2. LITERATUR
3.1 Material
3.1.3 Chemikalien
Agarose Macro-Abgarose AG-0400/b, ABgene
Thermo Scientific, Hamburg
Aqua destilata Eigene Herstellung
Aztreonam Nr. A 6848, 50mg, Fa. Sigma, Taufkirchen
Bacillol AF Bode Chemie, Hamburg
Bromphenolblau-Natriumsalz Nr. 1.11746, Fa. Merck, Darmstadt
Cefoxitin C 4786, 250mg, Fa. Sigma, Taufkirchen
Cryobank Nr. 291703, 2ml, Mast Diagnostika
Laboratoriumspräparate GmbH, Reinfeld Desinfektionsmittel FL-des GA forte, Desintec/ AGRAVIS
Raiffeisen AG, Münster
DNA Ladder Nr. 11062590001, DNA-Molekular Weight
Marker VI, 0,15 – 2,1kbp, Fa. Roche Diagnostica, Mannheim
EDTA Titriplex III, Nr. 1.08418, Fa. Merck,
Darmstadt
Ethidiumbromid Nr. 1.11608.0030, 1%-ige Lösung, Fa.
Merck, Darmstadt
Gelladepuffer Eigene Herstellung
Gycerin Nr. 1.04094, Fa. Merck, Darmstadt
LiChrosolv-Wasser Nr. 1.15333, Fa. Merck, Darmstadt
Lysispuffer Eigene Herstellung
Proteinase K P 2308, Fa. Sigma, Taufkirchen
N Acetyl-L-Cystin A 7250, Fa. Sigma, Taufkirchen
NaCl Nr. 1.06404, Fa. Merck, Darmstadt
TAE Puffer Nr. 1.06023, 10-fach pH 8,3, Fa. Merck, Darmstadt
TE-Puffer Eigene Herstellung
Tween 20 P 1379, Fa. Sigma, Taufkirchen 3.1.4 Nährmedien
Columbia Blutagar Fa. Heipha, Eppelheim Fa. Oxoid, Wesel
CHROMagar MRSA Fertigplatte Nr. 201402, Fa. Mast Diagnostiva Laboratoriumspräparate GmbH, Reinfeld Müller-Hinton-Bouillon-Pulver Nr. CM0405 B, Fa. Oxoid, Wesel
Trypton-Soja-Bouillon (CASO) Nr. 1.05459, Fa. Merck, Darmstadt Transporttupfer in Amies Agar Gel Nr. TS 0001 A, steril, Fa. Oxoid, Wesel 3.1.5 Reagenzien und Materialien zur Identifikation von MRSA
API ID 32 Staph Nr. 32500, Fa. bioMérieux, Nürtingen
Koagulase Microbiology Bactident Coagulase, Fa.
Merck, Darmstadt
Nr. 240661, COAG.PLASMA RABBIT, Fa.
Becton Dickinson GmbH, Heidelberg
Oxidase Oxidase Reagent REF 55635, Fa.
bioMérieux, Nürtingen
Katalase H202 aus eigener Herstellung
Sterile Abdeckfolie Parafilm M IS (PM-996), Pechiney Plastic Packaging, Menasha, Wisconsin
Karbol-Gentianaviolett BD Gram Crystal Violet, Fa. Becton, Dickonson and Company, Sparks, Maryland
Lugolsche Lösung BD Stabilized Gram Iodine, Fa. Becton, Dickonson and Company, Sparks, Maryland
Fuchsin BD Gram Basic Fuchsin, Fa. Becton, Dickonson and Company, Sparks, Maryland
3.1.6 PCR-Primer
mecA up 1 und mecA up 2 Mebabion International AG, Planneg-Martinsried
Primer-Sequenzen: 5‟-GGG ATC ATA GCG TCA TTA TTC-3‟
5‟-AAC GAT TGT GAC ACG ATA GCC-3‟
Amplikongröße: 527 bp
nuc PCR 1 und nuc PCR 2 Mebabion International AG, Planneg-Martinsried
Primer-Sequenzen: 5‟TCA GCA AAT GCA TCA CAA ACA G-3„
5‟CGT AAA TGC ACT TGC TTC AGG-3‟
Amplikongröße: 255 bp
3.1.7 Verwendete Software
Alpha-Imager Biotec-Fischer GmbH, Reiskirchen
3.2 Methoden
Aufgrund des weltweiten Vorkommens und der großen Zahl von MRSA-Isolaten fällt eine Homogenisierung der Untersuchungsmethoden schwer. Auch Studien zu laMRSA lassen sich aufgrund der zum Teil sehr unterschiedlichen methodischen oder bakteriologischen Untersuchungsweise nicht vollständig vergleichen.
Für die vorliegende Arbeit wurden Untersuchungsmethoden nach Absprache mit dem Bundesinstitut für Risikobewertung in Berlin verwendet.
3.2.1 Screeningmethoden
Der Nachweis von MRSA gelingt aus vielen Medien und Oberflächen. Bezüglich deren Sensitivität und Spezifität scheinen die Ergebnisse jedoch zu divergieren. Für die vorliegende Studie wurde nach Absprache mit dem Nationalen Referenzlabor für Staphylokokken drei verschiedene Nachweismethoden genutzt.
3.2.1.1 Staub
Staub wurde mittels autoklavierten Pinseln auf einer Fläche von 500 cm² an fünf verschiedenen Stellen des Stalls in Anlehnung an die VO 2008/55/EG entnommen und in ein steriles Kotröhrchen überführt.
Bei der Beprobung der Stallumgebung nach Reinigung und Desinfektion wurden so viele Stellen wie nötig untersucht, um ausreichend Untersuchungsmaterial zu erhalten.
Der Staub wurde nach der Entnahme bei 7°C gekühlt gelagert und innerhalb von 72 Stunden untersucht.
3.2.1.2 Tupfer
Als Tupfer wurden Amies-Agar-Gel-Tupfer der Fa. Oxoid verwendet.
Bei der Nutzung als Nasentupfer wurde der trockene Tupfer auf einer Seite einmalig im Nasenloch in einer Tiefe von 2 cm kreisen gelassen. Es wurde versucht den Kontakt mit der Rüsselscheibe oder der Haut der Tiere soweit wie möglich zu minimieren.
Für die Verwendung als Vaginaltupfer wurde der Tupfer vor der Entnahme mit dem Amies-Medium befeuchtet; die Labien der Sau wurden gespreizt und die Probe von der Vaginalschleimhaut in etwa 2 cm Tiefe entnommen.
Sowohl die Nasen- als auch Vaginaltupfer wurden direkt nach der Entnahme bei 7°C gekühlt und innerhalb von 72 Stunden untersucht.
3.2.1.3 Socken
Die sterilen Sockentupfer wurden bei der Verwendung über einen Einweg-Überschuh gezogen; hierbei wurde die entsprechende Sauberkeit soweit wie im Schweinestall möglich durch die Verwendung von Einweghandschuhen gewahrt.
Nach dem Überziehen des Sockentupfers wurde der gesamte Stallgang bis zurück zum Ausgangspunkt abgeschritten. Der Sockentupfer wurde über links ausgezogen und in einen sterilen Stomacherbeutel gegeben, bei 7°C gekühlt gelagert und innerhalb von 72 Stunden untersucht.
3.2.2 Bakteriologische Diagnostik
Der Nachweis von MRSA erfordert aufgrund der hohen Konkurrenzflora der untersuchten Strukturen eine hohe Spezifität. Diese ist nur bei einer mehrphasigen, selektiven Voranreicherung gegeben.
3.2.2.1 Herstellung der Anreicherungsmedien
Für die phosphatgepufferte Salzlösung wurden 1.000ml destilliertem Wasser mit 8 g NaCl und 1,56 g NaH2PO4 gemischt. Die Lösung wurde dann mit einmolarer Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,2 eingestellt. Der so behandelten Lösung wurde nun 0,5 ml Tween 20 zugegeben. Nach gründlicher Vermischung wurde die fertige Lösung mittels sterilen Filtern und einer 10 ml Spritze in sterile Röhrchen abgefüllt.
Die Müller-Hinton-Bouillon wurde aus 1l H2O als Grundsubstanz erstellt. Nach Abwiegen von 21 g MHB-Pulver und 65g NaCl wurden beide Stoffe mit der Flüssigkeit gründlich verrührt. Die entstandene Lösung wurde autoklaviert und in sterile Reagenzgläser abgefüllt.
Die Trypton-Soja-Bouillon zur Selektivanreicherung wurde aus 1 l H2O erstellt, welches mit 60 g Casein-Trypton-Soja verrührt und im Anschluss autoklaviert wurde.
Nach der Autoklavierung wurden der Bouillon 3,5 mg Cefoxitin und 75 mg Aztreonam zugegeben. Die Mischung wurde gut vermengt und im Anschluss in sterile Reagenzgläser abgefüllt.
3.2.2.2 Voranreicherungsverfahren
Als Voranreicherungsmedium wurde 6,5%-ige Müller-Hinton-Bouillon verwendet.
Die Nasen- und Vaginaltupfer wurden etwa 1 cm unterhalb des Griffstücks mit einer abgeflammten Schere abgeschnitten und in ein Reagenzröhrchen mit 1 0ml der Müller-Hinton-Bouillin überführt. Mit einem Vortexer wurde das Reagenzglas mehrmals vermischt.
Bei der Untersuchung des Staubes wurden 0,1 g Staub mittels Analysewaage ausgemessen und in einen sterilen 100 ml - Ehrlmeierkolben überführt. Der ausgemessenen Staub wurde dann mit 10 ml PBS-TWEEN 20®, 0,01% vermengt und 30 min im Wasserbad (25 °C) bei 120 rpm geschüttelt. Aus der vermengten Lösung wurde dann 1,0 ml mittels steriler Glaspipette in 9 ml Müller-Hinton-Bouillon überführt.
Für die Anreicherung der Sockentupfer wurden 25 ml der 6,5%-igen Müller-Hinton-Bouillon in den Stomacherbeutel gegeben. Die Mischung wurde dann bei hoher Geschwindigkeit für 120 Sekunden gestomachert.
Die Kultivierung erfolgte 24 Stunden lang bei 37°C unter aerogenen Bedingungen im Inkubator.
Vom Beginn der Voranreicherung an wurde das Nachweisverfahren durch eine Positiv- und Negativkontrolle ergänzt.
3.2.2.3 Selektivmedien
Als selektives Voranreicherungsmedium wurde Trypton-Soja-Bouillon mit Zusatz von 75 mg/l Aztreonam und 3,5 mg/l Cefoxitin genutzt.
Nach Ablauf der Inkubation der MH-Bouillon wurde bei den Tupferproben und den Staubproben 1 ml der Probenlösung in 9 ml der Trypton-Soja-Bouillon überführt, bei der Untersuchung der Sockentupfer wurden 2,5 ml der MH-Bouillin in 22,5 ml der Trypton-Soja-Bouillon gegeben.
Die Mischung wurde mittels Vortexer vermengt und für 17 Stunden bei 37°C unter aerogenen Bedingungen im Inkubator kultiviert.
Als festes Selektivmedium wurde CHROMagar™ MRSA der Fa. CHROMagar, Paris verwendet. Dieses Medium weist eine hohe Spezifität und Sensitivität auf (HEDIN u.
FANG 2005).
Es wurde mit einer abgeflammten Öse Material aus der Selektivanreicherung entnommen und auf der Selektivplatte ausgestrichen. Danach folgte eine Inkubation von 24 Stunden bei 37°C.
MRSA-Kolonien zeigen sich auf dieser Platte durch eine rosa bis malvenartige Färbung und sind leicht zu identifizieren.
3.2.2.4 Subkultivierung
Für die Subkultivierung wurden mindestens fünf verdächtige Kolonien von der positiven Selektivplatte markiert und auf Columbia-Schafblut-Agar subkultiviert. Die Subkultivierung erfolgte im Drei-Ösen-Ausstrich; danach wurde der beimpfte Blutagar bei 37°C für 24 Stunden inkubiert.
3.2.3 Biochemische und mikroskopische Diagnostik
Für die folgende Diagnostik wurden die subkultivierten Kulturen auf dem Blutagar auf die für MRSA typischen Kriterien untersucht: weiß-gelbliche, abgegrenzte, leicht gewölbte, undurchsichtige und glattrandige Kolonien mit deutlicher Hämolyse auf dem Blutagar.
3.2.3.1 Koagulase
Die Untersuchung der Koagulasefähigkeit dient der Abgrenzung zwischen den Koagulase-positiven Stämmen von S. aureus und den übrigen, Koagulase-negativen Staphylokokken.
Für den Nachweis der Koagulase wurde lyophilisiertes EDTA-Kaninchenplasma genutzt. Es wurden für jede Reaktion jeweils 300 µl des mit bidestilliertem Wasser aufgefüllten Kaninchenplasmas in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Mittels steriler Öse
wurde ein Ausstrich typischer Subkulturen entnommen und mit dem Plasma vermengt.
Das Reaktionsgefäß wurde mittels steriler Abdeckfolie verschlossen und mit Hilfe des Vortexer vermischt. Danach erfolgte die Inkubation für 4 Stunden bei 37°C im Wasserbad; bei negativem Ergebnis wurde die Inkubation 18 Stunden lang im Inkubator bei 37°C fortgesetzt. Positive Ergebnisse sind durch eine Koagulation des Kaninchenplasmas ersichtlich.
3.2.3.2 Katalase
Die Katalasereaktion dient der Abgrenzung zwischen den Katalase-positiven Staphylokokken und den Katalase-negativen Streptokokken. Der Katalase-Test zeigt die Anwesenheit des Enzyms Katalase, welches die Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff ermöglicht.
Auf einem Objektträger wird ein Tropfen 3%-iger Wasserstoffperoxid-Lösung mit einer Öse bakteriellen Materials der typischen Subkulturen vermengt. Kommt es zur Schaum- oder Blasenbildung wird die Reaktion als positiv bewertet. Bleibt die Reaktion aus oder zeigt sich eine verspätete Schaumbildung wird das Ergebnis als negativ eingestuft.
3.2.3.3 Oxidase
Der Oxidasetest basiert auf der Umwandlung molekularen Sauerstoffs durch bakterielle Cytochromoxidasen. Bei Vorhandensein dieser Cytochromoxidasen kommt es zur Oxidation des eingesetzten Farbstoffes, was sich in einem Farbumschlag zeigt.
Staphylococcus aureus sind Oxidase-negativ.
3.2.3.4 API-Staph
Das API-Staph-System der Fa. bioMérieux, Nürtingen, ist ein kommerzielles Testkit zur Identifikation von Staphylokokken. Das System basiert auf verschiedenen biochemischen Standardreaktionen und dem Nachweis spezieller Stoffwechselprodukte.
Nach Herstellung der Suspensionslösung und deren Trübungseinstellung auf 0,5 nach MacFarland wurde der Test nach Anleitung durchgeführt. Der API-Staph-Teststreifen wurde dann bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation erfolgte das vorgeschriebene Zugeben der Voges-Proskauer-Reagenzen 1 und 2, der Nitratreduktions-Reagenzen 1 und 2 sowie der Alkalische Phosphatase-Test mit den Enzymen A und B.
Im Anschluss daran wurde das Test-Kit visuell abgelesen und die Spezies mittels Profil-Index eingeteilt.
3.2.3.5 Gram-Färbung
Die Gram-Färbung wurde als Grundlegende mikroskopische Färbung genutzt. Sie dient der Differenzierung gram-positiver und gram-negativer Bakterienspezies.
Bei der Färbung wird von einer Subkultur entnommenes, bakterielles Material auf einem Objektträger hitzefixiert und mit Karbolgentianaviolett drei Minuten lang angefärbt. Anschließend wird das gefärbte Material mittels Lugol‟scher Lösung drei Minuten lang gebeizt. Durch diesen Schritt wird das in die Mureinschicht der gram-positiven Bakterien eingewanderte Karbolgentianaviolett in der Zellwand fixiert und kann im folgenden Arbeitsschritt, der Entfärbung mit 96%-igem Alkohol, nicht mehr gelöst werden. Gram-negative Bakterien verlieren jedoch die blaue Färbung und werden im letzten Arbeitsschritt, der Gegenfärbung mit Karbolfuchsin, rot angefärbt.
Das so vorbereitete Grampräparat wird mikroskopisch auf die Anwesenheit von gram-positiven Kokken beurteilt.
3.3 Molekularbiologische Diagnostik
Nach Abschluss der biochemischen und mikroskopischen Diagnostik wurde die molekularbiologische Typisierung begonnen. Diese startete mit der Durchführung einer genetischen Bestätigung des Vorliegens von MRSA mittels PCR.
3.3.1 Genetische Bestätigung von MRSA
Die auf Blutagar subkultivierten Reinkulturen wurden erneut auf ihr phänotypisches Erscheinen untersucht. Bei passendem Erscheinungsbild wurde eine Ausstrichöse kulturellen Materials entnommen und in ein steriles Reaktionsgefäß mit 1,0 ml Tris-EDTA-Puffer überführt und bis zur Durchführung der PCR tiefgekühlt gelagert.
Die Durchführung der PCR nach POULSEN et al. 2003 erfolgte in der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in Bakum unter Einbeziehung der spezifischen Maßgaben des Bundesinstituts für Risikobewertung.
Die genutzte Positivkontrolle enthielt eine ausreichende Anzahl von Kopien der Zielsequenz oberhalb der Nachweisgrenze. Die Negativkontrolle enthielt die gleichen Anteile wie die kontrollierten Proben, jedoch wurde die Template-DNA durch die Zugabe einer gleichen Menge Wasser ersetzt, sodass das verarbeitete Volumen der Negativkontrolle gleich blieb.
Das Vorhandensein von MRSA wurde durch Untersuchung mehrerer Loci mittels Einsatzes von mehreren Primer-Paaren in einer Multiplex-PCR festgestellt. Die verwendeten PCR-Primer sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3 - Verwendete PCR-Primer
Target-Gen
Primer-Bezeichnung Primer-Sequenzen
Amplikon-Grösse (bp)
mecA
mec up1 5`-GGG ATC ATA GCG TCA TTA TTC-3`
527 mec up2 5`-AAC GAT TGT GAC ACG ATA
GCC-3`
nuc
nuc PCR1 5`-TCA GCA AAT GCA TCA CAA ACA G-3`
255 nuc PCR2 5`-CGT AAA TGC ACT TGC TTC
AGG-3`
3.3.2 Extraktion der Proben-DNA
Die in Tris-EDTA verbrachten Kulturen wurden unmittelbar vor der Weiterverarbeitung gevortext und dadurch die Ablagerungen neu aufgemischt. Im Anschluss wurden die Reaktionsgefäße bei 20.000 g zentrifugiert. Nach zehn Minuten zentrifugieren wurde der Überstand verworfen, die Festbestandteile mit 500 µl Tris-HCl-Puffer aufgefülllt und somit resuspendiert. Die resuspendierte Mischung wurde erneut gevortext und im Anschluss auf dem Thermomixer bei 60°C für 60 Minuten, danach bei 95°C für 15 Minuten inkubiert. Die fertige Template-DNA wurde sofort für die PCR-Untersuchung verwendet.
3.3.3 Vorbereitung der PCR
Zu Beginn der Arbeiten wurden die benötigten, tiefgefrorenen Materialien aufgetaut.
Lediglich die Polymerase verblieb bis zu ihrem Gebrauch auf Eis.
Die Programmierung des Cyclers und die Beschriftung der PCR-Reaktionsgefäße erfolgten im nächsten Arbeitsschritt.
3.3.4 Mastermix
Der Mastermix wurde dem Pipettierschema nach errechnet, wobei Negativ- und Positivkontrollen addiert wurden.
12,5 µl Ready-Mix und 7,5 µl Primer-Mix wurden zusammen mit 2,5 µl H2O bis auf 22,5 µl aufgefüllt. Die einzelnen Bestandteile wurden in diesem Arbeitsschritt pipettiert, behutsam vermengt, kurz zentrifugiert und bis zum Verbrauch kühl gelagert.
Die Template-DNA respektive das Material der Positiv- und Negativkontrolle wurde in die PCR-Reaktionsgefässe pipettiert, die kühl gestellt wurden. Je Reaktionsgefäß wurden 2,5 µl Template-DNA dem Mastermix, sodass 25 µl Reaktionsvolumen enstanden. Direkt im Anschluss wurde der PCR-Cycler gestartet.
3.3.5 Amplifikationsprotokoll
Die erste Denaturierung während der PCR dauerte fünf Minuten bei 94°C.
Die Schritte zwei bis vier wurden in 30 Zyklen wiederholt. Die herrschenden Temperaturen im PCR-Cycler waren mit 94°C für 30 Sekunden in Schritt zwei, 55°C für 30 Sekunden in Schritt drei und 72°C für 45 Sekunden in Schritt vier voreingestellt worden.
Nach fünf Minuten bei 72°C in Schritt fünf wurde die Lösung bis zur Geleletrophorese in Schritt 6 auf 4°C gekühlt.
3.3.6 Gelelektrophorese
3.3.6.1 Herstellung des 1,5 %-igen Agarosegels
Für die Auftrennung der entstandenen PCR-Produkte wurde in der Gelelektrophorese 1,5%iges Agarosegel verwendet.
Für die Gelherstellung wurden auf der Analysewaage 3 g Agarose NEEO ausgewogen und in einen 200 ml Erlenmeyerkolben gegeben. In einem Standzylinder wurden 20 ml TAE-Puffer und 180 ml Aqua dest. abgemessen und in den Erlenmeyerkolben mit der Agarose gegeben. Nach Zugabe eines Magnetrührers wurde die Agarose bei 100°C für eine Stunde gelöst.
Der entstandene, flüssige Agar wurde nun unter fließend kaltem Wasser unter kontinuierlicher Temperaturkontrolle bis auf 60°C abgekühlt. Nach Erreichen der Zieltemperatur wurde der Agar unter Vermeidung von Blasenbildung auf einen vorgekühlten Gelträger gegeben, welcher bereits mit einem 26iger Kamm besetzt worden war.
Der so fertiggestellte Gelträger wurde nun für 30 Minuten bei 6°C im Kühlschrank gefestigt.
3.3.6.2 Vorbereitung des Agarosegels
Vor Durchführung der Elektrophorese wurde der Gelträger aus dem Kühlschrank genommen und die Verschlussleisten respektive der Kamm vorsichtig entfernt. Die Elektrophoresekammer wurde dann mit 500 ml Laufpuffer gefüllt. Als Laufpuffer wurde 1:10 verdünnter TAE-Puffer genutzt. Es wurde auf eine ausreichende Bedeckung des Gels mit dem Laufpuffer geachtet. Der Träger wurde in korrekter
Richtung in die Gelkammer eingesetzt, sodass die Taschen in Richtung der Kathode gerichtet waren.
Die entsprechenden Cups mit Amplifikat wurden nun bei 5.000 g für 15 Sekunden zentrifugiert.
3.3.6.3 Vorbereitung des Amplifikats
In einer Mikrotiterplatte wurden 4 µl Gelladepuffer in jeden für Proben sowie Negativ- und Positivkontrolle vorgesehenen Wells gefüllt. Je 10 µl Amplifikat wurde nun dem Gelladepuffer hinzugefügt und entstehende Lösung vorsichtig durchmischt.
In die Wells M1 und M2 wurden nun 1,5 µl DNA-Ladder und 8,5 µl LiChrosolv pipettiert und ebenfalls vorsichtig durchmischt.
Aus jedem Well wurden dann 10 µl in eine der Geltaschen pipettiert.
Im Anschluss wurde die Elektrophoresekammer verschlossen und für 60 Minuten eine Spannung von 170 Volt angelegt.
3.3.7 Gelfärbung
Zur Färbung des genetischen Materials im Elektrophoresegel wurde Ethidiumbromid in 1%iger Konzentration genutzt. Hierfür wurde das Gel 30 Minuten in einer abgedeckten Aluminium-Färbeschale mit 50 ml TAE-Puffer, 450 ml Aqua. dest. und 100 µl Ethidiumbromid gefärbt. Anschließend wurde das Gel aus der Färbelösung entnommen und fünf Minuten in destilliertem Wasser gewaschen.
Nach dem Waschen wurde das gefärbte Gel in der Mitte der Fotokammer plaziert.
Durch Bestrahlung mit UV-Licht in einer Expositionsdauer von 8/30 Sekunden und 20/30 Sekunden wurde nun das gefärbte DNA-Material zur Photoaktivität angeregt und die entstandenen Leuchtbanden in der Fotokammer digitalisiert.
3.3.8 Auswertung
Auswertung und Beurteilung erfolgten digital über den Alpha-Imager.
Das Vorhandensein spezifischer Banden im Bereich von 255 bp wurde als Nachweis von S. aureus betrachtet, Banden bei 527 bp ergaben den Nachweis einer Methicillin-Resistenz.
3.4 Studiendesign
Im Folgenden sollen die vorab definierten Ziele der Studie sowie der Studienaufbau zu deren Erreichen kurz definiert werden.
3.4.1 Aufbau
Die Studie gliedert sich in drei Teile.
a. Nach Ermittlung geeigneter Bestände und Feststellung des MRSA-Status wird die Intraherdenprävalenz in den untersuchten Beständen ermittelt.
b. Im Anschluss starten die Untersuchungen während des ersten Reproduktionszyklus. Gleichzeitig werden Faktoren ermittelt, welche zu einem erhöhten Risiko einer MRSA-Besiedlung führen könnten. Nach Abschluss der Untersuchungsreihe erfolgt eine erste Auswertung der Ergebnisse.
c. Vor Beginn der Untersuchungen des zweiten Reproduktionszyklus werden mit den Landwirten die ermittelten, potentiellen Risikofaktoren besprochen und soweit wie möglich reduziert. Nach Durchführung dieser Optimierung beginnt die zweite Untersuchungsreihe. Wurden diese Probenentnahmen abgeschlossen, erfolgt eine ausführliche Auswertung sowie ein Vergleich beider Untersuchungsreihen.
3.4.2 Ziele
In der vorliegenden Studie wird zunächst die Intraherdenprävalenz in sechs repräsentativen Zuchtbeständen innerhalb Niedersachsens und Nordrhein-Westfalens ermittelt. Durch mehrfache Untersuchungen während eines Reproduktionszeitraumes wird versucht, Übertragungswege zwischen den Tieren zu ermitteln, um auf diese Weise die Kolonisationsdynamik von MRSA zu beschreiben.
Hierbei werden auch eventuelle Risikofaktoren in den Beständen ermittelt oder abgeschätzt. Zuletzt soll der Eintrag von MRSA in die Mastphase durch Änderungen und Optimierung individueller Faktoren in den Beständen reduziert werden. Die Wirksamkeit dieser Maßnahmen wird durch eine Wiederholung der Untersuchungen überprüft. Im Anschluss an die Untersuchungen sollen die Ergebnisse in den Rahmen bereits bekannter Publikationen eingeordnet werden.
Mit diesem Studiendesign orientieren sich die Untersuchungen an den Anforderungen des derzeitigen Wissensstandes bezüglich der laMRSA. Bislang wurden weder Kolonisationsdynamik noch gezielt zu beeinflussende Faktoren mit Wirkung auf die MRSA-Prävalenz in ausreichendem Maße untersucht. Zudem wird verstärkt Wert auf die Möglichkeit einer ubiquitären Durchführung der Maßnahmen gelegt, um so sowohl eine Reliabilitätsprüfung zuzulassen als auch der Praktikabilität zu genügen.
4 Ergebnisse
4.1 Ermittlung geeigneter Beständen
Eine Vorauswahl möglicher Bestände wurde in Niedersachsen dem Bestandpool der Außenstelle für Epidemiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover entnommen. In Nordrhein-Westfalen erfolgte die Vorauswahl durch eine Kooperation mit dem Schweinegesundheitsdienst der Landwirtschaftkammer Nordrhein-Westfalen.
Zur Ermittlung von Beständen, die für das Studienkonzept in Frage kommen, wurden in jedem besuchten Bestand Staubproben entnommen. In jedem Stall wurde dazu an fünf verschiedenen Stellen Staub von einer Fläche von etwa 100 cm² entnommen und in sterile Kotröhrchen gefüllt.
Lagen auf einem Bestand mehrere Ställe räumlich getrennt, wurden diese Ställe separat untersucht.
In Niedersachsen wurden im Rahmen der Vorauswahl fünf Bestände untersucht;
davon zeigten sich vier als MRSA-positiv. Lediglich eine Staubprobe wurde als MRSA-negativ klassifiziert.
In Nordrhein-Westfalen wurden elf Bestände untersucht; von diesen elf Beständen konnte bei neun Beständen MRSA nachgewiesen werden.
Aus diesem Bestands-Pool wurden nun in jedem Bundesland nach vorheriger Absprache mit den Landwirten drei Bestände in die Studie aufgenommen. Hierbei sind neben der Zuverlässigkeit und dem Interesse der Landwirte auch eine
Aus diesem Bestands-Pool wurden nun in jedem Bundesland nach vorheriger Absprache mit den Landwirten drei Bestände in die Studie aufgenommen. Hierbei sind neben der Zuverlässigkeit und dem Interesse der Landwirte auch eine