Klonierungsarbeiten zur Einengung des komplementierenden Bereiches

ent-sprechende Bereich von ungefähr 40000bp soweit eingegrenzt, dass das mutierte Gen be-stimmt werden konnte.

Da die Sequenz von M. smegmatis bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig vorlag, wurden zunächst unterschiedliche Restriktionsverdaue der Cosmide mit den Enzymen AccIII, HindIII, KpnI und PvuII durchgeführt. Abbildung 20 zeigt stellvertretend eines der vier Aga-rosegele. Bei der Auswertung wurde darauf geachtet, welche der auftretenden Banden im Agarosegel bei allen fünf Cosmiden vorhanden war. Diese Überlegung basierte auf der Grundlage, dass alle fünf Cosmide in der Lage waren, die Mutante #4376 gleichermaßen zu komplementieren. Deshalb musste bei allen ein identischer Genbereich vorliegen, der sich in einer gleichgroßen Bande bei der Gelelektrophorese darstellen musste. Da der Verdau mit HindIII kein eindeutiges Ergebnis lieferte, wurde mit dem KpnI- und AccIII-Restriktionsverdau weitergearbeitet. Bei dem KpnI-AccIII-Restriktionsverdau zeigte sich eine über-einstimmende Bande mit einer Größe von ungefähr 4000bp. Bei dem AccIII-Verdau lag eine gemeinsame Bande von 3500bp vor.

Abbildung 20 Restriktionsverdau der M. smegmatis –Cosmide pIW36-40 mit dem Enzym KpnI

Diese beiden Banden wurden bei jeweils einem der Cosmide (pIW36 bzw. pIW37) ausge-schnitten und mit dem Vektor pMV306 kan. ligiert. Das Konstrukt mit dem KpnI-Fragment bekam die Bezeichnung pSS8, das Konstrukt mit dem AccIII-Fragment die Bezeichnung pSS22.

4.3.3.1 Klonierungsarbeiten mit dem KpnI-Fragment (pSS8)

Durch die Herstellung von pSS8 wurde der komplementierende Bereich von ungefähr 40000bp auf 4298bp reduziert. Um das entsprechende Gen näher einzugrenzen, mussten noch weitere Klonierungsarbeiten durchgeführt werden. Inzwischen war die Sequenz von M.

smegmatis zwar noch nicht publiziert, die Rohsequenz war im Internet (www.tigr.org) jedoch verfügbar.

Abbildung 21: Insert pSS8

1. Schritt: Zunächst wurde eine Sequenzierung (Primer SS7/SS8) durchgeführt, die eine zu 100% homologe Sequenz zu der von M. smegmatis ergab. Abbildung 21 zeigt eine Restrikti-onskarte der so erhaltenen Sequenz des 4298bp großen KpnI-Fragmentes.

Bei der genaueren Untersuchung der Sequenz wurde ein 2537bp großer Open Reading Frame gefunden. Bei einem Alignment mittels Computerprogramm „Advanced Blast Search“ der NCBI wurde überraschenderweise eine über 80%ige Homologie zu der NirB-Sequenz von M.

tuberculosis gefunden (vollständiges Alignment im Anhang aufgeführt, siehe Kapitel 9.1).

Die Größe des nirB-Gens von M. tuberculosis beträgt 2493bp. Wie in den Abbildungen 23 und 24 zu sehen ist, enthielt das AccIII-Fragment den gesamten ORF, während bei dem KpnI-Fragment Teile fehlten.

2. Schritt: Nachdem nun die benötigte Sequenz vorlag, konnte eine gezielte Deletion in das Konstrukt pSS8 gesetzt werden. Durch ein BsaAI-Restriktionsverdau wurde ein 779bp großes Fragment entnommen, und das übrige Konstrukt religiert. Es erhielt die Bezeichnung pSS10.

Das 779bp große Fragment wurde über die EcoRV-Site mit dem Vektor pMV306 kan. ligiert und als pSS9 bezeichnet. Beide Konstrukte wurden in die Mutante #4376 transformiert. Bei der phänotypischen Überprüfung zeigte sich, dass das Konstrukt pSS10 im Gegensatz zum Konstrukt pSS9 die Mutante komplementieren konnte.

Abbildung 22: Darstellung der möglichen komplementierenden Bereiche von pSS8

Die Tatsache, dass pSS9 die Mutante nicht komplementierte, ließ zwei mögliche Bereiche entstehen, die für die Komplementierung verantwortlich sein konnten. In Abbildung 22 sind diese Bereiche grau hinterlegt und als Bereich 1 und Bereich 2 deklariert.

3. Schritt: Welcher der beiden Squenzbereiche tatsächlich für die Komplementierung verant-wortlich war, sollte mit dem folgenden Klonierungsschritt festgestellt werden. Durch einen Doppelverdau des Plasmids pSS10 mit den Enzymen EcoRI (Restriktionsstelle liegt im Vek-tor direkt im Anschluss an die KpnI-Restriktionsstelle und ist deshalb in Abbildung 24 nicht dargestellt) und XmnI konnte eine große Deletion in dem Bereich 1 gesetzt werden. Nach Ausschneiden der EcoRI/XmnI-Bande und anschließender Religation entstand das als pSS20 bezeichnete Konstrukt. Die phänotypische Überprüfung zeigte, dass das Konstrukt pSS20 die Mutante #4376 komplementieren konnte. Somit wurde bewiesen, dass der in Abbildung 22 dargestellte Bereich 2 für die Komplementierung verantwortlich war.

4.3.3.2 Klonierungsarbeiten mit dem AccIII-Fragment (pSS22)

Durch die Sequenzierung wurde gezeigt, dass bei dem Plasmid pSS22 der gesamte Open Reading Frame vorlag. Aus den Klonierungsarbeiten des KpnI-Fragmentes ging hervor, dass der Teil des ORF, der zwischen der KpnI- und der AccIII-Restriktionsstelle liegt, für die Komplementierung nicht benötigt wurde, da dieser Genomabschnitt nicht in den Konstrukten pSS8, pSS10 und pSS20 enthalten war (siehe auch 23). Deshalb konnte für die folgenden Klonierungsschritte das kleinste noch komplementierende Konstrukt pSS20 aus den vorange-gangenen KpnI-Klonierungsarbeiten verwendet werden.

Abbildung 23: Insert pSS22

1. Schritt: pSS20 wurde verwendet, um durch einen Doppelverdau mit den Enzymen Bsa-AI/HpaI den in Abbildung 22 mit Bereich 1 gekennzeichneten Sequenzabschnitt komplett zu entfernen. Die HpaI-Site liegt im Vektor direkt neben der XmnI-Site und ist deshalb in Abbil-dung 24 nicht aufgeführt. Durch Religation entstand das Plasmid pSS21. Mittels Elektropora-tion wurde das Plasmid in die Mutante #4376 transformiert und phänotypisch auf Wachstum auf Nitrat als alleinige Stickstoffquelle untersucht. Auch dieses Konstrukt befähigte die Mut-ante, wieder auf Nitrat als alleinige Stickstoffquelle zu wachsen. Somit war bewiesen, dass der Bereich 1 nicht verantwortlich für die Nitratassimilation war.

2. Schritt: Im nachfolgenden Klonierungsschritt wurde pSS21 dazu verwendet, den Bereich 2 (siehe Abbildung 22) weiter einzugrenzen. Durch Anwendung eines PvuII/KpnI-Verdaus wurde ein 251bp großes Sequenzstück ausgeschnitten. Mittels Religation wurde das Plasmid pSS24 hergestellt und in die Mutante #4376 transformiert.

Abbildung 24: Übersicht der komplementierenden Konstrukte der Mutante #4376 (ohne Darstellung des Vektoranteils)

3. Schritt: Im letzten Abschnitt der Untersuchungen wurde der Bereich 2 noch weiter ver-kürzt. Hierzu wurde wieder das Plasmid pSS20 verwendet. Durch den Einsatz des Enzyms SacII wurde ein 1384bp großes Fragment über die SacII-Restriktionsstelle in den Vektor pMV306 kan. kloniert. pSS25 bildete das Ergebnis dieser Klonierung.

Ein weiterer Verdau von pSS20 sollte den Bereich 2 bis zur FseI-Restriktionsstelle verkürzen.

Es wurden die Enzyme FseI und HpaI verwendet. HpaI gehört zur Multiple-Cloning-Site des

Vektors und liegt unmittelbar neben der KpnI-Restriktionsstelle. Durch diesen Verdau wurde das zu untersuchende Fragment auf 815bp eingegrenzt. Das durch Religation entstandene Plasmid wurde als pSS23 bezeichnet.

4.3.3.3 Phänotypische Untersuchung der erstellten Konstrukte

Alle erstellten Konstrukte wurden durch Anwendung einer Elektroporation in die Mutante

#4376 transformiert und danach auf Wachstum mit Nitrat als alleinige Stickstoffquelle unter-sucht. Als Kontrollplatten wurden MB- und 7H10-Nährböden verwendet.

Es zeigte sich, dass die Konstrukte pSS8, pSS10 und pSS20, die aus den KpnI-Klonierungsarbeiten entstanden waren, die Mutante #4376 komplementieren konnten. Auf den Nährböden mit Nitrat als alleinige Stickstoffquelle zeigten sie starkes Wachstum. Nur das Konstrukt pSS9 konnte die Mutante #4376 nicht komplementieren, so dass lediglich Hinter-grundwachstum zu verzeichnen war (siehe auch Abbildung 25).

Abbildung 25: Komplementierung der Mutante #4376 mit den Konstrukten pSS8-10 und pSS20

Die Konstrukte, die durch Klonierungen des AccIII-Fragmentes entstanden sind, wurden ebenfalls phänotypisch untersucht. Komplementierende Eigenschaften wurden bei den Kon-strukten pSS22, pSS21 und pSS24 festgestellt. Die Konstrukte pSS23 und pSS25 konnten die Mutante #4376 nicht komplementieren, so dass auf den nitrathaltigen Nährböden kein Wachs-tum zu sehen war (siehe auch Abbildung 26).

Abbildung 26: Komplementierung der Mutante #4376 mit den Konstrukten pSS21, pSS23-25

4.3.4 Komplementationsversuche der Mutante #4376 mit der Nitritreduktase