2.1 Verwendete Materialien
Reagenzien, Labor- und Verbrauchsmaterial
Tabelle 3: Verwendete Reagenzien, Labor- und Verbrauchsmaterial mit Name und Hersteller
Material/Reagenzien Hersteller
Agarose Firma Carl Roth, Karlsruhe
AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen, Hilden Aqua ad iniectabilia Braun, Melsungen
-Mercaptoethanol Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim 100-bp-Ladder Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA BigDye Terminator v3.1 Cycle
Sequencing Kit
Applied Biosystems, Darmstadt Blue Juice Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA Desoxynucleoside Triphosphate Set
dNTP (dATP, dTTP, dGPT, dCPT)
Roche Diagnostics, Mannheim
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
DyeEx 96 Kit Qiagen, Hilden
Ethanol (70 % / 100 %) Sigma Aldrich, Seelze Ethidiumbromidlösung Firma Carl Roth, Karlsruhe
Erlenmeyerkolben 500ml VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA Ficoll Seperating Solution Seromed, Biochrom, Berlin
Formamid (HI-DI) Applied Biosystems, Darmstadt Handschuhe Micro Touch Größe S Ansell GmbH, München
Iso-Septol Flächendesinfektionsmittel Universität Ulm – Klinikum Apotheke
Magnetrührstäbchen VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA Metallwannen für Ethidiumbromid VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA MicroAmp Clear Adhesive Film Applied Biosystems, Darmstadt
MicroAmp Optical 8-Cap Strip Applied Biosystems, Darmstadt MicroAmp Optical 8-Tube Strip (0,2 ml) Applied Biosystems, Darmstadt MicroAmp Optical 96-Well Reaction
Plate
Applied Biosystems, Darmstadt MicroAmp Reaction Tube with Cap (0,2
ml)
Applied Biosystems, Darmstadt
Orange G, Ladepuffer Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA PCR Purification Kit QIAquick 96 Qiagen, Hilden
Platinum® Taq DNA Polymerase Invitrogen, Carlsbad Pipettenspitzen:
- ohne Filter: Unitips (10 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl)
High tech lab, Warschau, Polen
- mit Filter: ART Pipette Tips (10 Reach, 20 P, 100 E, 200, 1000)
Molecular Bio Products, San Diego, USA Primer: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
36
Thermo Fisher Scientific GmbH, Waltham, Massachusetts
5 x Sequencing Buffer Applied Biosystems, Darmstadt RLT Puffer Plus, AllPrep DNA/RNA-Kit Qiagen, Hilden
Safe Lock Tubes (0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml) Eppendorf, Hamburg Shredder-Säule QIAshredder spin
column
Qiagen, Hilden
TE-Puffer Eigene Herstellung
Geräteliste
Tabelle 4: Geräteliste mit Beschreibung und Hersteller
Gerät Hersteller
Digitalgraphicprinter UP-D895HD Syngene, Cambridge, UK
Drucker HP Laserjet 1300 Hewlett-Packard, Palo Alto, Kalifornien Einkanalpipette 0,1-2,5 µl Eppendorf, Hamburg
Einkanalpipette 0,5-10 µl Eppendorf, Hamburg Einkanalpipette 2-20 µl Eppendorf, Hamburg Einkanalpipette 10-100 µl Eppendorf, Hamburg Einkanalpipette 20-200 µl Eppendorf, Hamburg Einkanalpipette 100-1000 µl Eppendorf, Hamburg
Eismaschine AF 100 Scotsman, Pogliano Milanese, Milan, Italy Electrophoresis Power Supply 301 Amersham Pharmacia Biotech, München Elektrophoresekammern mit
Schlitten, Schiene, Kabeln und Kämmen: OWL Separation System
Thermo Fischer Scientific GmbH, Waltham, Massachusetts
Feinanalysewaage Precisa Häberle Labor-Technik, Lonsee-Ettlenschieß Gefrierschrank GS3702-G Liebherr, Biberach an der Riss
Geldokumentationssystem Gene Genius
Syngene, Cambridge, UK Handdispenser Multistep-Pipette Eppendorf, Hamburg Kühl-Gefrier-Kombination Bosch, Gerlingen Magnetrührer Combimag Ret IKA-Werke, Staufen Mehrkanalpipette 8-Kanal-Pipette
10-100 µl Eppendorf, Hamburg
Microwellengerät Microwell Bosch, Gerlingen
Multifuge 4KR Heraeus Firma Carl Roth, Karlsruhe
Bio Photometer Eppendorf, Hamburg
Sequenziergerät 3500D x Genetic
Analyzer Applied Biosystems, Darmstadt
Thermocycler: PCR System GeneAmp2700, PCR System Gene Amp 2720
Applied Biosystems, Darmstadt
Thermomixer 5437 Eppendorf, Hamburg
Tiefkühl-Gewebe-Schrank Liebherr, Biberach an der Riss
Tischzentrifuge Galaxy Mini VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA Transilluminator 4000 Stratagene, La Jolla, California
Vakuumpumpe Laboport KNF Neuberger, Freiburg
Vortexer VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA
Wasserbad W160 Heraeus, Hanau
2.2 Patientenkollektiv
Das untersuchte Patientenkollektiv (Alter > 18 ≤ 60 Jahre) setzte sich aus 1180 jüngeren Patienten einer großen multizentrischen randomisierten Studie zusammen: AMLSG 07-04. Der Rekrutierungszeitraum der Patienten lag zwischen 2004 und 2011. Von jedem Patienten wurde bei Studieneinschluss KM und/oder PB gewonnen und von den teilnehmenden Zentren an die zentralen Referenzlabore der AMLSG Ulm und Hannover geschickt. Diese führten die Extraktion der leukämischen Zellen sowie die Isolierung der DNA durch. Im AMLSG Labor für zytogenetische und molekulargenetische Diagnostik wurde nach den Richtlinien des internationalen Systems für zytogenetische Nomenklatur (ISCN) die Bestimmung der Karyotypen durchgeführt.
Von allen Patienten lag eine schriftliche Einverständniserklärung gemäß der Helsinki-Deklaration nach Aufklärung über die Art der Studien vor, welche sowohl für die Behandlung, als auch für die Aufbewahrung der Proben und deren weitere Verwendung galt. Das Studienprotokoll war durch die zuständige Ethikkommission aus Ulm (Aktenzeichen 108/2004) genehmigt und bei ClinicalTrials.gov registriert worden.
Die Induktionstherapie der Patienten enthielt zwei Zyklen mit Cytarabin, Etoposid und Idarubicin: Cytarabin 100 mg/m² intravenös an Tag 1 - 7, Etoposid 100 mg/m² an Tag 1 - 3 und Idarubicin 12 mg/m² an Tag 1, 3 und 5 (im zweiten Zyklus auf die Tage 1 und 3 reduziert). Die Patienten der Hochrisiko-Gruppe erhielten zur Konsolidierungstherapie eine allogene HSCT von einem passenden verwandten oder nicht verwandten Spender. Die anderen Patienten bekamen drei Zyklen Hochdosis-Cytarabin (18 g/m² pro Zyklus). ATRA wurde während der Induktionstherapie in einer Dosierung mit 45 mg/m² an Tag 6 bis 8 und mit 15 mg/m² von Tag 9 bis 21 verabreicht. Während der Hochdosis-Cytarabin-Gabe erhielten die
Spender wurde eine allogene HSCT bei allen Patienten, außer derer mit einer Core-binding factor AML, durchgeführt.
2.3 Übersicht der erfolgten Methoden
Abbildung 3: Eigene Darstellung der durchgeführten Methoden im zeitlichen Ablauf als Überblick, DNA: deoxyribonucleic acid; PCR = polymerase chain reaction, CSR = cycle sequencing reaction
2.4 Materialgewinnung und -aufbereitung
Das Material wurde entweder aus PB mittels Venenpunktion und/oder aus KM mittels Beckenkammpunktion gewonnen. Direkt nach der Materialentnahme erfolgte die Heparinisierung (Natrium-Heparin) der Proben im Verhältnis 1:10. Zur Gewinnung mononukleärer Zellen wurde das Prinzip der Dichtegradientenzentrifugation nach Ficoll durchgeführt. Zunächst wurde hierzu
Material mit hohen Leukozytenzahlen im Verhältnis von 1:2 bis 1:3 mit Kulturmedium verdünnt. Im Anschluss wurden PB bzw. KM im Verhältnis 1:2 auf ein Ficoll-Medium (Ficoll Separating Solution), ein synthetisch hergestelltes Polysaccharid aus Saccharose und Epichlorhydrin, geschichtet. Mit 1,077 g/ml hatte das Ficoll-Medium eine größere Dichte als Lymphozyten und Monozyten, jedoch eine kleinere als Erythrozyten und Granulozyten. Anschließend wurde alles bei 2800 U/min für 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die mononukleären Zellen, die sich nach der Zentrifugation zwischen Plasma und Ficollschicht befanden, wurden mit einer sterilen Pipette abgenommen.
Erythrozyten, Granulozyten, Thrombozyten und tote Zellen gelangten durch die Zentrifugation auf den Boden des Röhrchens. Die Zellzahl wurde nach zweimaligem Waschen mit 50 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (Zentrifugation bei 1200 U/min für 10 Minuten bei Raumtemperatur), um Ficollresten und Verunreinigungen zu entfernen, mittels Zellcounter bestimmt. Die Aufbewahrung der erhaltenen mononukleären Zellen erfolgte bis zum weiteren Gebrauch als Zellpellet mit je 5 x 105 bis 1 x 107 Zellen bei - 80 °C.
2.5 DNA-Extraktion
Die DNA-Extraktion erfolgte auf Eis mit dem AllPrep DNA/RNA Mini Kit.
Folgende Kit-Bestandteile wurden verwendet:
• AllPrep DNA Mini Spin Columns
• Collection Tubes (1,5 ml)
• Collection Tubes (2 ml)
• Buffer RLT Plus
• Buffer AW1 (concentrate)
• Buffer AW2 (concentrate)
• Buffer EB
Hierbei wurde zunächst 600 µl RLT-Puffer-Plus mit 6 µl ß-Mercaptoethanol gemischt. Ein Bestandteil des RLT-Puffers ist Guanidiniumthiocyanat, ein strukturbrechendes Salz, welches Wasserstoffbrückenbindungen zerstört. Das zugesetzte ß-Mercaptoethanol reduziert zusätzlich Disulfidbrücken. Beide haben somit in Kombination eine denaturierende und reduzierende Wirkung auf Proteine.
Die Zellpellets wurden nun durch Zugabe des zuvor hergestellten
RLT-Mercaptoethanol-Gemisches lysiert, auf eine Shredder-Säule gegeben und drei Minuten bei 4 °C und 13 000 U/min zentrifugiert. Anschließend erfolgte die Pipettierung des homogenen Lysats in die AllPrep DNA Spin Säulen und eine einminütige Zentrifugation bei 13 000 U/min, wobei die DNA in der Säule gebunden wurde. Danach wurden die Säulen in ein neues Sammeltube gestellt, 500 µl AW1-Puffer auf die Säulen pipettiert und eine Minute zentrifugiert. Das chaotrope Salz des Puffers denaturierte erneut Proteine, welche bei der anschließenden Zentrifugation ausgewaschen wurden. Der Durchfluss wurde verworfen. Die Säulen wurden nun mit 500 µl AW2-Puffer gewaschen und nochmals zwei Minuten bei 13 000 U/min zentrifugiert, wodurch es zum Ausspülen verbliebener Salze kam. Der Durchfluss wurde wiederum verworfen. Daraufhin wurden die Säulen in einem neuen Sammeltube eine Minute trocken zentrifugiert und abermals in ein neues, steriles Elutions-Tube gestellt. Nun wurde 100 µl TE-Puffer (Tris und EDTA) auf die Mitte der Säulen-Membran pipettiert ohne sie zu berühren und für drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die DNA-Säulen bei 13 000 U/min eine Minute zentrifugiert, um die DNA aus der Säule zu lösen. Zur Erfolgskontrolle wurden 2 µl DNA-Lösung mit 8 µl Aqua ad iniectabilia (B. Braun, Melsungen, Deutschland) und 2 µl Blue Juice (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) homogen gemischt und auf ein 1 %-Agarose-Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei 100 V und 400 mA für 40 min durchgeführt. Das Gel wurde nach der Auftrennung unter UV-Licht beurteilt. Außerdem wurde mit Hilfe des NanoDrops spektrophotometrisch die Konzentration der erhaltenen DNA durch Messung der Absorption A260 einer 1:10 Verdünnung (3 µl DNA mit 67 µl Aqua ad iniectabilia) bestimmt. Die DNA wurde bis zum weiteren Gebrauch bei - 20 °C eingefroren.
2.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion dient der in vitro Vermehrung bestimmter DNA-Bereiche und beinhaltet die zyklische Wiederholung von drei Schritten. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die PCR zur Amplifizierung der kodierenden Exone des TET2-Gens mit der gewonnenen DNA-Lösung der entsprechenden Patientenproben durchgeführt. Der erste Schritt der PCR ist die Denaturierung der DNA bei 95 °C, um den Doppelstrang aufzuspalten. Das Abkühlen der Probe für 30 s auf 56 °C erlaubt eine spezifische Anlagerung der Primer am 3’- bzw. 5’-Ende
des Exons. Schließlich wird durch die Platinum® Taq DNA-Polymerase, beginnend am 3'-Ende des angelagerten Primers, der ausgewählte Genabschnitt amplifiziert.
Die Temperatur wird hierbei auf 72 °C erhöht um unspezifische Hybridisierungen zu vermeiden. Dieser Vorgang wird in 30 Zyklen wiederholt, bis ausreichend Genkopien vorhanden sind. Zur Durchführung der PCR wurden äquivalente Mengen von Primer-Stocklösungen (100 pmol/µl) mit Aqua ad iniectabilia auf eine Zielkonzentration von 10 pmol/µl eingestellt. Zur Durchführung der PCR wurde das Platinum® Taq DNA Polymerase Kit der Firma Invitrogen, bestehend aus Platinum® Taq DNA Polymerase (Enzym der PCR), 10 x PCR Buffer, 50 mM Magnesium-Chlorid, verwendet. Die Platinum® Taq DNA-Polymerase diente der Replikation festgelegter Genabschnitte und ist eine rekombinante Taq-DNA-Polymerase, versetzt mit einem Antikörper, welcher die Polymerase-Aktivität bei Umgebungstemperaturen hemmt. Die eingesetzte Pufferlösung diente der Konstanthaltung des pH-Wertes und der möglichst spezifischen Primerbindung.
Das Magnesium-Chloridging Komplexe mit den dNTPs ein, war wichtig für die Aktivierung der DNA-Polymerase und Anlagerung der Primer an das Template.
Außerdem wurde das Desoxynucleoside Triphosphate Set von PCR Grade Roche verwendet, um je 25 µl von jedem dNTP (25 mmol) zu einer Lösung zu vereinen und somit die Bausteine für die neu synthetisierten Stränge der Platinum® Taq DNA Polymerase bereitzustellen.
Für 2 µl DNA-Template wurde folgender 23 µl Reaktionsansatz pipettiert:
- 18,25 µl Aqua ad iniectabilia Braun - 2,5 µl 10 x PCR Buffer
- 0,75 µl 50 mM MgCl2 - 0,25 µl dNTP`s 25 mM - 0,5 µl Forward Primer - 0,5 µl Reverse Primer
- 0,25 µl Platinum® Taq DNA-Polymerase
23 µl Reaktionsansatz wurden zusammen mit je 2 µl DNA-Template in eine Fast MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) pipettiert. Für die Negativkontrolle (NTC) wurde zusätzlich ein PCR-Ansatz ohne DNA-Template pipettiert. Nach Vortexen und
Herunterzentrifugieren erfolgte die PCR-Reaktion in einem Thermocycler (GeneAmp PCR System 2720 von Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) in nachfolgendem PCR-Programm:
95 °C 5 min
95 °C 15 s
56 °C 30 s 30 x
72 °C 1,5 min
72 °C 10 min
10 °C
Bis zur Aufreinigung des PCR-Produkts wurden die Proben bei 4 °C im Kühlschrank gelagert.
2.7 Gelelektrophorese
Zur Erfolgskontrolle der PCR-Reaktion wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt.
Hierzu musste zunächst ein 2 %-Agarosegel hergestellt werden.Für die Herstellung eines großen Gels wurden 6 g Agarose mit 330 ml TAE-Puffer (1 x 0,04 mol/l Tris-Acetat, 0,001 mol/l EDTA, pH 8,0, Lagerung bei Raumtemperatur) in einem Erlenmeyerkolben gemischt und für sechs Minuten in einer Mikrowelle bei 900 Watt erhitzt. Danach wurde die Agaroselösung für 20 Minuten auf einem magnetischen Rührblock mit Hilfe eines Rühr-Magneten gerührt, der abgekühlte Inhalt im Anschluss in einen Gelschlitten gegossen und für die benötigte Anzahl an Ausbuchtungen für die späteren Geltaschen die Kämme eingesetzt. Das Agarosegel war nach etwa einer Stunde fertig, um die Kämme zu entfernen. Bis zum weiteren Gebrauch wurde es mit Frischhaltefolie umwickelt bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. Zur Gelelektrophorese wurde von sieben zufällig ausgewählten Stichproben der Platte je 5 µl DNA-Template zusammen mit 4 µl Ladepuffer (0,06 g Orange G von Sigma Aldrich, St. Louis Missouri, USA, 30 ml Glycerol, 70 ml destilliertes Wasser) vermischt und das 2 %-Agarose-Gel damit beladen. Ebenso wurden die NTC zu den jeweiligen Primern aufgetragen. Als Größenstandard wurde ein 100 bp-ladder (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) verwendet. Nach 45-minütiger Gelelektrophorese bei 140 V in einer mit 1 x TAE
Puffer befüllten Elektrophoresekammer wurde das Gel zum Färben für 20 min ins Ethidiumbromid-Bad (200 µl 1 %-Ethidiumbromid-Lösung von Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland, in 4 l destilliertem Wasser) gelegt um die Banden sichtbar zu machen. Ethidiumbromid ist ein planares Molekül aus vier Ringen, das sich zwischen benachbarte DNA-Basenpaare einlagert und unter UV-Licht fluoresziert.
Zum Entfernen des überschüssigen Ethidiumbromids erfolgte ein kurzes Bad in destilliertem Wasser. Im Anschluss konnten die Banden unter UV-Licht mit Hilfe des UV-Transluminator-Systems dargestellt und dokumentiert werden.
Abbildung 4: Beispielbild einer ausgewerteten Gelelektrophorese. M = DNA Marker, Zahlen = Probenidentifikationsbezeichnung Exon 11 (Probe 1-15), NTC = Negative Template Control
Wenn die PCR-Reaktion erfolgreich war, konnte man das PCR-Produkt an der entsprechenden Position auf dem Gel erkennen und die übrigen 20 µl der Probe weiterverwenden. War in einer NTC eine Bande zu sehen, deutete dies auf eine Verunreinigung des Reaktionsansatzes und die PCR musste wiederholt werden.
2.8 Aufreinigung des PCR-Produktes
Nach der Produktkontrolle wurde das Produkt mittels des QIAqick 96 PCR-Purification-Kits und einer Vakuummaschine aufgereinigt.
Bestandteile des Kits:
• 96-well Plate
• Collection Microtubes
• PM-Puffer
• PE-Puffer
• EB-Puffer
Durch die Verwendung verschiedener Puffer konnte der jeweils benötigte pH-Wert und die Salzkonzentration erreicht werden, um die DNA im Verlauf der Aufreinigung erst an die Säulchen zu binden und im Anschluss wieder zu lösen. Das PCR Produkt wurde im ersten Schritt im Verhältnis 1:3 mit je 75 µl PM-Puffer vermischt und auf die Säulchenplatte pipettiert. Dadurch wurde die Bindung des PCR-Produkts in der stationären Phase der Säule erreicht. Anschließend wurde für zwei Minuten ein Vakuum mit einem negativen Druck zwischen -75 und -450 mmHg angelegt, bis der Puffer, ungebundene Primer und andere Verunreinigungen als Durchfluss abgetropft waren. Nun konnte zuvor mit 96 - 100 % Ethanol versehener PE-Waschpuffer mit einer Menge von 750 µl über die Säulen gegeben werden. Diesmal wurde ein Vakuum von über 10 min angelegt, um die gesamte Pufferlösung und alle weiteren Überreste gut aus den Säulen zu lösen. Als weitere Maßnahme wurde die Säulchenplatte danach noch auf Zellstoff ausgeklopft bis keine Tropfen mehr sichtbar waren. Im letzten Schritt wurde die weiterhin in den Säulchen gebundene DNA mit 40 µl basischen EB-Puffer, der auf die Mitte jeder Säule pipettiert wurde, gelöst und auf einer VWR Platte in der Zentrifuge bei 3800 U/min für sechs Minuten zentrifugiert. Das sich nun in der VWR-Platte befindliche, aufgereinigte PCR-Produkt wurde nun bei - 20 °C bis zur weiteren Verarbeitung eingefroren.
2.9 Cycle Sequencing Reaction (CSR)
Prinzip der CSR
Bei der CSR handelt es sich um eine Modifikation der traditionellen Sanger-Sequenziermethode mit vor dem eigentlichen Sequenzierungsschritt stattfindender linearer PCR-Amplifikation. Es wird jedoch im Gegensatz zur klassischen PCR nur ein Primer verwendet (entweder in forward- oder in reverse-Richtung), dieser bindet an das 3’-Ende der Einzelstrang-DNA, und die Polymerase synthetisiert den komplementären DNA-Strang. Der Reaktionsansatz beinhaltete zusätzlich hitzebeständige DNA-Polymerase, vier Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP) und die 2’,3’-Didesoxyribonucleosidtriphosphate (ddNTP) der vier Basen, welche abhängig von ihrem Nukleosid mit vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert waren. Der Primer setzte zunächst an den komplementären DNA-Strang an, welcher durch die DNA-Polymerase im Anschluss verlängert wurde. Die Polymerase baute so nach dem Zufallsprinzip ddNTPs statt dNTPs ein, was zum
Kettenabbruch führte, da an einem Didesoxynukleosid kein freies 3’-OH für die weitere Polymerisation zur Verfügung stand. So entstand nach erfolgter CSR eine Vielzahl unterschiedlich langer DNA-Fragmente mit unterschiedlichen Längen und floureszenzmarkierten Enden. Die Basensequenz des zu untersuchenden Genabschnittes konnte nach elektrophoretischer Auftrennung auf diese Weise mittels späterer Sequenzierung bestimmt werden.
Reaktionsansatz, Ablauf und CSR-Programm
Für die CSR wurden den PCR-Primern zugeordnete Sequenzierungs-Primer verwendet, welche im Verhältnis 1:10 mit Aqua ad iniectabilia zu einer Verdünnung mit 10 pmol/µl vermengt wurden. Weiterhin wurde zum Reaktionsansatz Big Dye 3.1, welcher aus den floureszierenden Enden, den DNTPs und dDNTPs sowie der DNA-Polymerase bestand, pipettiert. Aufgrund der Wärme- und Lichtinstabilität wurde dies auf Eis durchgeführt und der Big Dye 3.1 lichtgeschützt bei -20 °C gelagert. Zur Stabilisierung des pH-Werts während der CSR wurde 5 x Sequencing Buffer dazugegeben. Alle Reagenzien wurden nach dem Mastermix-Protokoll vermengt und je 14 µl Mastermix sowie 1 µl des aufgereinigten PCR-Produktes in die Tubes einer MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate pipettiert.
Nach anschließender Zentrifugation erfolgte das CSR-Programm im Thermocycler:
96 °C 2 min
95 °C 15 s
55 °C 1 min 30 x
60 °C 3 min
4 °C 10 min
4 °C
Bis zur weiteren Aufreinigung wurde das CSR-Produkt lichtgeschützt im Kühlschrank bei - 4 °C gelagert.
2.10 Aufreinigung des CSR-Produktes
Die DNA-Aufreinigung des CSR-Produktes beruht auf dem Prinzip der Gelchromatographie. Die Reagenzien wurden allein nach ihrer Molekülmasse getrennt, indem die kleinen Einzelmoleküle des Big-Dye tief in die Poren des Gels diffundierten und die größeren DNA-Fragmente das Gel passierten und im Durchfluss aufgefangen wurden. So konnten die nicht in die DNA-Stränge eingebaute ddNTPs entfernt werden. Zu den Bestandteilen des verwendeten DyeEx 96 Kits von Qiagen gehörten DyeEx 96 Plates (Aufreinigungsplatten) sowie Collection Plates (Auffangplatten). Zu Beginn wurde die DyeEx 96 Plate bei 3000 U/min für drei Minuten über einer Auffangplatte in einer Multifuge 4KR Heraeus zentrifugiert und der Überstand verworfen. Für die nachfolgende Sequenzierung wurde in eine Optical 96-Well Reaction Plate in jedes Well 5 µl Formamid pipettiert, bzw 15 µl Formamid, falls die Tubes für die folgende Sequenzierung nicht mit DNA gefüllt werden. Mit Hilfe einer 8-fach Multipipette wurden 15 µl der zuvor hergestellten CSR-Produkte vorsichtig in die Mitte des Gelbetts pipettiert und im Anschluss erneut für 3 Minuten bei gleichbleibenden Bedingungen zentrifugiert. Das aufgereinigte CSR-Produkt wurde nun bis zu seiner weiteren Verwendung bei - 20 °C aufbewahrt.
2.11 Sequenzierung und Auswertung der Sequenzen
Die eigentliche Sequenzierung zur Bestimmung der Basenabfolge der amplifizierten DNA-Abschnitte wurde mit Hilfe eines automatischen Sequenziergerätes (3500 Dx Genetic Analyzer von Applied Biosystems Deutschland GmbH) durchgeführt. Dieses funktionierte auf dem Prinzip der Kapillargelektrophorese. In einer mit Polymer gefüllten Glaskapillare wurden die nach einer Hitze-Denaturierung mittels CSR synthetisierten, unterschiedlich langen DNA-Einzelstränge elektrophoretisch aufgetrennt und passierten bei diesem Vorgang einen Fluoreszenzdetektor direkt in der Kapillare. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes wanderten die Oligonukleotide auf ihrem Weg von der Anode zur Kathode an einem Argon-Ionen-Laserstrahl vorbei, der die jeweiligen Farbstoffmoleküle der markierten ddNTPs anregte. Die ausgestrahlten Fluoreszenz-Signale wurden über eine Charge-Coupled-Device-Kamera detektiert und die ermittelten Rohdaten mit
einem internen Längenstandard abgeglichen. Mit Hilfe einer Sequenzanalysesoftware konnten die Daten in eine lesbare, graphische Darstellung konvertiert werden. Jeder Fluoreszenzfarbstoff spiegelte ein ganz bestimmtes Nukleotid wider, sodass man die entstehenden Fluoreszenz-Peaks als Basenfolge des betreffenden Exons von TET2 zuordnen konnte. Adenin ist grün, Cytosin blau, Thymin rot, Guanin schwarz. Auf diese Weise können Veränderungen der Sequenz wie Punktmutationen, Insertionen und Deletionen detektiert werden.
Einzelnukleotidpolymorphismen, auch als Snips bezeichnet, sind vererbbare genetische Varianten, die auch in gesunden Patienten gefunden werden und in unserer Analyse nicht zu den Mutationen gezählt wurden.
Abbildung 5: Ausgewählter Abschnitt einer TET2 (Ten-Eleven-Translocation oncogene family member 2) Wildtypsequenz aus Exon 11, A = Adenin (grün), C = Cytosin (blau), G = Guanin (schwarz), T = Thymin (rot)
Abbildung 6: Beispiel eines Einzelnukleotidpolymorphismus (Snip) in Exon 11, markiert durch den schwarzen Pfeil
Die Auswertung der Sequenzen erfolgte am Computer mit Hilfe des DNA Star Lasergene Seq Man Pro Programms, Software Suite for Sequence Analysis. Die übertragenen Gensequenzen wurden alle einzeln im Vergleich zu einer Originalsequenz von TET2 nach Mutationen durchgesehen und diese auf genetischer Ebene sowie auf Proteinebene genau lokalisiert. Eine Codesonne
wurde als Grundlage für die Analyse des Effektes auf die Aminosäuren benutzt und somit die Mutation benannt.
2.12 Statistische Auswertung
Da es sich schwerpunktmäßig um eine experimentelle Dissertationsarbeit handelte, wurde die statistische Analyse der Ergebnisse sowie deren Korrelation mit klinischen bzw. genetischen Daten im Anschluss durch die Studienzentrale der
Da es sich schwerpunktmäßig um eine experimentelle Dissertationsarbeit handelte, wurde die statistische Analyse der Ergebnisse sowie deren Korrelation mit klinischen bzw. genetischen Daten im Anschluss durch die Studienzentrale der