Molekularbiologische Diagnostik

Nach Abschluss der biochemischen und mikroskopischen Diagnostik wurde die molekularbiologische Typisierung begonnen. Diese startete mit der Durchführung einer genetischen Bestätigung des Vorliegens von MRSA mittels PCR.

3.3.1 Genetische Bestätigung von MRSA

Die auf Blutagar subkultivierten Reinkulturen wurden erneut auf ihr phänotypisches Erscheinen untersucht. Bei passendem Erscheinungsbild wurde eine Ausstrichöse kulturellen Materials entnommen und in ein steriles Reaktionsgefäß mit 1,0 ml Tris-EDTA-Puffer überführt und bis zur Durchführung der PCR tiefgekühlt gelagert.

Die Durchführung der PCR nach POULSEN et al. 2003 erfolgte in der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in Bakum unter Einbeziehung der spezifischen Maßgaben des Bundesinstituts für Risikobewertung.

Die genutzte Positivkontrolle enthielt eine ausreichende Anzahl von Kopien der Zielsequenz oberhalb der Nachweisgrenze. Die Negativkontrolle enthielt die gleichen Anteile wie die kontrollierten Proben, jedoch wurde die Template-DNA durch die Zugabe einer gleichen Menge Wasser ersetzt, sodass das verarbeitete Volumen der Negativkontrolle gleich blieb.

Das Vorhandensein von MRSA wurde durch Untersuchung mehrerer Loci mittels Einsatzes von mehreren Primer-Paaren in einer Multiplex-PCR festgestellt. Die verwendeten PCR-Primer sind in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3 - Verwendete PCR-Primer

Target-Gen

Primer-Bezeichnung Primer-Sequenzen

Amplikon-Grösse (bp)

mecA

mec up1 5`-GGG ATC ATA GCG TCA TTA TTC-3`

527 mec up2 5`-AAC GAT TGT GAC ACG ATA

GCC-3`

nuc

nuc PCR1 5`-TCA GCA AAT GCA TCA CAA ACA G-3`

255 nuc PCR2 5`-CGT AAA TGC ACT TGC TTC

AGG-3`

3.3.2 Extraktion der Proben-DNA

Die in Tris-EDTA verbrachten Kulturen wurden unmittelbar vor der Weiterverarbeitung gevortext und dadurch die Ablagerungen neu aufgemischt. Im Anschluss wurden die Reaktionsgefäße bei 20.000 g zentrifugiert. Nach zehn Minuten zentrifugieren wurde der Überstand verworfen, die Festbestandteile mit 500 µl Tris-HCl-Puffer aufgefülllt und somit resuspendiert. Die resuspendierte Mischung wurde erneut gevortext und im Anschluss auf dem Thermomixer bei 60°C für 60 Minuten, danach bei 95°C für 15 Minuten inkubiert. Die fertige Template-DNA wurde sofort für die PCR-Untersuchung verwendet.

3.3.3 Vorbereitung der PCR

Zu Beginn der Arbeiten wurden die benötigten, tiefgefrorenen Materialien aufgetaut.

Lediglich die Polymerase verblieb bis zu ihrem Gebrauch auf Eis.

Die Programmierung des Cyclers und die Beschriftung der PCR-Reaktionsgefäße erfolgten im nächsten Arbeitsschritt.

3.3.4 Mastermix

Der Mastermix wurde dem Pipettierschema nach errechnet, wobei Negativ- und Positivkontrollen addiert wurden.

12,5 µl Ready-Mix und 7,5 µl Primer-Mix wurden zusammen mit 2,5 µl H2O bis auf 22,5 µl aufgefüllt. Die einzelnen Bestandteile wurden in diesem Arbeitsschritt pipettiert, behutsam vermengt, kurz zentrifugiert und bis zum Verbrauch kühl gelagert.

Die Template-DNA respektive das Material der Positiv- und Negativkontrolle wurde in die PCR-Reaktionsgefässe pipettiert, die kühl gestellt wurden. Je Reaktionsgefäß wurden 2,5 µl Template-DNA dem Mastermix, sodass 25 µl Reaktionsvolumen enstanden. Direkt im Anschluss wurde der PCR-Cycler gestartet.

3.3.5 Amplifikationsprotokoll

Die erste Denaturierung während der PCR dauerte fünf Minuten bei 94°C.

Die Schritte zwei bis vier wurden in 30 Zyklen wiederholt. Die herrschenden Temperaturen im PCR-Cycler waren mit 94°C für 30 Sekunden in Schritt zwei, 55°C für 30 Sekunden in Schritt drei und 72°C für 45 Sekunden in Schritt vier voreingestellt worden.

Nach fünf Minuten bei 72°C in Schritt fünf wurde die Lösung bis zur Geleletrophorese in Schritt 6 auf 4°C gekühlt.

3.3.6 Gelelektrophorese

3.3.6.1 Herstellung des 1,5 %-igen Agarosegels

Für die Auftrennung der entstandenen PCR-Produkte wurde in der Gelelektrophorese 1,5%iges Agarosegel verwendet.

Für die Gelherstellung wurden auf der Analysewaage 3 g Agarose NEEO ausgewogen und in einen 200 ml Erlenmeyerkolben gegeben. In einem Standzylinder wurden 20 ml TAE-Puffer und 180 ml Aqua dest. abgemessen und in den Erlenmeyerkolben mit der Agarose gegeben. Nach Zugabe eines Magnetrührers wurde die Agarose bei 100°C für eine Stunde gelöst.

Der entstandene, flüssige Agar wurde nun unter fließend kaltem Wasser unter kontinuierlicher Temperaturkontrolle bis auf 60°C abgekühlt. Nach Erreichen der Zieltemperatur wurde der Agar unter Vermeidung von Blasenbildung auf einen vorgekühlten Gelträger gegeben, welcher bereits mit einem 26iger Kamm besetzt worden war.

Der so fertiggestellte Gelträger wurde nun für 30 Minuten bei 6°C im Kühlschrank gefestigt.

3.3.6.2 Vorbereitung des Agarosegels

Vor Durchführung der Elektrophorese wurde der Gelträger aus dem Kühlschrank genommen und die Verschlussleisten respektive der Kamm vorsichtig entfernt. Die Elektrophoresekammer wurde dann mit 500 ml Laufpuffer gefüllt. Als Laufpuffer wurde 1:10 verdünnter TAE-Puffer genutzt. Es wurde auf eine ausreichende Bedeckung des Gels mit dem Laufpuffer geachtet. Der Träger wurde in korrekter

Richtung in die Gelkammer eingesetzt, sodass die Taschen in Richtung der Kathode gerichtet waren.

Die entsprechenden Cups mit Amplifikat wurden nun bei 5.000 g für 15 Sekunden zentrifugiert.

3.3.6.3 Vorbereitung des Amplifikats

In einer Mikrotiterplatte wurden 4 µl Gelladepuffer in jeden für Proben sowie Negativ- und Positivkontrolle vorgesehenen Wells gefüllt. Je 10 µl Amplifikat wurde nun dem Gelladepuffer hinzugefügt und entstehende Lösung vorsichtig durchmischt.

In die Wells M¹ und M² wurden nun 1,5 µl DNA-Ladder und 8,5 µl LiChrosolv pipettiert und ebenfalls vorsichtig durchmischt.

Aus jedem Well wurden dann 10 µl in eine der Geltaschen pipettiert.

Im Anschluss wurde die Elektrophoresekammer verschlossen und für 60 Minuten eine Spannung von 170 Volt angelegt.

3.3.7 Gelfärbung

Zur Färbung des genetischen Materials im Elektrophoresegel wurde Ethidiumbromid in 1%iger Konzentration genutzt. Hierfür wurde das Gel 30 Minuten in einer abgedeckten Aluminium-Färbeschale mit 50 ml TAE-Puffer, 450 ml Aqua. dest. und 100 µl Ethidiumbromid gefärbt. Anschließend wurde das Gel aus der Färbelösung entnommen und fünf Minuten in destilliertem Wasser gewaschen.

Nach dem Waschen wurde das gefärbte Gel in der Mitte der Fotokammer plaziert.

Durch Bestrahlung mit UV-Licht in einer Expositionsdauer von 8/30 Sekunden und 20/30 Sekunden wurde nun das gefärbte DNA-Material zur Photoaktivität angeregt und die entstandenen Leuchtbanden in der Fotokammer digitalisiert.

3.3.8 Auswertung

Auswertung und Beurteilung erfolgten digital über den Alpha-Imager.

Das Vorhandensein spezifischer Banden im Bereich von 255 bp wurde als Nachweis von S. aureus betrachtet, Banden bei 527 bp ergaben den Nachweis einer Methicillin-Resistenz.