Mitochondriale Analysen in Abhängigkeit der Zellzyklusphasen

Analog zur Untersuchung der Struktur und Verteilung der Mitochondrien und der mitochondrialen Proteine über den Verlauf von Batch- und kontinuierlichen Kultivierungen (siehe Kapitel 4.3.1.5 und 4.3.2.6) wurden ebenfalls Proben von CHO-K1 Zellen analysiert, die mittels Elutriation in den unterschiedlichen Zellzyklusphasen angereichert wurden. Hierbei wurden drei Fraktionen gewählt, in denen die Zellen in der G1-Phase (92,4 %), in der S-Phase (57,6 %) bzw. in der G2/M-Phase (80,2 %) angereichert wurden (vergleiche Tab. 2). Durch diese Analysen sollten Kenntnisse über den Einfluss der Zellzyklusphasen auf die Dynamik der Mitochondrienmorphologie und mitochondrialer Proteine gewonnen werden.

4.3.4.1 Struktur und Verteilung der Mitochondrien

Die während der G1-, S- und G2/M-Phase auftretenden Strukturen und Verteilungsmuster der Mitochondrien sind in Abbildung 64 veranschaulicht. Hierbei ist für jede Zellzyklusphase jeweils eine repräsentative Bildaufnahme gezeigt. Dabei wird davon ausgegangen, dass sich die Mitochondrien an den Mikrotubuli ausrichten und über diese Ausrichtung Rückschlüsse auf den Zustand der Zelle beziehungsweise ihre Zellzyklusphase gezogen werden können. Die Mitochondrien in den CHO-K1 Zellen, die während der G1-Phase fixiert wurden, zeigen ein sehr ungleichmäßiges Verteilungsmuster (Abb. 64A). Hier liegen die Mitochondrien vorwiegend lokalisiert in einer Hälfte der Zelle vor. Teilweise können Mitochondriencluster beobachtet werden, die aufgrund der starken Fluoreszenzintensität auf eine hohe Mitochondriendichte in diesen Bereichen hindeuten.

Diese ungleichmäßige Verteilung der Mitochondrien könnte aus der vorangegangenen Zellteilung resultieren, die bewirkt, dass sich die Zellstrukturen neu orientieren müssen.

Grund hierfür könnte sein, dass die Zellen zu Beginn der G1-Phase eine stärkere Vernetzung der Mikrotubuli um das einzelne an einem Pol befindliche Zentrosom aufweisen. Dadurch ließe sich eine dortige Ansammlung der Mitochondrien in der frühen G1-Phase erklären.

Abb. 64: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Struktur und Verteilung von Mitochondrien in CHO-K1 Zellen abhängig von den Zellzyklusphase.

Anti-Tom20 markiert, 100-fache Vergrößerung; (A) G1-Phase (92,4 %), 97 % Viabilität, (B) S-Phase (57,6 %), 98 % Viabilität, (C) G2/M-Phase (80,2 %), 98 % Viabilität.

Vereinzelt liegen jedoch auch Zellen vor, die eine gleichmäßige Mitochondrienverteilung aufzeigen. Diese gleichmäßige Verteilung kann für die Zellen, die in der S-Phase fixiert wurden, zunehmend beobachtet werden (Abb. 64B). Hier könnte ein Fortschreiten des Zellzyklus und damit eine verstärkte Ausweitung des Mikrotubuli-Netzwerkes die Ursache für die Verteilung der Mitochondrien sein. Sowohl während der G1- als auch während der S-Phase können vorwiegend kreisförmig bis sphärische Formen der Mitochondrien detektiert werden, ohne dass starke Vernetzungen ersichtlich sind. Diese Beobachtungen wurden auch für die Zellen gemacht, die während des exponentiellen Wachstums im Batch- und im kontinuierlichen Betrieb analysiert wurden (vergleiche Abb. 39 und 52). Im Gegensatz dazu zeigen sich für die Zellen, die in der G2/M-Phase fixiert wurden, deutliche Unterschiede (Abb. 64C). Da sich die Zellen in der G2/M-Phase kurz vor der Zellteilung

A B

C

befinden, können durch die Verteilung der Mitochondrien bereits zwei Zellkerne beobachtet werden, die als runde, nicht fluoreszierende Bereiche innerhalb der Zellen erscheinen. Hier nehmen die Mitochondrien zunehmend langgesteckte, ovale Formen ein, die teilweise miteinander vernetzt zu sein scheinen. Da die Replikation der Mitochondrien vor der Zellteilung ähnlich wie bei Bakterien abläuft [283], lassen sich die langgestreckten Formen durch ihre eigene, bevorstehende Teilung erklären. Die Vernetzung der Mitochondrien könnte aus dem erhöhten Energiebedarf resultieren, der für die Teilung der Zellen benötigt wird. Durch den eingefügten Größenmaßstab in den Abbildungen lässt sich auch die Zunahme der Zellgrößen von der G1-Phase bis hin zur G2/M-Phase verfolgen.

4.3.4.2 Abbildung mitochondrialer Proteine mittels STED-Mikroskopie

Um die Clusterdichte der mitochondrialen Proteine Tom20, PDH und OGDH in den CHO-K1 Zellen in Abhängigkeit der Zellzyklusphasen zu untersuchen, wurden diese Proteine durch spezifische Antikörper intrazellulär markiert und mittels STED-Mikroskopie visualisiert. Die Präparationen und Datenanalysen erfolgten entsprechend zu den Zellproben, die während der Batch- und kontinuierlichen Kultivierung untersucht wurden.

Details können dem Kapitel 3.15.3 entnommen werden. Repräsentative Aufnahmen der Zellen nach Tom20-Markierung der Mitochondrien sind in der Abbildung 65 gezeigt und bestätigen das Verteilungsmuster, das bereits mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet werden konnte (siehe Abb. 64). Hierbei sind jeweils die Übersichten mehrerer Zellen (linke Bildaufnahme) und eine entsprechende Maximalprojektion eines analysierten Bereichs der Mitochondrien (rechte Bildaufnahme) dargestellt.

Zur Bestimmung der Verteilung der Proteincluster von Tom20, PDH und OGDH in Abhängigkeit von der Zellzyklusphase wurden die normierten Varianzen aus jeweils 30 analysierten Zellen berechnet. Die Ergebnisse der Datenanalyse zur Bestimmung der Varianzwerte sind in Abbildung 66 dargestellt.

Abb. 65: STED-mikroskopische Aufnahmen Tom20-markierter Mitochondrien in CHO-K1 Zellen zu verschiedenen Zellzyklusphasen.

(A) G1-Phase (92,4 %), 97 % Viabilität, (B) S-Phase (57,6 %), 98 % Viabilität, (C) G2/M-Phase (80,2 %), 98 % Viabilität.

A

B

C

Abb. 66: Bestimmung der Verteilung von PDH-, OGDH- und Tom20-Clustern in CHO-K1 Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen.

Dargestellt ist die normierte Varianz der lokalen Fluoreszenzsignalintensität der Mitochondrien in Abhängigkeit von der Zellzyklusphase. 30 Zellen pro Protein und Kultivierungszeitpunkt wurden mittels STED-Mikroskopie visualisiert und analysiert.

Die normierten Varianzen der drei untersuchten Proteine zeigen die niedrigsten Werte in Zellen, die während der G1-Phase fixiert wurden (Abb. 66). Hier sind die Varianzwerte für PDH, OGDH und Tom20 um 20 bis 40 % niedriger als in Zellen, die hauptsächlich während der S-Phase fixiert wurden. Die höchsten Werte wurden in den Zellen der G2/M-Phase beobachtet. Diese Werte sind um durchschnittlich 67 % (gilt für Tom20) bis 79 % (gilt für OGDH) höher als die Varianzen, die während der G1-Phase bestimmt wurden.

Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, dass die Dichte der Proteincluster von PDH, OGDH und Tom20 während der G1-Phase am größten ist und innerhalb der G2/M-Phase, während der Vorbereitung auf die Zellteilung, am niedrigsten. Da die hier betrachteten Zellen alle aus der gleichen Mischpopulation während der exponentiellen Wachstumsphase gewonnen wurden, kann für diese Untersuchung der Zellzyklusabhängigkeit der Einfluss der Kultivierungsbedingungen auf die Proteinverteilung vernachlässigt werden. Als Referenz für die hier bestimmten Varianzwerte können die Ergebnisse mit denen der STED-Analysen der kontinuierlichen Kultivierung (Mischpopulation) verglichen werden (siehe Abb. 55). So lässt sich die geringe Dichte der Proteincluster innerhalb der G2/M-Phase auf die Ausdehnung der Mitochondrien vor der Zellteilung schließen.