Isolation von Mitochondrien

In Hinblick auf die Kompartimentierung der Stoffwechselwege in tierischen Zellen ist eine separate Analyse der mitochondrialen und zytosolischen Metaboliten essentiell, um das Wissen über die in vivo Dynamik der wesentlichen Stoffwechselreaktionen zu erweitern [147, 183, 184]. Die effiziente Isolation und Separation der Mitochondrien bilden hierbei einen entscheidenden Schritt. Die Analyse der extrazellulären Metaboliten ist im Vergleich zur Analyse intrazellulärer Metaboliten relativ einfach und kann durch direkte Untersuchungen des Zellkulturmediums erzielt werden [46]. Durch eine Separation der Zellen von ihrem extrazellulären Medium und einer anschließenden Homogenisation des Zellmaterials, können auch die intrazellulären Metaboliten für entsprechende Analysen zugänglich gemacht werden. Hierbei werden jedoch die Stoffwechselprodukte der Zelle als Ganzes bilanziert, weswegen keine Informationen über die Interaktionen zwischen den Kompartimenten der Zelle erhalten werden können [45, 129]. Um eine separate Analyse der Metabolitenverteilung innerhalb der Zellkompartimente zu ermöglichen, ist eine Trennung der zytosolischen und mitochondrialen Kompartimente notwendig. Wegen des enormen Forschungsinteresses im Bereich der Mitochondrien wird die gezielte Isolation der Zellorganellen neben metabolomischen Analysen auch für proteomische oder für genomische Untersuchungen eingesetzt. In der Literatur sind daher bereits mehrere Methoden für die Isolation von Mitochondrien beschrieben [185–188]. Dabei erfordert der Isolationsprozess meist mehrere Schritte der Probenvorbereitung. Hierzu gehören die Abtrennung der Zellen von ihrem extrazellulären Medium, das Abstoppen der Stoffwechselreaktionen (Quenching), der effiziente Zellaufschluss und schließlich die Separation der Organellen von den restlichen Zellbestandteilen [189]. Die am häufigsten angewendeten Separationsmethoden sind die Differentielle Zentrifugation und die Dichtegradientenzentrifugation [187]. Bei der Differentiellen Zentrifugation werden die einzelnen Zellbestandteile bei unterschiedlichen Zentrifugationsgeschwindigkeiten in Abhängigkeit von ihrer Größe sedimentiert. Im Gegensatz dazu werden die Mitochondrien bei der Dichtegradientenzentrifugation aufgrund ihrer Dichte in einem Dichtegradienten von den übrigen Zellbestandteilen abgetrennt. Die Wahl einer geeigneten Isolationsmethode hängt dabei von den experimentellen Anforderungen an das isolierte Probenmaterial ab, wie beispielsweise die gewünschte Reinheit, Integrität, Aktivität oder

Ausbeute der Mitochondrien. Für Untersuchungen des kompartimentierten Metabolismus sind die Anforderungen an eine entsprechende Methode hoch:

 Die Methode muss aufgrund der hohen metabolischen Umsatzgeschwindigkeit möglichst schnell sein,

 sie darf den nativen Stoffwechsel nicht beeinträchtigen,

 sie muss hohe, quantifizierbare Ausbeuten liefern

 und die Methode sollte die Mitochondrien idealerweise nicht beschädigen.

Besonders in Hinblick auf separate, metabolomische Analysen ist der Erhalt der Mitochondrienintegrität zwingend notwendig, um eine Vermischung der kompartimentierten Metabolitenpools zu umgehen [190]. Eine schematische Darstellung zur Separation der verschiedenen Metabolitenpools ist in Abbildung 6 gezeigt.

Abb. 6: Schematische Darstellung zur Separation extrazellulärer, zytosolischer und mitochondrialer Metaboliten.

Aufgrund der Kompartimentierung tierischer Zellen können unterschiedliche Metaboliten in verschiedenen Konzentrationen im Zytosol und in den Mitochondrien vorliegen. Durch einen Zellaufschluss und die Freisetzung der Mitochondrien kann eine Separation der Metabolitenpools erzielt werden.

Zellaufschlussmethoden für die Isolation von Mitochondrien

Während des Isolationsprozesses kann insbesondere der Zellaufschluss eine Beschädigung der Mitochondrien bewirken. Als Zellaufschluss bezeichnet man die Zerstörung der Zellwand bzw. Zellmembran, welche in der Regel für die Gewinnung intrazellulärer Bestandteile (Proteine oder Organellen) eingesetzt wird. Während der Aufschluss effizient erfolgen muss, um eine hohe Produktfreisetzung zu erzielen, sollte der destruktive Einfluss auf die gewünschten Isolate so gering wie möglich gehalten werden. Zu den gängigen Methoden, die für den Aufschluss tierischer Zellen verwendet werden, zählen die Dounce- und Potter-Elvehjem Homogenisation [191, 192], die Stickstoff-Dekompression [193–

195], die Ultraschallbehandlung [196, 197], chemische oder enzymatische Zelllyse sowie das Schockgefrieren und Auftauen [197, 198]. Da diese Methoden die Zellmembranen zerstören, besitzen sie ebenso das Potential die Mitochondrienmembranen zu beschädigen [199]. Besonders Ultraschallbehandlungen, die auch für den Aufschluss von Bakterienzellwänden herangezogen werden, haben häufig einen negativen Einfluss auf die Integrität der Mitochondrienmembranen [187, 200, 201]. Aus diesem Grund muss jede dieser Anwendungen in Hinblick auf die Isolation intakter Mitochondrien kritisch betrachtet und optimiert werden.

Für die Isolation von Organellen aus tierischen Zellen hat sich in den vergangenen Jahren der Zellaufschluss mittels Dounce- oder Potter-Elvehjem Homogenisator zur Methode der Wahl entwickelt und wird daher bevorzugt für zahlreiche experimentelle Analysen von Mitochondrien eingesetzt [185, 188, 191, 202]. Hierbei werden die Zellen durch die Scherkräfte bei der mechanischen Reibung eines Pistills in einem Glaskolben homogenisiert. Als die derzeit gängigste Methode soll innerhalb dieser Arbeit der Zellaufschluss mittels Dounce-Homogenisator als Referenz für alle weiteren Methoden dienen.

Im Vergleich zur Dounce-Homogenisation wurden bislang nur wenige Untersuchungen über die Mitochondrienisolation mittels Ultraschall durchgeführt [196]. Ein Grund dafür könnte darin liegen, dass bei der Ultraschallhomogenisation Wärmeenergie freigesetzt wird, die zur Denaturierung von Proteinen und somit zur Beeinträchtigung der Mitochondrien führen könnte. Andererseits kann der hohe Energieeintrag auch zur Zerstörung der Mitochondrienmembranen führen, weshalb diese Methode für den Erhalt intakter Organellen potentiell als ungeeignet erscheint. Allerdings konnten

Forschungsergebnisse unlängst zeigen, dass durch den Einsatz von Ultraschall ebenfalls Mitochondrien in hoher Quantität und Qualität aus tierischen Zellen isoliert werden konnten. Da der Einsatz von Ultraschall schnell erfolgen kann und diese Methode ebenfalls ein hohes Automatisierungspotential im Bereich der Mikrochiptechnologie aufweist, sollte Ultraschall auch innerhalb dieser Arbeit verwendet werden.

Die Verwendung von chemischen Detergenzien (z.B. Triton) für den Zellaufschluss könnte zu einer Beeinträchtigung des Metabolismus führen und zudem eine Lyse der Mitochondrienmembranen bewirken. Andererseits haben aktuelle Untersuchungen bewiesen, dass das Detergens Digitonin eine effektive Permeabilisierung der Zellmembran bewirkt, während die Mitochondrienmembranen unbeschädigt bleiben [203].

Die irreversible Elektroporation steht im Fokus vieler aktueller Studien [204, 205]. Diese Methode besitzt das Potential Organellen freizusetzen, ohne dabei deren Integrität zu beeinträchtigen [206, 207]. Sowohl eine chemische Permeabilisierung, als auch die Verwendung von Elektroporation ließen sich technologisch in mikrofluidische Systeme integrieren [208, 209], weshalb auch diese Methoden im Fokus der vorliegenden Arbeit stehen sollen.