichnungen Zoo (Kurzform für Zoologischer Garten), Tierpark oder Tiergarten werden heutzutage größtenteils synonym verwendet, eine klare Abgrenzung bzw. Definition der einzelnen Begriffe gestaltet sich schwierig. Verstand man früher unter dem Begriff Tiergarten eine Art Oberbegriff für Schautierhaltungen, benutzt das Gesetz seit Einführung der EU-Zoorichtlinien 1999 den Begriff Zoo als Sammelbegriff für Schautierhaltungen, die länger als sieben Tage im Jahr in einer festen Einrichtung bestehen und eine adäquate Anzahl lebender Wildtiere aufweisen (EU-Richtlinie [1999/22/EG] über die Haltung von Wildtieren in Zoos, Art. 2).
Dementsprechend können heutzutage laut EU-Zoorichtlinie auch kleinere Betriebe ohne beachtlich großen Wildtierbestand, den man früher unmittelbar mit jenem Begriff verband, den Namen Zoo führen (Deutsche Tierparkgesellschaft, www.deutsche-tierparkgesellschaft.de, letzter Zugriff 15.05.2011). Aufgrund des
geschichtlichen Hintergrunds versteht man unter einem Zoo jedoch primär einen wissenschaftlich geführten Park, wobei sich solche Einrichtungen heutzutage ebenso auch als Tierpark oder Tiergarten benennen (Deutsche Tierparkgesellschaft, www.deutsche-tierparkgesellschaft.de letzter Zugriff 15.05.2011, Wikipedia, http://de.wikipedia.org/wiki/Zoo, letzter Zugriff 15.05.2011).
Im Verband deutscher Zoodirektoren (VDZ), der Deutschen Tierpark-Gesellschaft (DTG) sowie im Deutschen Wildgehege-Verband (DWV) sind deutschlandweit rund 200 Zoos, Tier- und Wildparks organisiert. Hinzu kommen schätzungsweise über 500 kleine, öffentliche Tierhaltungen, von denen ca. 400 Zoos im Sinne der EU- Zoorichtlinien darstellen. Die jährlichen Besucherzahlen können aufgrund der zahlreichen nicht in Verbänden organisierten Einrichtungen nur grob geschätzt werden. Der Verband deutscher Zoodirektoren schätzt die bundesweite Besucheranzahl auf ca. 60 Millionen pro Jahr, womit Tierparks zu den beliebtesten Freizeiteinrichtungen mit Bildungsauftrag gehören (VDZ, Verband deutscher Zoodirektoren, www.zoodirektoren.de, letzter Zugriff 15.05.2011).
Ein Zoo hat sich durchaus als Bildungsstätte zu verstehen, dessen Aufgabe die Aufklärung der Besucher über die verschiedensten Tierarten und ihre Vielfalt sowie ökologische und biologische Zusammenhänge sein sollte. Ein weiteres Aufgabenfeld ist das Betreiben und Vermitteln von Arten- und Naturschutz und dem damit verbundenen Erhalten bedrohter Tierarten im Rahmen koordinierter Nachzuchtprogramme. Forschung wird in zoologischen Einrichtungen im Rahmen der Möglichkeiten v.a. in den Bereichen Tiergartenbiologie vorgenommen, wobei hier mit Universitäten, Hochschulen und anderen Tierparks kooperiert wird. Nicht zuletzt sollen Zoos jedoch immer noch Erholungsstätten und Orte der Freizeitgestaltung sein, an denen Menschen, die sonst keine Möglichkeit zu Tierkontakten haben, dieser ermöglicht wird (VDZ, Verband deutscher Zoodirektoren, www.zoodirektoren.de, letzter Zugriff 15.05.2011).
2.3.2 Wildparks, Wildgehege
Die Begriffe Wildpark oder Wildgehege lassen sich im Vergleich zu den vorhergenannten Begrifflichkeiten recht gut definieren und von Zoos, Tierparks oder Tiergärten abgrenzen. Während Letztgenannte meist ein weites, durchaus auch
exotisches Artenspektrum aufweisen, werden in Wildparks und Wildgehegen meist oder sogar ausschließlich heimische Wildtiere und/oder Haustierrassen gehalten.
Allerdings sind viele dieser Parks trotzdem Zoos im Sinne der EU-Zoorichtlinien (Deutsche Tierparkgesellschaft, www.deutsche-tierparkgesellschaft.de, letzter Zugriff 15.05.2011). Im Deutsche Wildgehege Verband (DWV) sind zurzeit etwa 150 Einrichtungen organisiert, die eine Gesamtfläche von ca. 25.000 ha und rund 8,8 Millionen Besucher jährlich aufweisen (Deutscher Wildgehege Verband, www.wildgehege-verband.de, letzter Zugriff 15.05.2011).
2.3.3 Freizeitparks mit Tieranteil
Die meisten Freizeitparks sind definiert als dauerhaft angelegte Vergnügungsparks, in denen Fahrgeschäfte, Shows, Ausstellungen etc. angeboten werden (Wikipedia, http://de.wikipedia.org/wiki/Freizeitpark, letzter Zugriff 15.05.2011). Ein weites Tierartenspektrum weisen solche Parks in der Regel nicht auf, da es sich aus juristischer Sicht bei Freizeitparks lediglich um Spielplätze, welche auch für die
Erwachsenenwelt angedacht sind, handelt (Wikipedia, http://de.wikipedia.org/wiki/Freizeitpark, letzter Zugriff 15.05.2011). Nicht wenige
Freizeitparks bieten jedoch zur Steigerung der Parkattraktivität neben Fahrgeschäften, Shows o.ä. auch Streichelgehege, die eine geringe Auswahl an Tieren, wie z.B. Ziegen, Schafe oder andere Haustiere beherbergen. Konkrete Zahlen über die Tierhaltung in Freizeitparks sind nicht bekannt.
2.3.4 Streichelzoos, Streichelgehege
Als sog. Streichelzoos oder Streichelgehege versteht man Tierhaltungen, in denen Tiere von Besuchern gestreichelt und oftmals auch gefüttert werden können. Sie sind zumeist Teil größerer Einrichtungen wie Zoos, Wildgehege oder Freizeitparks. Die ersten Streichelgehege gab es bereits in den 30er Jahren des 20. Jahrhunderts. Der Begriff Streichelzoo wurde jedoch erst durch den Veterinär Wolfgang Salzert geprägt (Wikipedia, http://de.wikipedia.org/wiki/Streichelzoo, letzter Zugriff 15.05.2011).
Streichelzoos sind besonders bei Kindern sehr beliebt, v.a. weil nur wenige Kinder heutzutage noch die Möglichkeit haben, mit Nutztierrassen in so engen Kontakt zu treten. Kinder, denen eine eigene Tierhaltung verwehrt bleibt, lernen so die
Bedürfnisse anderer Lebewesen kennen und respektieren. Für viele Stadtkinder ist ein Streichelgehege die einzige Möglichkeit, Tiere hautnah zu erleben.
Als Bewohner solcher Gehege werden meist Tierarten gewählt, die ruhig und robust im Umgang mit Besuchern sind, die Kontakt mit Menschen nicht scheuen und von denen keine ausgesprochene Verletzungsgefahr für die Besucher ausgeht (Wikipedia, http://de.wikipedia.org/wiki/Streichelzoo, letzter Zugriff 15.05.2011). Dazu gehören vor allem kleine Wiederkäuer wie Ziegen und Schafe der unterschiedlichsten Rassen, Kaninchen und Meerschweinchen, aber auch Ponies, Esel und Rinder erfreuen sich immer größerer Beliebtheit.
In modernen, tiergerechten Streichelgehegen verfügen die Tiere über ein Rückzugsgebiet, zu dem der Besucher keinen Zutritt hat. Auch das Füttern der Tiere durch den Besucher geschieht in fast allen Streichelzoos mit streichelzooeigenem, vom Betreiber zur Verfügung gestelltem Futter.
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien A
Analysewaage, (80-400g) Sartorius (Hannover) Analysewaage, BA 61 (0-60g) Sartorius (Hannover B
Bio-Linker®BLX (cross linker) über LTF-Labortechnik (Wasserburg) Blotpapier, Whatman (3mm) Schleicher&Schuell (Dassel) Bunsenbrenner FIREBOY plus Integra Bioscience (Gießen)
E
Eismaschine, SPR 75 Nordcap New Brunswick Scientific (Edison, USA)
Elektrophoresekammer (DNA) OWL (Porthmouth, USA) F
Filterspitzen TipOne® (steril 0,1-1000µl) Starlab (Ahrensburg) G
Gefrierschrank (-80°C), Sorvall® Heraeus, Kendro (Hanau) Geldokumentationsgerät, IMAGO B&L Systems (Marsen, Niederlande) H
Hybridisierungsofen/-flasche Biometra (Göttingen) K
Kühlbox Cool Fun AS-15 Waeco (Emsdetten) Kühlschrank (4,0°C) Liebherr
Kühlzentrifuge, Sorvall® RC6 Du Pont (Bad Homburg) mit Rotor SA600
M
Magnethalterung IBA (Göttingen) Magnetrührer, LR 12, Mettler Landgraf (Hannover) Mikrowelle Panasonic (Hannover)
Mikrotiterplatte (96-well) Sarstedt (Nümbrecht) N
Nitrocellulosemembran, Protran BA85 Schleicher & Schuell (Dassel) P
Pipetteboy TECNOMARA (Fernwald)
Pipetten Eppendorf (Tespe)
Pipetten Gilson (Frankreich)
R
Reagenzglas-Rotator GFL (Burgwedel) Reaktionsgefäße 1,5ml, 2,0ml Sarstedt (Nümbrecht) Reaktionsgefäße 0,2ml mit Deckel Bioplastics (Niederlande) (Thin-wall 8-tube strip)
S
Schüttelinkubator, Innova 4000 New Brunswick Scientific Slot-Blot-Apparatur Hybri.Slot 24 Biometra (Göttingen) Spannungsgerät, PowerPac 300 Biorad (München)
Sterilbank, NUAIRE® Biologial Zapf Instrumente (Sarstedt) Safety Cabinets
Sterilfilter (0,45µm) Millipore (Eschborn) T
Thermocycler, Mastercycler Eppendorf (Tespe) Tischzentrifuge, Centrifuge 5415 C Eppendorf (Tespe) V
Vortex Heidolph (Hannover)
W
Wasserbad (Schüttel-) GFL (Burgwedel) Z
Zentrifugenröhrchen (PP 15ml) Greiner Bio-One (Frickenhausen) 3.1.2 Chemikalien und Reagenzien
A
Agar Agar Oxoid (Hampshire, England)
Agarose Biozym Scientific (Hess. Oldendorf) Albumin-Fraktion V (BSA) Roth (Karlsruhe)
A. bidest (DNase/RNase u. Endotoxin-frei) Sigma (Deisenhofen) Anti-Digoxigenin-POD (poly), Fab Fragments Roche (Mannheim) B
Bacto®-Trypton Becton Dickson (Heidelberg)
Borsäure Roth (Karlsruhe)
Bromphenolblau Merck (Darmstadt) C
Cefixime-Tellurite selective supplement Oxoid (Hampshire, England)
Chloroform Roth (Karlsruhe)
Citronensäure-Monohydrat Merck (Darmstadt)
CTAB Sigma (Deisenhofen)
(Hexadexyltrimethylammoniumbromid, 99%) D
Digoxigenin-11-dUTP Roche (Mannheim) DNA-Marker 100 bp Roth (Karlsruhe) Dynabeads Invitrogen (Karlsruhe) E
EDTA Sigma (Deisenhofen)
Ethanol abs. Roth (Karlsruhe) Ethidiumbromid Sigma (Deisenhofen) F
Ficoll®400 Sigma (Deisenhofen) G
Glycerin Roth (Karlsruhe)
H
Hefeextrakt Oxoid (Hampshire, England) I
Isoamylalkohol Merck (Darmstadt) Isopropanol Roth (Karlsruhe)
K
Kaliumchlorid Roth (Karlsruhe) L
Lysozym Roth (Karlsruhe)
M
Magermilchpulver Sucofin (EDAKA, Hannover) N
Natriumchlorid Roth (Karlsruhe)
Natriumacetat Merck (Darmstadt)
Natriumhydroxid Plätzchen Merck (Darmstadt) Nucleotidtriphosphate (dNTPs) Roth (Karlsruhe) P
Phenol Roth (Karlsruhe)
Polyvinylpyrrolidon Roth (Karlsruhe) Proteinase K Merck (Darmstadt) R
RNase A Sigma (Deisenhofen)
S
Salzsäure Sigma (Deisenhofen)
SDS (Sodiumdodecylsulfat) Roth (Karlsruhe) T
TMB ready-to-use substrate Serva (Heidelberg) Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Merck (Darmstadt) Tris (hydroxylmethyl)-aminomethan Roth (Karlsruhe)
Tween®20 Roth (Karlsruhe)
3.1.3 Nährmedien
Columbia-Schafsblut-Agar Oxoid (Hampshire, England) Gassner-Selektivagar Oxoid (Hampshire, England) SMAC-Agar Oxoid (Hampshire, England) CT-SMAC-Agar Oxoid (Hampshire, England)
LB-Agar-Platten 1% (w/v) Bacto®-Trypton
0,5% (w/v) Hefeextrakt
1% (w/v) NaCl
1,5% Agar Agar
LB-Medium 1% (w/v) Bacto®-Trypton
0,5% (w/v) Hefeextrakt
1% (w/v) NaCl
GN-Bouillon Merck (Darmstadt)
3.1.4 Puffer und Lösungen
Blockpuffer 5% Magermilchpulver (w/v) 9,9 mM Tris
150 mM NaCl
0,005% Tween 20 (v/v)
pH 8,0
CTAB 4,1g NaCl
10g CTAB
A. dest ad 100ml
100x Denhardt’s Lösung 2% (w/v) Ficoll
2% (w/v) Polyvinylpyrrolidon
2% (w/v) BSA Fraktion V
Die Lösung wurde steril filtriert (Filter 0,45µm) und bei -20°C gelagert.
Denaturierungspuffer 0,5 N NaOH 1,5 M NaCl,
autoklaviert Hybridisierungspuffer SSC 6x
Denhardt’s Lösung 5 x
SDS 0,5% (w/v) EDTA pH 7,5 2mM
IMS-Waschpuffer 0,138 M NaCl 0,0027 M KCl 0,05% Tween 20 pH 7,4, autoklaviert
6 x Ladepuffer für DNA 0,25% (w/v) Bromphenolblau
0,25% (w/v) Xylencyanol
30% (v/v) Glyzerin Neutralisierungspuffer 1,5M NaCl
0,5 M Tris/HCl (pH 7,4)
autoklaviert
20x SSC 3 M NaCl
0,3 M Natriumcitrat autoklaviert
10 x TBE 0,9 M Tris-HCl (pH 7,5)
0,9 M Borsäure
20 mM Na-EDTA (pH 8,0)
pH 7,5, autoklaviert
10 x TBST 0,1 M Tris
1,5 M NaCl
0,05% (v/v) Tween 20
pH 8, autoklaviert
TEN-Puffer 100µl Lysozym (100mg/ml)
50 µl Tris 1 M (pH 8,0)
2 µl EDTA 0,5 M (pH 8,0)
25 µl NaCl 4M
823 µl A. dest.
TMB-Puffer 0,82% (w/v) Natriumacetat
0,315% (w/v) Citronensäure-
Monohydrat pH 5,0
Waschlösungen für Colony Blots
Waschlösung 1 SSC 2 x
SDS 0,1% (w/v) autoklaviert
Waschlösung 2 SSC 1 x
SDS 0,1% (w/v) autoklaviert
Waschlösung 3 SSC 0,2 x
SDS 0,1% (w/v) autoklaviert
3.1.5 Herkunft des Untersuchungsmaterials und Probennahme
Für die epidemiologische Studie wurden insgesamt 126 zoologische Gärten, Wildparks und Freizeitparks mit Tieranteil ausgewählt. Die Einrichtungen wurden mit Hilfe des Internets ausfindig gemacht und schriftlich um eine Teilnahme gebeten.
Eine besondere Hilfestellung gab die Internetseite www.zoo-infos.de der Zoodatenbank Bielefeld, erstellt von der Zoo-AG-Bielefeld der Universität Bielefeld.
Eine Zusage erteilten 56 Einrichtungen, 13 Einrichtungen erteilten eine Absage und 57 Einrichtungen gaben keine Rückmeldung. Die 56 teilnehmenden Betriebe wurden anhand ihrer Betriebsstruktur in zoologische Parks (Zoo), Wildtierparks und Freitzeiteinrichtungen mit Tieranteil geschichtet. Da rund 40% der angeschriebenen Parks ihre Teilnahme an der Studie zusagten, wurde die zweite Schichtung der Stichprobengröße „Parks“ so vorgenommen, dass Deutschland zunächst anhand der Parkdichte in drei geographische Teile (Region 1, Region 2 und Region 3) unterteilt wurde (Abbildung 1). Aufgrund der relativ hohen Parkdichte in Nordrhein-Westfalen und der gleichzeit relativ geringen Parkdichte in Baden-Württemberg wurden diese beiden in geographisch unterschiedlichen Bereichen Deutschlands liegende Regionen in dieser Studie zu einer Region zusammengefasst.
Abb. 1: Schichtung Deutschlands in drei Regionen
In jeder Region sollte von jeder Parkart ein Anteil von 40% beprobt werden. Jeder Park wurde im Abstand von 14 Tagen zweimal beprobt. Im Beprobungszeitraum von Mai bis Ende August 2008 wurden 24 Parks beprobt, von April bis Mitte Oktober 2009 wurden 32 Parks beprobt. Die Kotproben aus den Streichelgehegen selbst stammten von Tierarten, die von den Besuchern gefüttert und/oder angefasst werden konnten. Dies +waren zum größten Teil Ziegen und Schafe aber auch Schweine, Kaninchen, Meerschweinchen, Pferde und Ponies, Esel, Rinder, Lamas, Damwild, Geflügel und Kängurus. Des Weiteren wurde in jedem Park, soweit möglich, ein Fliegenfänger aufgehängt und davon jeweils zehn Fliegen zur mikrobiologischen Untersuchung herangezogen. Die Ermittlung des Stichprobenumfangs pro Streichelzoo erfolgte vor dem Hintergrund einer Auswahl ohne Zurücklegen bei endlichen Gesamtheiten mit Hilfe des Models der Hypergeometrischen Verteilung.
Bei vorgegebener Größe des Streichelzoos wurde dazu die Prävalenz von 20% mit einer relativen Genauigkeit von 10%, d.h. absolut zwei Prozentpunkte, vorgegeben und somit für jeden Streichelzoo individuell ein erforderlicher Stichprobenumfang bei einer Sicherheitswahrscheinlichkeit von mindestens 95% festgelegt. Die Realisierung erfolgte unter Verwendung des Statistikprogrammpakets R (www.r-project.org/).
Insgesamt wurden somit im Jahr 2008 566 Kotproben und 17 Fliegenproben
