Integrität und Morphologie der Mitochondrien

Der Einfluss der jeweiligen Zellaufschlussmethode auf die Integrität der freigesetzten Mitochondrien wurde in dieser Arbeit durch Messungen der Citratsynthase- und der Cytochrom c Oxidase Aktivitäten untersucht. Hierbei wurde die Integrität der Mitochondrien direkt nach dem Zellaufschluss nach dem ersten Zentrifugationsschritt (2000 x g, 5 min) im Überstand des Zellhomogenats gemessen.

Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind nur die Integritäten der äußeren Mitochondrienmembranen (Cytochrom c Oxidase Aktivität) in den Diagrammen in Abbildung 21 dargestellt. Gemäß dieser Diagramme kann eine Abnahme der Integrität der Mitochondrien in Abhängigkeit von einer Erhöhung der Anwendungszyklen oder der Konzentration für jede getestete Methode beobachtet werden. Hierbei sind jedoch deutliche Unterschiede beim Vergleich der Methoden zu erkennen. Während die Integrität nach der Zellpermeabilisierung durch Digitonin oder Elektroporation nur um durchschnittlich maximal 10 bis 15 % des anfänglich gemessenen Wertes abnimmt, kann ein Verlust der Integrität von durchschnittlich 70 bis 80 % nach dem Zellaufschluss durch Dounce oder Ultraschall Homogenisation bei erhöhten Anwendungsintervallen gemessen werden. Durch die Anwendung des Dounce Homogenisators sinkt die Integrität der freigesetzten Mitochondrien bereits nach 50 Stößen auf 60 % und liegt nach weiteren 50 Stößen nur noch bei 45 %. Nach 200 Stößen sind nur noch 22 % der äußeren Mitochondrienmembranen intakt. Bei dem Zellaufschluss mittels Ultraschall sinkt die Integrität nach einer gesamten Anwendungsdauer von 45 s auf 70 % ab, während nach 105 s nur noch 17 % der isolierten Mitochondrien eine intakte äußere Membran aufweisen.

Eine Übersicht der Daten sowie die gemessenen Integritäten der äußeren und inneren Mitochondrienmembranen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tab. 1: Zusammenfassung der Messdaten zum Vergleich der verwendeten Zellaufschlussmethoden.

Die Werte beziehen sich jeweils auf 1·10⁸ CHO-K1 Zellen, resuspendiert in 5 mL MIP.

Zellaufschlussmethode Disruptor Bar (Ø 3 mm), Branson 20 kHz Pulsfrequenz

10 % Frequenzzyklus (≙ 1 Puls ·s^-1) Output control 1 (≙ minimale Amplitude (116 µm) der Ultraschall- Vibrationen) Zellinkubation für 10 s

0.01% (w/v) 97.3 ± 1.9 0.51 ± 0.04 94.3 ± 4.1 96.9 ± 1.2

Gene Pulser II, Bio-Rad Electroporations-Küvetten: Gene Pulser Cuvettes (0.4 cm) Bio-Rad 800 Ohm, 0.7 kV, 50 µF.

Im Vergleich der Integritäten von äußeren und inneren Mitochondrienmembranen zeigen sich für alle Methoden bei gleichen experimentellen Bedingungen durchgehend geringere Werte für die äußere Membran als für die innere. Nach dem Zellaufschluss mittels Dounce Homogenisator ist die Integrität der inneren Membranen um 15 bis 37 % höher als die der äußeren Membranen. Nach den Ultraschallbehandlungen unterscheiden sich die Integritäten um rund 10 bis 42 %. Die gemessenen Integritäten nach der Digitonin-Permeabilisierung oder Elektroporation weisen vergleichbare Werte auf. Für beide Methoden ist die innere Membranintegrität um 4 bis 12 % höher als die äußere. Diese Ergebnisse lassen sich darauf zurückführen, dass die äußere Mitochondrienmembran der inneren Membran Schutz bietet und diese erst dann beeinträchtigt wird, wenn die äußere Membran bereits beschädigt ist.

Abb. 24: Fluoreszenzaufnahmen isolierter Mitochondrien nach differentieller Zentrifugation.

Die Mitochondrien wurden im Zellhomogenat durch spezifische Antikörperfärbung visualisiert (primär:

anti-Tom20 und sekundär: AlexaFluor 488 Goat-anti-Rabbit-IgG); 100-fache Vergrößerung; (A) nach Dounce Homogenisation (100 Pistillstöße), (B) nach Ultraschallaufschluss (45 s), (C) nach Digitonin Permeabilisierung (0,01 %), (D) nach Elektroporation (3 Schocks).

Neben den enzymatischen Methoden sollten ebenfalls durch Visualisierung der Mitochondrien mittels Konfokalmikroskopie Rückschlüsse auf die Konstitution und Ausbeute der isolierten Mitochondrien gewonnen werden. Hierfür wurden nach erfolgtem Zellaufschluss und anschließender differentieller Zentrifugation Proben isolierter Mitochondrien durch spezifische Antikörperfärbung (siehe Kapitel 3.14.5) fluoreszenzmarkiert und danach bei 100-facher Vergrößerung konfokalmikroskopisch visualisiert. Aufnahmen isolierter, fluoreszenzmarkierter Mitochondrien sind in Abbildung 24 dargestellt.

Unabhängig von der verwendeten Zellaufschlussmethode besitzen die isolierten Mitochondrien eine kreisrunde Form, wie beim Vergleich der Fluoreszenzaufnahmen in Abbildung 24 zu erkennen ist. Außerdem sind in jeder Mitochondrienprobe neben den runden Formen auch Fragmente von Mitochondrien enthalten. Allerdings lassen die Aufnahmen auch deutliche Unterschiede im Vergleich der Zellaufschlussmethoden erkennen. Wie bereits durch die Bestimmung der Proteinkonzentration in den Isolaten gezeigt wurde, lässt sich auch hier die höchste Mitochondriendichte in den Isolaten beobachten, die nach dem Zellaufschluss mittels Ultraschall (45 s) gewonnen wurden (Abb. 24B). Eine sehr niedrige Mitochondriendichte wurde in den Proben detektiert, die nach Digitonin-Permeabilisierung oder Elektroporation isoliert wurden (Abb. 24C+D).

Hierbei konnte in den Isolaten beider Zellaufschlussmethoden ein durchschnittlicher Durchmesser der Mitochondrien von 0,5 bis 0,8 µm gemessen werden. Im Vergleich dazu wurden in den Proben, die mittels Dounce Homogenisation oder Ultraschall aufgeschlossen wurden, Mitochondrien mit einem Durchmesser von 0,5 bis zu 2,5 µm detektiert.

Eine Abschätzung der Mitochondriendichte wurde durch die Verwendung einer Neubauerzählkammer (für Bakterien) durchgeführt. Hierfür wurde der Zählbereich (Kleinstquadrat, 50 x 50 µm) der Kammer bei 100-facher Vergrößerung licht-mikroskopisch aufgenommen und mit dem entsprechenden Bereich der Fluoreszenz-aufnahmen der isolierten Mitochondrien überlagert. Die Mitochondrienzählung konnte hierdurch entsprechend einer Bakterienzählung erfolgen. Dabei wurden nur kreis- bis halbrunde Strukturen als Mitochondrium gewertet, während kleinere Fragmente nicht mitgezählt wurden. Auf diese Weise wurden folgende Mitochondrienkonzentrationen in den vier verschiedenen Proben bestimmt:

Dounce: 9,8·10⁸ Mitochondrien/mL

(entspricht 19,6·10⁷ Mitochondrien aus 10⁸ Zellen) Ultraschall: 19,2·10⁸ Mitochondrien/mL

(entspricht 38,4·10⁷ Mitochondrien aus 10⁸ Zellen) Digitonin: 0,86·10⁸ Mitochondrien/mL

(entspricht 1,73·10⁷ Mitochondrien aus 10⁸ Zellen) Elektroporation: 1,82·10⁸ Mitochondrien/mL

(entspricht 3,65·10⁷ Mitochondrien aus 10⁸ Zellen)

Nach dem Zellaufschluss durch Dounce oder Ultraschall Homogenisation konnten in den Homogenaten vorwiegend Zellfragmente und nur wenige verbliebene intakte Zellen beobachtet werden (abhängig von der Aufschlusseffizienz der jeweiligen Methode). Im Gegensatz dazu enthielten Proben, die mit Digitonin oder Elektroporation behandelt wurden, fast ausschließlich „Cell Ghosts“. Dabei handelt es sich um permeabilisierte Zellen, die noch von ihrer Zellmembran umgeben sind und die Zellorganellen umschließen. Durch diese Beobachtung lässt sich die geringe Mitochondrienausbeute erklären, die nach dem Zellaufschluss mittels Digitonin oder Elektroporation erzielt wurde.

Bei beiden dieser Methoden sind die Mitochondrien noch an das Zytoskelett gebunden und dadurch nicht in der Lage die permeabilisierte Zellmembran zu passieren (vgl. Abb. 23).

4.1.3 Evaluierung der Zellaufschlussmethoden für die