Die Bedeutung von molekularen Markern in der AML

Die weitreichenden molekulargenetischen Forschungsergebnisse der letzten Jahre haben zu einem verbesserten pathophysiologischen Verständnis verschiedener Subgruppen der AML sowie der Möglichkeit einer spezifischen zielgerichteten Therapie geführt. Diese Daten zeigen auch, dass bei der AML verschiedene genetischen Veränderungen in der Leukämogenese kooperieren. [30, 38] Die molekulargenetischen Marker wurden zunächst in Abhängigkeit ihrer Funktion zwei verschiedenen Mutationsgruppen zugeordnet: Zur ersten Gruppe (Klasse I) gehören Mutationen, die Signaltransduktionswege aktivieren, was zu einem gesteigertem Wachstum oder einer besseren Überlebensrate von malignen Zellen führt. Hierzu zählen beispielsweise Mutationen, die zu einer Aktivierung des RAS (rat sarcoma viral oncogen homolog)-Signaltransduktionsweges oder der Rezeptor-Tyrosinkinase FLT3 führen. Zur zweiten Mutationsgruppe (Klasse 2) gehören Mutationen von Transkriptionsfaktoren oder von Komponenten des Transkriptions-Co-Aktivierungs-Komplexes, welche eine gestörte Ausdifferenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen zur Folge haben.

Bekannte Beispiele sind Mutationen in CEBP- , MLL (Myeloid/lymphoid oder mixed lineage leukemia) sowie CBF-ß und RUNX1/AML1, welche für die zwei Komponenten des heterodimeren Core-binding-factor kodieren. [21, 30]

In den letzten Jahren konnten durch die Anwendung neuer molekulargenetischer Methoden, wie dem whole genome sequencingweitere Genmutationen in der AML detektiert werden, die vor allem die epigenetische Regulation beeinflussen. Zu diesen molekularen Markern gehören TET2 (Ten-Eleven-Translocation oncogene family member 2), IDH1/2 (Isocitratdehydrogenase 1/2) oder DNMT3A (DNA(cytosine-5)-methyltransferase 3A), welchen man prognostische Bedeutung zuschreibt. [90] Nicht nur die Entdeckung neuer, für die AML prognostisch

bedeutender Marker, sondern vor allem die Interaktion dieser Marker miteinander, stellt eine wichtige Frage neuer Forschungsarbeiten dar. Man ging lange Zeit davon aus, dass die meisten Genmutationen Vorgänge wie die Proliferation, Differenzierung und Selbsterneuerung hämatopoetischer Zellen beeinträchtigen.

Aktuelle Forschungsprojekte konnten jedoch durch die Entdeckung weiterer Genmutationen, die an anderen zellulären Mechanismen wie DNA-Splicing oder -Reparatur beteiligt sind, neue funktionelle Gruppen von Genen definieren, die wie folgt eingeteilt wurden: Gene der Signaltransduktion (59 %), DNA-Methylierung (44 %), Chromatin-modifizierende Gene (30 %), NPM1 (27 %), myeloische Transkriptionsfaktoren (22 %), Fusionsgene von Transkriptionsfaktoren (18 %), Tumorsuppressorgene (16 %), Gene des Spliceosomen-Komplexes (14 %) und Gene des Cohesin-Komplexes (13 %). [13, 29]

Abbildung 1: Übersicht der neun funktionellen Gruppen mutierter Gene des Cancer Genome Atlas Research Network; NPM1 = Nucleophosmin 1; eigene Abbildung [13]

Erst kürzlich erschien eine Studie der Deutsch-Österreichischen Acute Myeloid Leukemia Study Group (AMLSG), die ebenfalls zur Reevaluierung der bisherigen genetischen Klassifizierung veranlasst. In dieser wurden 111 Gene von 1540 AML-Patienten (18 - 84 Jahre) aus drei prospektiven multizentrischen klinischen Studien mittels eines targeted sequencing Ansatzes analysiert. Die Ergebnisse wurden anschließend bezüglich des Ansprechens auf Chemotherapie und der

59 %

Überlebensrate verglichen. Insgesamt konnten 5234 Driver-Mutationen sowie komplexe Co-Mutationen identifiziert werden, aufgrund derer 11 AML-Unterformen definiert wurden, deren Prognose sich erheblich unterscheidet. Neben den bereits vorhandenen Subgruppen, welche auch in der WHO aufgelistet sind, konnten drei weitere Subgruppen identifiziert werden: die Chromatin-Spliceosomen-Gruppe, welche mit 18 % die zweitgrößte Untergruppe der untersuchten AML-Patienten darstellt, TP53-Aneuploidie mit 13 % und IDH2^R172-Mutationen mit 1 %. Diese Mutationen unterscheiden sich von anderen IDH^mut bezüglich Genexpression und DNA-Methylierung und führen zu schwereren Aberrationen. [85]

Beispiele molekularer Marker 1.3.1.1 CEBP- -Mutationen

Das CEBP- Gen ist lokalisiert auf Chromosom 19q13.1 und codiert für ein Protein aus der Familie der CCAAT/enhancer binding protein family, welches als Transkriptionsfaktor agiert. [101] CEBP- wird in einigen Geweben, wie myeloischen Zellen, vermehrt exprimiert und reguliert so die Aktivität verschiedener Wachstumsfaktorrezeptoren. CEBP- gehört deshalb zu einer der wichtigsten Transkriptionsfaktoren der Hämatopoese. [110, 119] CEBP- ^mut findet man in ca. 5 - 14 % aller AML-Patienten, diese werden in zwei Hauptformen aufgeteilt:

Durch N-terminale frameshift-Mutationen kommt es zu einer verkürzten CEBP -Isoform, die eine hemmende Wirkung auf die myeloische Ausreifung hat. Bei der zweiten Gruppe führen C-terminale in-frame-Mutationen zu einer reduzierten DNA-Bindungsfähigkeit und gestörten Dimerisierung von CEBP- -Formen. [30, 56]

Beide Formen kommen bei AML Patienten mit CEBP- ^mut interessanterweise oft gleichzeitig vor. Diese biallelischen Mutationen werden, im Gegensatz zu monoallelischen CEBP- ^mut, in vielen Studien mit einer günstigen Prognose in Verbindung gebracht. Die Prognose von Patienten mit monoallelischen CEBP- ^mut hängt von dem Vorhandensein weiterer konkurrierender Mutationen ab, die in dieser Gruppe vermehrt vorkommen. [83, 110] Seit 2008 ist die AML mit Mutationen im CEBP- Gen als vorläufige Entität Bestandteil der WHO-Klassifikation, in der aktuellen Version von 2016 wurde diese durch die AML mit biallelischen Mutationen von CEBP- als eigenständige Entität ergänzt. [3, 25]

1.3.1.2 FLT3-Mutationen

FLT3 gehört zu den Klasse-III-Rezeptortyrosinkinasen und wird vor allem in hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert, wo seine Liganden eine wichtige Rolle für die Proliferation, dem Überleben und der Differenzierung dieser Zellen spielen. FLT3 liegt auf dem langen Arm von Chromosom 13 (13q12). FLT3^mut gehören bei der AML zu den häufigsten genetischen Veränderungen und finden sich bei etwa einem Drittel aller AML-Patienten. [27, 57] Die Mutationen sind vor allem in zwei funktionellen Domänen des Rezeptors lokalisiert: der Juxtamembranären (JM)- und der Tyrosinkinase-Domäne (TKD). [27] Die häufigsten aktivierenden Veränderungen sind mit 20 - 25 % der Fälle die internen Tandemduplikationen von FLT3, welche in der JM-Domäne lokalisiert sind. [45]

Diese ist physiologischerweise für die Hemmung der Tyrosinkinase verantwortlich.

Mutationen in der TKD sind meistens in der Aktivierungsschleife zu finden und stellen häufig Punktmutationen, kleine Insertionen oder Deletionen dar. [30]

Zahlreiche Forschungsergebnisse bei CN-AML-Patienten haben zum Ergebnis geführt, dass Patienten mit FLT3-ITD unter Standardtherapie eine signifikant schlechtere Prognose haben als Patienten ohne diese Mutation. Studien zeigen, dass die Prognose von der Menge des mutierten Allels abhängt, außerdem schneiden Patienten mit nicht-JM-ITD signifikant schlechter ab als AML-Patienten mit JM-ITD. Die prognostische Relevanz von FLT3-TKD^mut wird kontrovers diskutiert. [72] Für die Therapie befinden sich verschiedene Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) in der klinischen Prüfung. Erstgenerations-substanzen sind beispielsweise Midostaurin (PKC412), Lestaurtinib (CEP-701), Sunitinib (SU-11248) und Sorafenib (BAY 43-9006). Diese TKI hemmen weitere Kinasen und sind nicht spezifisch für FLT3. Substanzen der zweiten Generation, wie Quizartinib (AC220), zeigen eine deutlich höhere Spezifität gegenüber FLT3. [107] Stone et al. zeigte in einer randomisiert-placebokontrollierten Studie, dass sich durch die Zugabe von Midostaurin zur Standardchemotherapie das OS und das Ereignis-freie-Überleben (EFS) bei FLT3-mutierten Patienten mit AML signifikant verlängerte. Midostaurin wurde 2017 aufgrund dieser Studienergebnisse für die Therapie bei Patienten mit FLT3-mutierter AML zugelassen. [108] Bei der Erstlinientherapie konnten Studien zeigen, dass Patienten mit FLT-ITD außerdem von einer allogenen Stammzelltransplantation profitieren. [103] Erst kürzlich wurde Gilteritinib, ein neuer TKI, von der U.S. Food and Drug Administration für die

Behandlung von erwachsenen Patienten mit rezidivierender oder refraktärer AML mit einer FLT3^mut zugelassen. In aktuellen Studien konnte unter Gilteritinib für die Behandlung von erwachsenen Patienten mit FLT3-mutierter rezidivierter oder refraktärer AML ein Überlebensvorteil gezeigt werden. [66, 91]

1.3.1.3 NPM1-Mutationen

NPM1^mut stellen mit ca. 25 - 35 % die häufigsten bekannten Mutationen der AML dar, davon sind 85 % mit CN-Karyotyp. [60] NPM1 reguliert als nukleoläres Phosphoprotein unter anderem die Ribosomenbiogenese, den Transport zwischen Zytosol und Zellkern sowie den p53-Signaltransduktionsweg und verhindert die Proteinaggregation im Nukleolus. [34] Mutationen führen zu einer abnormalen Akkumulation von NPM1 im Zytoplasma, welche zelluläre Wege stören. NPM1 soll nach Studien sowohl als Onkogen als auch als Tumorsuppressor in der Zelle agieren. Durch den Ausfall der Apoptoseantwort sorgt es bei Überexpression für ein unkontrolliertes Zellwachstum und Tumorprogression, ein Fehlen der Expression führt andererseits zu einer genomischen Instabilität. [47] Die genaue Pathogenese ist jedoch noch nicht ausreichend geklärt. [33] NPM1^mut sind häufig vergesellschaftet mit anderen genetischen Aberrationen wie FLT3-ITD^pos, IDH1/2^mut und DNMT3A^mut. Weiterhin gibt es eine Assoziation zu verschiedenen klinischen und biologischen Merkmalen, zu diesen gehören unter anderem weibliches Geschlecht, höheres Lactatdehydrogenaselevel im Serum, höherer Anteil leukämischer Blasten, eine hohe CD33-Expression sowie niedrige oder fehlende CD34-Expression der Blasten. Klinisch weist die AML mit NPM1^mut eine günstige Prognose auf, jedoch nur in Abwesenheit einer FLT3-ITD^pos, die in 40 % der NPM1^mut vorhanden ist. [33, 27] Die WHO-Klassifikation von 2008 beinhaltet die AML mit NPM1^mut als neue provisorische Entität, welche in der aktualisierten Form von 2016 als eigenständige Entität aufgenommen wurde. [113] Studien zeigen, dass Patienten mit NPM1^mut ohne FLT3-ITD nicht von einer allogenen Stammzelltransplantation in der Erstlinientherapie profitieren und dass auch ältere Patienten (> 70 Jahre) von einer intensiven Chemotherapie profitieren können. [5, 27] Eine zielgerichtete molekulare Therapie gibt es für die AML mit NPM1^mut aktuell noch nicht, jedoch Entwicklungsbestrebungen für Substanzen, die als Therapieansatz die Hemmung der mutationsbedingten gesteigerten Anhäufung des NPM1-Proteins im Zytoplasma haben. Ein weiterer Ansatz stellt eine Therapie

mit dem CD33-Antikörper Gemtuzumab-Ozogamicin dar, eindeutige Daten hierzu fehlen allerdings noch. [29, 97] NPM1^mut sind aufgrund der nur wenig unterschiedlichen Mutationstypen stabile Marker für das Monitoring der messbaren Resterkrankung (MRD), also der Messung verbleibender maligner Zellen bei Patienten in Remission. Krönke et al. zeigte, dass es durch dieses Monitoring zum Zeitpunkt der Diagnose, während und nach der Therapie möglich ist Patienten einem hohen oder geringen Rückfallrisiko zuzuordnen. Auch Rücker et al. konnte zeigen, dass bei AML-Patienten mit RUNX1-RUNX1T1 das Monitoring der MRD eine Differenzierung von Patienten in niedriges und hohes Rückfallrisiko ermöglicht und eine negative MRD nach Therapie den wichtigsten Prognosefaktor für RFS und OS darstellt. Somit besteht in der Klinik die Möglichkeit das Überleben von Patienten mit hohem Rückfallrisiko durch frühe Therapie, beispielsweise mit einer allogenen Stammzelltransplantation, zu verbessern. [61, 98]

1.3.1.4 RUNX1-Mutationen

Bei hämatologischen Neoplasien zählt RUNX1 zu einem der häufigsten Gene, dessen physiologische Eigenschaften durch chromosomale Translokationen, Amplifikationen und Punktmutationen verändert ist. RUNX1 ist bei etwa 5 - 13 % aller AML-Patienten mutiert. [72, 83] Das RUNX1-Gen gehört zur Familie der RUNX-Transkriptionsfaktoren und kodiert für die DNA-bindende- -Untereinheit eines core-binding factors (CBF). RUNX1 reguliert die Differenzierung unreifer Progenitorzellen im Knochenmark und kann sowohl aktivierenden als auch inhibierenden Einfluss auf die Expression von Zielgenen haben. [39, 74] Die Genfusion der DNA des RUNX1-Gens auf Chromosom 21 mit dem RUNX1T1-Gen auf Chromosom 8 stellte die erste in der AML spezifisch erforschte chromosomale Translokation dar. [92] RUNX1 ist mit spezifischen Chromosomenaberrationen wie Trisomie 13 und 21 sowie FAB M0 und CN-Karyotyp assoziiert. Die RUNX1-mutierte AML ist assoziiert mit einem komplexen Mutationsmuster und einer ungünstigen Prognose. Ein möglicherweise bedeutender therapeutischer Ansatz für RUNX1-mutierte Patienten stellt die allogene Stammzelltransplantation dar. [27, 39, 43] Die RUNX1-mutierte AML wurde aufgrund ihrer biologischen als auch klinischen Charakteristika als neue provisorische Entität in der 2016 überarbeiteten Klassifikation der AML der WHO und ELN aufgenommen. [3]

1.3.1.5 IDH1- und IDH2-Mutationen

Die Familie der Isocitratdehydrogenasen umfasst Enzyme welche die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat zu -Ketoglutarat katalysieren. IDH1 ist hierbei die zytoplasmatische, IDH2 die mitochondrielle Unterform der IDH. IDH1/2^mut kommen bei ca. 15 - 20 % der AML Patienten vor, jeweils in definierten Bereichen des Gens:

Codon R132 von IDH1 und Codon R140 und R172 von IDH2. Mutationen in einem der beiden Enzyme führen zum Verlust der normalen Aktivität und Bildung des onkogenen Metaboliten 2-Hydroxyglutarat (2-HG). [27, 88] 2-HG wurde in weiteren Forschungsergebnissen als kompetitiver Inhibitor der -Ketoglutarat-abhängigen- Dioxygenasen, einschließlich wichtiger epigenetischer Regulatoren wie die 5-Methylcytosinhydroxylase der TET-Familie, charakterisiert. Dies hat weitreichende Veränderungen der DNA-Methylierung zur Folge. [117] IDH1^R132- und IDH2^R140-Mutationen sind mit NPM1^mut assoziiert, wohingegen IDH2^R172 -Mutationen kaum mit anderen Genmutationen in Verbindung gebracht werden und eine schlechte Prognose aufweisen. [27, 73] Wie bereits oben genannt, klassifizierte die AMLSG diese Mutation in eine eigene Untergruppe der AML, aufgrund ihres unterschiedlichen Verhaltens in Bezug auf Genexpression und DNA-Methylierung im Vergleich zu den anderen IDH ^mut. [85]

Die prognostische Bedeutung der IDH1/2^mut wird bislang noch kontrovers diskutiert. [27] Als Therapieansatz wurden kürzlich Ivosidenib (IDH1) und Enasidenib (IDH2) für die Therapie einer rezidivierten oder refraktären AML mit nachgewiesener IDH1/2^mut zugelassen, nachdem in Studien eine günstige Ansprechrate und anhaltende Remission erzielt werden konnte. [24, 106]

1.3.1.6 DNMT3A-Mutationen

Studien beschreiben DNMT3A^mut in ca. 22 % der AML-Patienten. Sie kommen vor allem bei CN-AML-Patienten und somit intermediärem Risiko vor, oft in Verbindung mit FLT3^mut, NPM1^mut und IDH1/2^mut. [27, 42, 67] DNMT3A kodiert für eine DNA-(5-Cytosin)-Methyltransferase 3A, welche das Hinzufügen einer Methylgruppe an den Cytosinrest von CpG-Dinukleotiden katalysiert. Zwei Drittel der Mutationen gehören zum Codon R882 von Exon 23 in der Methyltransferase-Domäne, R882 inhibiert direkt die Enzymaktivität von DNMT3A. Mit 1700 jüngeren Patienten führte die AMLSG die bislang größte Studie bezüglich Frequenz und prognostischer

Bedeutung von DNMT3A^mut bei der AML des Erwachsenen durch. Es konnte hierbei kein signifikanter Einfluss auf das EFS, RFS oder das OS gezeigt werden, ein negativer prognostischer Effekt konnte nur in der nach alter Einteilung der ELNvon 2010 ungünstigen Gruppe der CN-AML-Patienten gefunden werden. [42] In einer anderen Studie mit 489 AML-Patienten (< 60 Jahre) werden DNMT3A^mut als unabhängige prognostische Faktoren für ein kürzeres OS beschrieben und mit einer ungünstigen Prognose assoziiert, nehmen jedoch auch hier keinen Einfluss auf das EFS oder RFS. [111]

1.3.1.7 WT1 (Wilms Tumor 1) -Mutationen

Mutationen im WT1-Gen werden in ca. 10 % der akuten Leukämien beschrieben. [27] WT1 beeinflusst als wichtiger Regulator Zellentwicklung und Wachstum, indem er die Gentranskription abhängig vom Zelltyp, der WT1-Protein-Isoform und dem Zielgen aktiviert oder unterdrückt. WT1 kann somit als Tumorsuppressorgen als auch als Onkogen wirken. [118] Die prognostische Bedeutung der WT1^mut bei AML-Patienten ist noch nicht abschließend geklärt, sie werden in einigen Studien mit einer eher schlechteren Prognose in Verbindung gebracht. [87, 114]Dies konnte jedoch von Gaidzik et al. nicht bestätigt werden. [41]

Kürzlich konnte in einer Studie mit 398 AML-Patienten nachgewiesen werden, dass WT1-mutierte Patienten durch eine geänderte DNA-Methylierung und eine geringere Menge an 5-Hydroxymethylcytosin charakterisiert sind, ähnlich TET2/IDH1/2. Weiterhin konnte eine negative Korrelation zwischen WT1^mut und IDH/TET2^mut gezeigt werden, was eine gemeinsame funktionelle Rolle und einen Einfluss von WT1^mut auf die TET2-Funtkion vermuten lässt. WT1 könnte hierbei ein Cofaktor der TET-Enzyme sein, indem er an bestimmten Stellen im Genom ihre Aktivität stimuliert. Diese Daten liefern somit durch Regulierung der DNA-Hydroxymethylierung eine neue Rolle für WT1. [95, 96]

1.3.1.8 RAS-Mutationen

Zur RAS-Proto-Onkogen-Familie gehören 3 funktionell unterschiedliche G-Proteine:

N-RAS, K-RAS und H-RAS, wobei N-RAS am häufigsten mutiert vorliegt.

Verschiedene maligne Neoplasien, unter anderem die AML, weisen N-RAS ^mut und K-RAS^mut auf. Die N-RAS konnte in ca. 10 - 15 % der CN-AML Patienten mutiert vorgefunden werden. [4, 102] RAS-Proteine spielen als membranassoziierte

regulatorische GTP-Hydrolasen eine wichtige Rolle in der Regulation von Wachstum, Differenzierung und Apoptose der Zelle. Dabei führen RAS^mut zu einer erhöhten Proliferations- und erniedrigten Apoptoserate. Punktmutationen können durch Inaktivierung der entsprechenden GTPase zu einer andauernden Aktivierung der Proliferation führen. [32, 94] Die prognostische Bedeutung der bei der AML häufig vorhandenen RAS ^mut ist bisher noch unklar und wird in Studien kontrovers diskutiert. [4, 100]

1.3.1.9 ASXL1-Mutationen

Das ASXL1-Gen gehört zu den Transkriptionsverstärkern der Trithorax und Polycomb (ETP)-Genfamilie, die physiologischerweise eine Rolle in der epigenetischen Aktivierung und Unterdrückung der Gentranskription spielt. ASXL1 liegt auf dem langen Arm von Chromosom 20. [37] ASXL1^mut wurden in einer Vielzahl maligner Neoplasien gefunden. Die Prävalenz von ASXL1^mut bei Patienten mit AML wird mit ca. 30 % bei der sekundären AML und mit ca. 6,5 % bei der de novo AML angegeben. Studien zeigten einen signifikanten Zusammenhang von einem Anstieg der ASXL1^mut im Alter, außerdem sind männliche Patienten häufiger betroffen. ASXL1^mut wurden fast nie zusammen mit t(15;17)-Translokationen, FLT3-ITD^mut, NPM1^mut und WT1^mut gefunden, waren jedoch häufig mit RUNX1^mut und IDH2^mut verbunden. Weiterhin wurde bei Patienten mit ASXL1^mut ein kürzeres OS und eine geringere Remissionsrate gezeigt. [89] Die ELN fügte 2017 ASXL1^mut in ihre Risikoeinteilung der AML zur Hoch-Risikogruppe hinzu. [26]