Methoden

Aufgrund des weltweiten Vorkommens und der großen Zahl von MRSA-Isolaten fällt eine Homogenisierung der Untersuchungsmethoden schwer. Auch Studien zu laMRSA lassen sich aufgrund der zum Teil sehr unterschiedlichen methodischen oder bakteriologischen Untersuchungsweise nicht vollständig vergleichen.

Für die vorliegende Arbeit wurden Untersuchungsmethoden nach Absprache mit dem Bundesinstitut für Risikobewertung in Berlin verwendet.

3.2.1 Screeningmethoden

Der Nachweis von MRSA gelingt aus vielen Medien und Oberflächen. Bezüglich deren Sensitivität und Spezifität scheinen die Ergebnisse jedoch zu divergieren. Für die vorliegende Studie wurde nach Absprache mit dem Nationalen Referenzlabor für Staphylokokken drei verschiedene Nachweismethoden genutzt.

3.2.1.1 Staub

Staub wurde mittels autoklavierten Pinseln auf einer Fläche von 500 cm² an fünf verschiedenen Stellen des Stalls in Anlehnung an die VO 2008/55/EG entnommen und in ein steriles Kotröhrchen überführt.

Bei der Beprobung der Stallumgebung nach Reinigung und Desinfektion wurden so viele Stellen wie nötig untersucht, um ausreichend Untersuchungsmaterial zu erhalten.

Der Staub wurde nach der Entnahme bei 7°C gekühlt gelagert und innerhalb von 72 Stunden untersucht.

3.2.1.2 Tupfer

Als Tupfer wurden Amies-Agar-Gel-Tupfer der Fa. Oxoid verwendet.

Bei der Nutzung als Nasentupfer wurde der trockene Tupfer auf einer Seite einmalig im Nasenloch in einer Tiefe von 2 cm kreisen gelassen. Es wurde versucht den Kontakt mit der Rüsselscheibe oder der Haut der Tiere soweit wie möglich zu minimieren.

Für die Verwendung als Vaginaltupfer wurde der Tupfer vor der Entnahme mit dem Amies-Medium befeuchtet; die Labien der Sau wurden gespreizt und die Probe von der Vaginalschleimhaut in etwa 2 cm Tiefe entnommen.

Sowohl die Nasen- als auch Vaginaltupfer wurden direkt nach der Entnahme bei 7°C gekühlt und innerhalb von 72 Stunden untersucht.

3.2.1.3 Socken

Die sterilen Sockentupfer wurden bei der Verwendung über einen Einweg-Überschuh gezogen; hierbei wurde die entsprechende Sauberkeit soweit wie im Schweinestall möglich durch die Verwendung von Einweghandschuhen gewahrt.

Nach dem Überziehen des Sockentupfers wurde der gesamte Stallgang bis zurück zum Ausgangspunkt abgeschritten. Der Sockentupfer wurde über links ausgezogen und in einen sterilen Stomacherbeutel gegeben, bei 7°C gekühlt gelagert und innerhalb von 72 Stunden untersucht.

3.2.2 Bakteriologische Diagnostik

Der Nachweis von MRSA erfordert aufgrund der hohen Konkurrenzflora der untersuchten Strukturen eine hohe Spezifität. Diese ist nur bei einer mehrphasigen, selektiven Voranreicherung gegeben.

3.2.2.1 Herstellung der Anreicherungsmedien

Für die phosphatgepufferte Salzlösung wurden 1.000ml destilliertem Wasser mit 8 g NaCl und 1,56 g NaH2PO4 gemischt. Die Lösung wurde dann mit einmolarer Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,2 eingestellt. Der so behandelten Lösung wurde nun 0,5 ml Tween 20 zugegeben. Nach gründlicher Vermischung wurde die fertige Lösung mittels sterilen Filtern und einer 10 ml Spritze in sterile Röhrchen abgefüllt.

Die Müller-Hinton-Bouillon wurde aus 1l H2O als Grundsubstanz erstellt. Nach Abwiegen von 21 g MHB-Pulver und 65g NaCl wurden beide Stoffe mit der Flüssigkeit gründlich verrührt. Die entstandene Lösung wurde autoklaviert und in sterile Reagenzgläser abgefüllt.

Die Trypton-Soja-Bouillon zur Selektivanreicherung wurde aus 1 l H2O erstellt, welches mit 60 g Casein-Trypton-Soja verrührt und im Anschluss autoklaviert wurde.

Nach der Autoklavierung wurden der Bouillon 3,5 mg Cefoxitin und 75 mg Aztreonam zugegeben. Die Mischung wurde gut vermengt und im Anschluss in sterile Reagenzgläser abgefüllt.

3.2.2.2 Voranreicherungsverfahren

Als Voranreicherungsmedium wurde 6,5%-ige Müller-Hinton-Bouillon verwendet.

Die Nasen- und Vaginaltupfer wurden etwa 1 cm unterhalb des Griffstücks mit einer abgeflammten Schere abgeschnitten und in ein Reagenzröhrchen mit 1 0ml der Müller-Hinton-Bouillin überführt. Mit einem Vortexer wurde das Reagenzglas mehrmals vermischt.

Bei der Untersuchung des Staubes wurden 0,1 g Staub mittels Analysewaage ausgemessen und in einen sterilen 100 ml - Ehrlmeierkolben überführt. Der ausgemessenen Staub wurde dann mit 10 ml PBS-TWEEN 20®, 0,01% vermengt und 30 min im Wasserbad (25 °C) bei 120 rpm geschüttelt. Aus der vermengten Lösung wurde dann 1,0 ml mittels steriler Glaspipette in 9 ml Müller-Hinton-Bouillon überführt.

Für die Anreicherung der Sockentupfer wurden 25 ml der 6,5%-igen Müller-Hinton-Bouillon in den Stomacherbeutel gegeben. Die Mischung wurde dann bei hoher Geschwindigkeit für 120 Sekunden gestomachert.

Die Kultivierung erfolgte 24 Stunden lang bei 37°C unter aerogenen Bedingungen im Inkubator.

Vom Beginn der Voranreicherung an wurde das Nachweisverfahren durch eine Positiv- und Negativkontrolle ergänzt.

3.2.2.3 Selektivmedien

Als selektives Voranreicherungsmedium wurde Trypton-Soja-Bouillon mit Zusatz von 75 mg/l Aztreonam und 3,5 mg/l Cefoxitin genutzt.

Nach Ablauf der Inkubation der MH-Bouillon wurde bei den Tupferproben und den Staubproben 1 ml der Probenlösung in 9 ml der Trypton-Soja-Bouillon überführt, bei der Untersuchung der Sockentupfer wurden 2,5 ml der MH-Bouillin in 22,5 ml der Trypton-Soja-Bouillon gegeben.

Die Mischung wurde mittels Vortexer vermengt und für 17 Stunden bei 37°C unter aerogenen Bedingungen im Inkubator kultiviert.

Als festes Selektivmedium wurde CHROMagar™ MRSA der Fa. CHROMagar, Paris verwendet. Dieses Medium weist eine hohe Spezifität und Sensitivität auf (HEDIN u.

FANG 2005).

Es wurde mit einer abgeflammten Öse Material aus der Selektivanreicherung entnommen und auf der Selektivplatte ausgestrichen. Danach folgte eine Inkubation von 24 Stunden bei 37°C.

MRSA-Kolonien zeigen sich auf dieser Platte durch eine rosa bis malvenartige Färbung und sind leicht zu identifizieren.

3.2.2.4 Subkultivierung

Für die Subkultivierung wurden mindestens fünf verdächtige Kolonien von der positiven Selektivplatte markiert und auf Columbia-Schafblut-Agar subkultiviert. Die Subkultivierung erfolgte im Drei-Ösen-Ausstrich; danach wurde der beimpfte Blutagar bei 37°C für 24 Stunden inkubiert.

3.2.3 Biochemische und mikroskopische Diagnostik

Für die folgende Diagnostik wurden die subkultivierten Kulturen auf dem Blutagar auf die für MRSA typischen Kriterien untersucht: weiß-gelbliche, abgegrenzte, leicht gewölbte, undurchsichtige und glattrandige Kolonien mit deutlicher Hämolyse auf dem Blutagar.

3.2.3.1 Koagulase

Die Untersuchung der Koagulasefähigkeit dient der Abgrenzung zwischen den Koagulase-positiven Stämmen von S. aureus und den übrigen, Koagulase-negativen Staphylokokken.

Für den Nachweis der Koagulase wurde lyophilisiertes EDTA-Kaninchenplasma genutzt. Es wurden für jede Reaktion jeweils 300 µl des mit bidestilliertem Wasser aufgefüllten Kaninchenplasmas in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Mittels steriler Öse

wurde ein Ausstrich typischer Subkulturen entnommen und mit dem Plasma vermengt.

Das Reaktionsgefäß wurde mittels steriler Abdeckfolie verschlossen und mit Hilfe des Vortexer vermischt. Danach erfolgte die Inkubation für 4 Stunden bei 37°C im Wasserbad; bei negativem Ergebnis wurde die Inkubation 18 Stunden lang im Inkubator bei 37°C fortgesetzt. Positive Ergebnisse sind durch eine Koagulation des Kaninchenplasmas ersichtlich.

3.2.3.2 Katalase

Die Katalasereaktion dient der Abgrenzung zwischen den Katalase-positiven Staphylokokken und den Katalase-negativen Streptokokken. Der Katalase-Test zeigt die Anwesenheit des Enzyms Katalase, welches die Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff ermöglicht.

Auf einem Objektträger wird ein Tropfen 3%-iger Wasserstoffperoxid-Lösung mit einer Öse bakteriellen Materials der typischen Subkulturen vermengt. Kommt es zur Schaum- oder Blasenbildung wird die Reaktion als positiv bewertet. Bleibt die Reaktion aus oder zeigt sich eine verspätete Schaumbildung wird das Ergebnis als negativ eingestuft.

3.2.3.3 Oxidase

Der Oxidasetest basiert auf der Umwandlung molekularen Sauerstoffs durch bakterielle Cytochromoxidasen. Bei Vorhandensein dieser Cytochromoxidasen kommt es zur Oxidation des eingesetzten Farbstoffes, was sich in einem Farbumschlag zeigt.

Staphylococcus aureus sind Oxidase-negativ.

3.2.3.4 API-Staph

Das API-Staph-System der Fa. bioMérieux, Nürtingen, ist ein kommerzielles Testkit zur Identifikation von Staphylokokken. Das System basiert auf verschiedenen biochemischen Standardreaktionen und dem Nachweis spezieller Stoffwechselprodukte.

Nach Herstellung der Suspensionslösung und deren Trübungseinstellung auf 0,5 nach MacFarland wurde der Test nach Anleitung durchgeführt. Der API-Staph-Teststreifen wurde dann bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation erfolgte das vorgeschriebene Zugeben der Voges-Proskauer-Reagenzen 1 und 2, der Nitratreduktions-Reagenzen 1 und 2 sowie der Alkalische Phosphatase-Test mit den Enzymen A und B.

Im Anschluss daran wurde das Test-Kit visuell abgelesen und die Spezies mittels Profil-Index eingeteilt.

3.2.3.5 Gram-Färbung

Die Gram-Färbung wurde als Grundlegende mikroskopische Färbung genutzt. Sie dient der Differenzierung gram-positiver und gram-negativer Bakterienspezies.

Bei der Färbung wird von einer Subkultur entnommenes, bakterielles Material auf einem Objektträger hitzefixiert und mit Karbolgentianaviolett drei Minuten lang angefärbt. Anschließend wird das gefärbte Material mittels Lugol‟scher Lösung drei Minuten lang gebeizt. Durch diesen Schritt wird das in die Mureinschicht der gram-positiven Bakterien eingewanderte Karbolgentianaviolett in der Zellwand fixiert und kann im folgenden Arbeitsschritt, der Entfärbung mit 96%-igem Alkohol, nicht mehr gelöst werden. Gram-negative Bakterien verlieren jedoch die blaue Färbung und werden im letzten Arbeitsschritt, der Gegenfärbung mit Karbolfuchsin, rot angefärbt.

Das so vorbereitete Grampräparat wird mikroskopisch auf die Anwesenheit von gram-positiven Kokken beurteilt.