Methoden

3.2.1 Kultivierung von Bakterien

3.2.1.1 Kultivierung von E. coli

Zur Kultivierung von E. coli wurde LB-Medium verwendet. Zur Anzucht einer Flüssigkultur wurden 10 ml LB-Medium in einem Reagenzglas verwendet. Beimpft wurde mit 10 µl einer flüssigen Bakterienkultur oder mit einer Kolonie, die von einer LB-Agar-Platte gepickt wur-de. Bei 37°C wurde die Kultur im Brutschrank auf einem Schüttelinkubator über Nacht inku-biert. Handelte es sich um eine Kultivierung nach einer Transformation, dann wurden je nach Plasmid unterschiedliche Antibiotikazusätze hinzugefügt.

3.2.1.2 Kultivierung von schnell- und langsamwachsenden Mykobakterien

Flüssigkulturen von maximal 15 ml wurden in Ink square bottles angezüchtet. Größere Volu-mina von mehr als 15 ml wurden in Rollerbottles inkubiert. Als Flüssigmedium wurde 7H9-Medium mit einem OADC-Zusatz (200 µl/ml 7H9) eingesetzt. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 5-10 Tage auf einer Rollerbottle-Einheit oder bei Verwendung von Ink square bott-les auf einem Schüttelinkubator.

3.2.2 Konservierung und Lagerung von Kulturen

Um alle hergestellten Bakterienstämme zu konservieren, wurde eine Tiefgefrierstammkultur hergestellt. Hierzu wurde eine Bakterienkultur benötigt, die sich in der exponentiellen Wachs-tumsphase befand. Diese WachsWachs-tumsphase wurde bei E. coli nach 20-24 Stunden erreicht. Bei den Mykobakterien ist die benötigte Wachstumsphase dann erreicht, wenn die Optische Dich-te (OD) bei 600nm einen Wert von 0,8-1 erreicht hat. Eine solche Kultur wurde anschließend bei 4000 x g für 10 Minuten zentrifugiert und das Pellet in 1 ml Medium mit einem Zusatz von 15 % Glycerol resuspendiert und bei –70°C gelagert.

3.2.3 Herstellung elektrokompetenter Zellen

3.2.3.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli

Eine 5 ml Übernacht-Kultur von E. coli HB101 wurde am folgenden Tag in 500 ml LB-Flüssigmedium überführt und bei 37°C auf einem Schüttelinkubator bebrütet. In regelmäßi-gen Abständen wurde die OD600 gemessen, bis der Wert 0,5 erreicht wurde. Dann wurden die Zellen 15 Minuten auf Eis gekühlt und schließlich in einer 4°C Zentrifuge 20 Minuten bei 3000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in zwei nachfol-genden Waschschritten mit eisgekühltem dest. H2O resuspendiert und anschließend wieder bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert. Beim dritten Waschschritt wurde das Pellet mit 100 ml 10 %igen Glycerol resuspendiert und erneut zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 6 ml 10 %igen Glycerol aufgenommen, in 300 µl Portionen aliquotiert und in flüssigem Stick-stoff schockgefrostet. Die Lagerung erfolgte bei -70°C.

3.2.3.2 Herstellung elektrokompetenter Mykobakterien

Ausgangspunkt der Herstellung elektrokompetenter Mykobakterien war eine 50 ml Roller-bottle-Kultur. Die OD600 musste je nach gewünschter Transformationsart einen Wert zwi-schen 0,8-1 besitzen, wenn die Transformation mit Glycerol durchgeführt werden sollte.

Wenn eine Transformation mit Tris-HCL-Sucrose durchgeführt werden sollte, musste ein Wert von 0,4 vorliegen. Wenn die gewünschten OD600-Werte erreicht waren, wurde die Kul-tur in zwei 50 ml Falcons aufgeteilt und bei ZimmertemperaKul-tur bei 2250 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Es folgten drei Waschschritte entweder mit 50 ml 10 %iger Glycerollösung oder mit 30 ml Tris-HCL-Sucroselösung. Das Pellet wurde bei jedem Waschschritt mit der entsprechenden Lösung resuspendiert und wieder bei 2250 x g für 10 Minuten abzentrifugiert. Beim letzten Waschschritt wurde das Pellet in 5 ml entsprechen-der Lösung aufgenommen.

3.2.4 Transformation in elektrokompetente Zellen

3.2.4.1 Transformation in E. coli HB101

Die Transformation von Plasmid-DNA in elektrokompetente E. coli-Stämme erfolgte durch Verwendung eines Elektroporationsgerätes bei 2,5 kV, 25 µF und 400 Ω.

50 µl einer auf Eis aufgetauten E. coli-Kultur wurden mit 1 µl bzw. nach Glykogenfällung mit 2 µl DNA vermischt und in eine auf Eis vorgekühlte Transformationsküvette überführt. Sowie die Elektroporationsküvette befüllt war, wurde sie auf Eis gestellt und die Elektroporation durchgeführt. Nach der Transformation wurden die Bakterien in 1 ml LB-Medium für 1 Stunde bei 37°C im Schüttelinkubator bebrütet. Während dieser Inkubation sollte die erhal-tene Antibiotikaresistenz exprimiert werden. Im Anschluss wurden die Bakterien auf LB-Agar mit entsprechendem Antibiotikazusatz ausgestrichen und bei 37 °C über Nacht inkubiert. Die Wahl des Antibiotikums richtete sich nach der Antibiotikaresistenz des Plasmids.

Als Kontrollen wurden eine Positiv- (Plasmid mit hoher Transformationseffizienz), eine Ne-gativ- (dest. H2O) und eine weitere Kontrolle (Ligation des dephosporylierten Vektors ohne Insert) transformiert.

3.2.4.2 Transformation in schnellwachsende Mykobakterien

400 µl elektrokompetente M. smegmatis-Bakterien wurden auf Eis aufgetaut und mit 1 µl, oder nach Glykogenfällung mit 2 µl zu transformierender Plasmid-DNA vermischt. Die auf

Eis vorgekühlten Transformationsküvetten wurden befüllt und bis zur anschließenden Trans-formation wieder auf Eis gestellt. Die TransTrans-formation wurde mittels eines Elektroporationsge-rätes bei 2,5 kV, 25 µF und 1000 Ω durchgeführt. Nach der Elektroporation wurde die Bakte-rienkultur in 1 ml 7H9-Medium aufgenommen und in einem Schüttelinkubator bei 37°C für 3 Stunden bebrütet. Nach dieser Inkubationszeit wurden je 100µl auf 7H10-Agarplatten mit entsprechenden Antibiotikazusätzen ausplattiert und 5-7 Tage bei 37°C im Brutschrank inku-biert. Auch hier richtete sich die Antibiotikaauswahl nach den verwendeten Plasmiden.

Wie bei der E. coli-Transformation werden auch hier entsprechende Kontrollen mitgeführt.

3.2.4.3 Transformation in langsamwachsenden Mykobakterien (mit 10 %igen Glyce-rol)

Mykobakterien wie M. tuberculosis H37Rv oder Erdman wurden als Vorbereitung für die Transformation durch drei Waschschritte mit 10 %igen Glycerol elektrokompetent gemacht.

Von diesen Bakterien wurden 400 µl mit 1 µl DNA gemischt, in eine auf 50 °C vorgewärmte Einmal-Elektroporationsküvette überführt und ca. 1-3 Minuten bei 50 °C inkubiert. Unmittel-bar daran schloss sich die Transformation bei 2,5 kV, 25 µF und 1000 Ω an. Danach wurden die Bakterien in 1 ml 7H9/OADC-Medium überführt und bei 37°C über Nacht im Brut-schrank inkubiert. Die Bakterien wurden am nächsten Tag auf 7H10-Platten mit einem Anti-biotikumzusatz ausgestrichen und für ca. 3 Wochen bei 37 °C bebrütet.

3.2.4.4 Transformation in langsamwachsenden Mykobakterien (mit Tris-HCL-Sucroselösung)

Eine weitere Möglichkeit, die langsamwachsenden Mykobakterien für die Transformation elektrokompetent zu machen, war eine neue Methode von Dr. Hatsumi Taniguchi aus Japan.

Hier wurde die Bakterienkultur mit Tris-HCL-Sucroselösung dreimal gewaschen. 1 µl Plas-mid-DNA mit einer Konzentration von 10 µg wurde mit 200 µl der vorbereiteten Kultur ver-mischt. Dann wurde diese Kultur in Einmal-Elektroporationsküvetten überführt, auf 50°C erwärmt und bei 1,25 kV, 25µF und 600 Ω transformiert. Die Kultur wurde in 1 ml 7H9/OADC-Medium aufgenommen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am folgendem Tag wurden je 700µl auf antibiotikahaltigen 7H10/OADC-Agarplatten ausplattiert.

3.2.5 Homologe Rekombination

3.2.5.1 Selektion der Transformanten

Zur Selektion der Mykobakterien, die das transformierte Plasmid über einen single-crossover in das Genom integriert hatten, wurden die Bakterien nach einer 3 stündigen Expressionszeit auf hygromycinhaltige 7H10-Platten ausgestrichen und 4 Wochen bei 37 °C inkubiert.

3.2.5.2 „Ausloopen“ der Mutanten und anschließende Selektion

Die erfolgreiche Integration des Plasmids in die Mykobakterien wurde zunächst mittels PCR und Southernblotanalyse überprüft. Anschließend erfolgte das Ausloopen des Plasmidberei-ches. Das Antibiotikaresistenzgen diente als positiver Selektionsmarker und das sacB-Gen als negativer Selektionsmarker. Das „Ausloopen“ wurde ohne Ausübung eines Selekionsdrucks in 10 ml 7H9/OADC-Medium durchgeführt. Die Cointegrantenkultur wurde für 1 Woche bei 37 °C im Schüttelinkubator bebrütet. Mit der hochgewachsenen Flüssigkultur wurde eine Verdünnungsreihe von 10⁰ – 10^-7 erstellt. Dazu wurden jeweils 100 µl der niedrigeren Ver-dünnungsstufe in 900 µl 7H9 aufgenommen und vermischt. Von jeder VerVer-dünnungsstufe wurden jeweils 100 µl auf eine 7H10-OADC-2%Sucrose-Platte ausgestrichen und bei 37 °C für 3 Wochen inkubiert. Bei Bakterien, die den Negativselektionsmarker sacB nicht verloren hatten, kodierte dieses Gen für die Lävansaccharase. Das Enzym wandelte Sucrose in Glucose und Fructose um und polymerisiert lange Ketten aus Fruktosemonomeren (Lävane). Lävane sind für Mykobakterien letal, so dass auf den 7H10-OADC-2%Sucrose-Platten nur die Bakte-rien wachsen konnten, die das Gen ausgeloopt hatten. Zur Kontrolle der Spontanmutationsrate des sacB-Gens wurden je 10 µl der Verdünnungsstufen 10^-4 bis 10^-7 auf ein Viertel einer 7H10-Platte ohne Succrose ausgestrichen und unter den gleichen Bedingungen inkubiert.

3.2.5.3 Screening

Das Screening der Mutanten bestand in einem Wachstumsvergleich von Kolonien auf Nähr-böden mit und ohne Antibiotikumzusatz. Einzelkolonien wurden von den 7H10-OADC-2%Sucrose-Platten gepickt und auf ein nummeriertes Areal einer 7H10-Platte und auf einen gleichnumerierten Bereich einer 7H10-Platte mit einem Hygromycinzusatz ausgebracht. Die Platten wurden bei 37 °C für 3 Wochen inkubiert. Kolonien, die Wachstum auf den Platten ohne Antibiotikumszusatz und kein Wachstum auf den Hygromycinplatten zeigten, wurden durch eine erneute Southernblotanalyse weiter untersucht.

3.2.6 Erstellung, Markierung und Quantifizierung einer Hybridisierungssonde Mittels PCR konnte eine gewünschte Hybridisierungssonde erstellt werden. Die Primer, die für die PCR benötigt wurden, wurden von der Firma MWG-Biotech AG synthetisiert. Das erhaltene PCR-Amplifikat wurde mit dem GFX DNA and Gel Purification-Kit aufgereinigt.

Zur Markierung der Sonde wurde das DIG randomprimed DNA Labeling-Kit der Firma Boehringer Mannheim verwendet. Es handelte sich um ein nicht radioaktives Verfahren, bei dem das an dUTP angelagerte Steroidhapten Digoxigenin (DIG) durch das Klenow-Enzym mit der Sonden-DNA verbunden wurde.

Die Markierung erfolgte nach Angabe des Herstellers.

Die Quantifizierung der Hybridisierungssonde war nötig, um die Menge der einzusetzenden Sonden-DNA zu bestimmen. Je 1µl einer Verdünnung von 1:10, 1:100, 1:100 und 1:10000 der Sonden-DNA wurden auf eine Nylonmembran aufgetragen. Um die Konzentration der Sonden-DNA ablesen zu können, wurde die in dem Kit enthaltene Kontroll-DNA mit den Konzentrationen 100pg/µl, 10pg/µl, 1pg/µl, 0,1pg/µl und 0,01pg/µl ebenfalls auf die Nylon-membran aufgetragen. Die Entwicklung der NylonNylon-membran erfolgte analog dem Protokoll zur Entwicklung einer hybridisierten Nylonmembran, wie es in Kapitel 3.2.7 beschrieben wurde (s. Kapitel Southernblotanalyse). Das Signal der Hybridisierungssonde wurde mit dem Signal der Kontroll-DNA verglichen. Bei gleicher Stärke wurden pro 10 ml Hybridisierungs-lösung 10 µl Sonden-DNA eingesetzt. Die Sonde wurde zunächst für 10 Minuten aufgekocht, dann auf Eis abgekühlt und mit der Hybridisierungslösung vermischt. Durch Lagerung bei –20°C konnte die Lösung mehrmals verwendet werden, musste aber vor Gebrauch erneut für im kochenden Wasserbad denaturiert werden.

3.2.7 Southernblotanalyse

Bei der Methode, die von Southern (1975) beschrieben wurde, wurde die genomische DNA mittels ausgewählter Restriktionsendonucleasen gespalten und mit Hilfe einer Gelelektropho-rese ihrer Größe nach aufgetrennt. Die Übertragung der aufgetrennten genomischen DNA auf eine Nylonmembran wird als Blotting bezeichnet.

5 µl der zu untersuchenden und 3 µl einer Kontroll-DNA wurden mit einer entsprechenden Menge von Restriktionsendonucleasen über einen Zeitraum von mindestens 10 Stunden inku-biert. So sollte eine vollständige Spaltung gewährleistet werden. Im Anschluss wurde eine

Gelelektophorese bei 120 V und 270 mA für 50 Minuten durchgeführt. Nach Färbung des Geles mit Ethidiumbromid wurde es mit einem Längenmaß unter UV-Licht Einwirkung foto-grafiert. Zur Denaturierung der DNA wurde das Gel 2 x 30 Minuten in Denaturierungslösung (DNAI-Lösung) geschwenkt. Die Neutralisation erfolgte durch zweimaliges Waschen für je 30 Minuten in einer Neutralisationslösung (DNAII-Lösung). Der Transfer der DNA auf eine Nylonmembran erfolgte über Nacht. Dazu wurde eine Lage Whatman-Papier auf eine Vor-richtung, die etwa der Größe eines Agarosegels entsprach und die in einer Schale stand, ge-legt. Das Saugpapier reichte an den längsseitigen Enden über die Vorrichtung hinaus bis auf den Boden der Schale. Die Schale wurde mit 20 x SSC-Puffer gefüllt und das Saugpapier mit der gleichen Lösung angefeuchtet. Der Puffer stellte eine Transferlösung dar. Durch die Saugkraft der Papiere konnte die DNA über die Transferlösung auf eine Nylonmembran über-tragen werden. Dazu wurde das Agarosegel mit der glatten Seite nach oben luftblasenfrei auf das Saugpapier gelegt und mit einer Nylonmembran ohne Luftblasenbildung vollständig be-deckt. Auf die Nylonmembran wurden diesmal zwei Lagen Whatman-Papier gelegt und abschließend mit einer ca. 15 cm hohen Lage Zellstoffpapier versehen. Oben auf den Stapel wurde dann eine dicke Plexiglasscheibe gelegt, auf die ein mindestens 500 g schweres Ge-wicht gelegt wurde. Der Transfer wurde über Nacht durchgeführt.

Nach dem Transfer wurde die Nylonmembran zur Fixierung der DNA mit UV-Licht behan-delt (UV-Cosslinking).

Der nächste Schritt des Southernblots war die Prähybridisierung. Hier wurde die Membran für 1 Stunde bei 65 °C mit 20 ml Hybridisierungspuffer pro 100 cm² Membranfläche gewaschen, um den unerwünschten Hintergrund zu entfernen, der durch unspezifische Bindung der DIG-DNA-Sonde an die Nylonmembran entstand. Nach der Prähybridisierung folgte die Hybridi-sierung mit 2,5 ml HybridiHybridi-sierungslösung mit DIG-markierter Sonde pro 100 cm² Membran-fläche. Die Hybridisierung erfolgte im Hybridisierungsofen bei 65 °C über Nacht.

Am nächsten Tag wurde die Membran für 2 x 30 Minuten in Waschlösung I (WashI) und 2 x 30 Minuten in Waschlösung II (WashII) bei 65 °C gewaschen. Mit diesem Schritt wurden Basenpaarungen mit weniger als 95 %ige Homologie zwischen Sonde und DNA beseitigt.

Für die Chemilumineszenz-Detektion wurde die Membran 5 Minuten in Waschpuffer gewa-schen, für 30 Minuten in Puffer 2 und für weitere 30 Minuten in 50 ml/100cm² Puffer 2 mit 5µl 1.10000 Anti-Dig-AP inkubiert. Danach wurde die Membran 3 x 10 Minuten in Wasch-puffer gewaschen und anschließend für 5 Minuten in 20 ml Puffer 3 äquilibriert. In einer Schale wurde die Nylonmembran mit 1.100 in Puffer 3 verdünntes CSPD gelegt und im Dun-keln für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. CSPD ist ein Chemilumineszenzsubstrat, das unter

alkalischen Bedingungen zu einem instabilen Zwischenprodukt dephosphoryliert und unter Lichtemission zu einem stabilen Endprodukt zerfällt. Überschüssiges Substrat wurde abge-streift, die Membran anschließend in einer Plastikfolie eingeschweißt und nochmals für 15 Minuten bei 37 °C im Dunkeln inkubiert.

Die anschließende Exposition eines Röntgenfilms erfolgte für mehrere Stunden. Nach der Entwicklung des Röntgenfilms war das Ergebnis der Hybridisierung zu sehen.

3.2.8 Präparation von DNA

3.2.8.1 Präparation von Plasmid-DNA

Die Präparation erfolgte mit Hilfe der vorgefertigten Puffer1-3 der Firma QIAGEN^.

Als Ausgangsmaterial wurden 1,5 ml einer E. coli-Übernachtkultur verwendet und in einem 1,5 ml Eppendorfgefäß bei 10.000 x g zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in 100 µl Resuspensionspuffer (QIAGEN^ Puffer1) gelöst und nach Zugabe von 100 µl Lysepuffer (QIAGEN^ Puffer2) bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Dann wurden 100 µl Neut-ralisationspuffer (QIAGEN^ Puffer3) dazupipettiert und für 15 Minuten auf Eis gestellt. Die entstandenen Zelltrümmer wurden bei 10.000 x g abzentrifugiert und der Überstand in eine neues Eppendorfgefäß überführt. Im Anschluss erfolgte eine Phenolisierung mit einem Phe-nol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1)-Gemisch (Roti-Phenol^). Es wurden 300 µl Phenol zu dem Überstand zugegeben und durch vorsichtiges Schwenken gemischt. Nach der an-schließenden Zentrifugation bei 10.000 x g wurde die obere wässrige Phase in ein neues Ep-pendorfgefäß überführt. Die Fällung der DNA erfolgte durch Zugabe von 96 %igen Ethanol und nach 15 minütiger Inkubation auf Eis. Durch erneute Zentrifugation bei 10.000 x g wurde das entstandene Pellet mit 70 %igen Ethanol gewaschen und wieder zentrifugiert. Das gebil-dete Pellet wurde bei 37°C getrocknet und schließlich in 30 µl sterilem dest. H2O aufgenom-men.

Die Lösungen bewirkten eine alkalische Denaturierung von hochmolekularer chromosomaler DNA bei einem pH-Wert von 12. Die niedermolekulare Plasmid-DNA wurde nicht denatu-riert, sondern blieb in Lösung und konnte mit unverdünntem Ethanol gefällt werden.

3.2.8.2 Präparation von Plasmid-DNA mit Präparations-Kits

Um sauber präparierte Plasmid-DNA für die Sequenzierung von DNA-Proben zu gewinnen, wurde die DNA mit dem Sigma^ Gen ElutePlasmid Miniprep Kit oder dem Nuleo Spin-Kit

von Macherey und Nagel^ gewonnen. Die Präparationsanleitungen wurden den Protokollen der Hersteller entnommen.

3.2.8.3 Präparation von genomischer DNA

Die Präparation von genomischer DNA beruht bei der hier angewandten Methode auf einem enzymatischen Zellaufschluss durch Lysozym und Proteinase K.

Eine Ausgangskultur von 10 ml wurde in 15 ml Falcons gefüllt und bei 4.000 x g für 20 Mi-nuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml Bakterienlysepuffer resuspendiert, in ein 2 ml großes, verschraubbares Eppendorfgefäß überführt und anschließend 10 Minuten bei 10.000 x g zentrifugiert. Anschließend wurde 450 µl Bug Lysis Solution und 50 µl Lysozym (10 mg/ml) hinzugefügt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Lysat mit 100 µl 10 %igem SDS vorsichtig gemischt und 50 µl Proteinase K (10 mg/ml) hinzupipet-tiert. Es folgte eine Inkubation für 30 Minuten bei 55°C. Nach Zugabe von 200 µl 5M NaCl und 160 µl einer, auf 65°C vorgewärmten Cetrimid-Salzlösung, erfolgte für 10 Minuten eine erneute Inkubation bei 65°C. Anschließend wurden 500 µl Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) dazupipettiert und durch vorsichtiges Schwenken vermischt. Nach Zentrifugation bei 10.000 x g für 7 Minuten wurde die obere Phase in ein verschließbares, 2 ml großes Eppendorfgefäß überführt und erneut mit 500 µl Chloroform-Isoamylalkohol gemischt. Wieder wurde bei 10.000 x g für 7 Minuten zentrifugiert und der Überstand erneut in ein Eppendorfgefäß über-führt. Die Präzipitation der DNA erfolgte nach Zugabe von 560 µl Isopropanol bei Raumtem-peratur innerhalb von 15-30 Minuten. Anschließend wurde das Eppendorfgefäß bei 10.000 x g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Waschen des Pellets erfolgte mit 70 % Ethanol bei 10.000 x g für 10 Minuten. Das Pellet wurde an der Luft für 15 Minuten getrocknet und dann in 25 µl sterilem dest. H2O bei 4°C über Nacht gelöst.

3.2.9 Restriktionsspaltung

Eine Restriktionsspaltung von präparierter DNA wurde durch Einsatz von Restriktionsendo-nukleasen erreicht. Alle verwendeten Enzyme sind im Anhang aufgeführt.

Ein Reaktionsansatz bestand aus 10 µl. Dieser Ansatz wurde aus 3µl DNA, einer vom Her-steller angegebene Menge Enzym (in Units angegeben) und 1 µl 10x konzentriertem Puffer zusammenpipettiert. Je nach eingesetzter Enzym- und Puffermenge wurde mit sterilem dest.

H2O auf ein Reaktionsvolumen von 10 µl aufgefüllt und für 1 Stunde bei 37°C (soweit vom

Hersteller nicht anders angegeben) im Heizblock inkubiert. Für die Aktivität der Enzyme wurde ein Milieu mit einem bestimmten Salzgehalt benötigt, das durch die Zugabe der Puffer erreicht wurde.

3.2.10 Agarosegelelektrophorese

Mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese ist es möglich Nukleinsäuren in einem elektrischen Feld wandern zu lassen. aufgrund ihrer negativ geladenen Phosphatgruppen und nach ihrer Größe (zwischen 200 bis 20.000bp) aufzutrennen.

Als Transportmilieu diente ein 0,7–2 % Agarosegel, welches aus einer entsprechenden Menge Agarosepulvers mit 50 x TAE-Puffer und Wasser angesetzt wurde. Nach dem Aufkochen wurde die Flüssigkeit in einen Gelschlitten mit Taschenaussparung gegossen, ausgehärtet und in eine Elektrophoresekammer eingesetzt. Als Laufpuffer in der Elektrophoresekammer dien-te 1 x TAE-Puffer. Die DNA wurde mit einem Ladepuffer versetzt und zusammen mit 5 µl (500 ng) eines Größenstandards auf das Gel aufgetragen. Die angelegte Spannung betrug 120 Volt für 50 bis 120 Minuten.

Anschließend wurde die DNA in einem Ethidiumbromidbad (0,8 mg/ml) gefärbt, unter UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert.

3.2.11 Gelbandenisolierung und -aufreinigung

Um die gewünschten Gelbanden zu isolieren, wurde das Agarosegel nach der Ethidiumbro-midfärbung auf einen UV-Tisch gelegt. Unter UV-Licht wurde die gewünschte Bande aufge-sucht und mit einem Skalpell ausgeschnitten. Das ausgeschnittene Gelstück wurde in ein Ep-pendorfgefäß überführt und gewogen.

Zur Aufreinigung von DNA-Banden wurde das GFX PCR DNA and Gel Purification Kit der Firma Amersham Biosciences^ verwendet. Bei diesem Kit wurde die DNA an eine Glas-fibermatrix gebunden und u. a. von Salzen und Proteinen befreit. Die DNA wurde anschlie-ßend durch Lösungen mit einer niedrigen Salzkonzentration wie bspw. dest. H2O eluiert.

Durch das ermittelte Gewicht der Gelbande konnte eine entsprechende Menge Capture Buffer hinzugegeben werden. Laut Anleitung des Herstellers wurden 10 µl Capture Buffer pro 10 mg Gelband dazupipettiert und für 10 Minuten bei 60 °C in einem Heizblock inkubiert

Der Puffer und die Inkubationstemperatur bewirkten eine Denaturierung der Proteine und die Lösung der Agarose. Die in dem Puffer gelöste DNA wurde auf die GFX-Säule pipettiert, 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert und für 30 Sekunden bei 10.000 x g zentrifugiert. Der

Durchfluss wurde verworfen. Um noch vorhandene Salze auszuwaschen, wurden 500 µl Waschpuffer auf die Säule gegeben und nochmals bei 10.000 x g für 30 Sekunden zentrifu-giert. Anschließend wurde die Säule in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit 35 µl dest. H2O, das in diesem Fall als Elutionspuffer diente, benetzt. Nach einer Einwirkzeit von 1 Minute bei Raumtemperatur wurde die Säule erneut bei 10.000 x g für 1 Minute zentrifu-giert. Der Durchfluss beinhaltete die eluierte DNA.

3.2.12 Aufreinigung von DNA aus Lösungen

Das GFX PCR DNA and Gel Purification Kit der Firma Amersham Biosciences^ wurde auch für die Aufreinigung von DNA aus Lösungen verwendet. Hier wurden 500 µl Capture Buffer auf die Säule vorgelegt und ein maximales Volumen von 100 µl sich in Lösung befind-licher DNA hinzupipettiert. Durch mehrmaliges Aufziehen mit einer Pipette wurden die Lö-sungen gemischt und anschließend bei 10.000 x g für 30 Sekunden zentrifugiert. Die Eluation der DNA erfolgte in gleicher Weise wie bei der Aufreinigung von DNA aus einem Agarose-gel.

3.2.13 Verwendung von T4-Polymerase

Bei den Klonierungsarbeiten mussten häufig nichtkompatible Enden des Vektors und des In-serts verändert werden, um deren Verbindung zu erreichen. Lag nach einem Restriktionsver-dau ein 3`-Überhang vor, so konnte dieser Überhang durch die 3`-5`Exonucleasetätigkeit der

Bei den Klonierungsarbeiten mussten häufig nichtkompatible Enden des Vektors und des In-serts verändert werden, um deren Verbindung zu erreichen. Lag nach einem Restriktionsver-dau ein 3`-Überhang vor, so konnte dieser Überhang durch die 3`-5`Exonucleasetätigkeit der

Im Dokument Nitratassimilation bei Mykobakterien (Seite 59-73)