1 Einleitung
2.1 Material
2.1.1 Oligonukleotide, Peptide und Linker 2.1.1.1 Oligonukleotide
In dieser Arbeit wurden synthetische Oligonukleotide (hergestellt von MWG-Biotech AG, Ebersberg) verwendet, die sowohl als Matrizen zum Assemblieren eines DNA-Doppelstrangs (ntagCys-fwd, ntagCys-rev) als auch in der Polymerasekettenreaktion (pCSmut-fwd, pCS-CS25C -rev) eingesetzt wurden. Für die Sequenzierung wurden Standardprimer eingesetzt (GATC, Konstanz).
Oligonukleotid Basensequenz (5`→3`) Bemerkung
ntagCys-fwd GATC CATG GGT TGC GGT GGC TCT GGT GGT GGC
GGG TCC GGA GGC GGT GGC TAA TGA A codiert für AS-Sequenz MGCGGSGGGGSGGGG
Die Aminosäurereste sind durch den Einbuchstabencode dargestellt, wobei Großbuchstaben L- und Kleinbuchstaben D-Aminosäuren kennzeichnen (Kantlehner, Schaffner et al., 2000). Zusätzlich wurde über den Linker SMCC eine Maleimid-Funktionalität angebracht.
Zur Detektion wurde zusätzlich Fluorescein angefügt.
-Maleimide Heterobiunktioneller Crosslinker, Spacer-Länge: 5,34 nm Pierce, IL, USA
2.1.2 Plasmide
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Vektor pAZL in Kombination mit dem von D. Hümmerich etablierten Klonierungssystem verwendet (Huemmerich et al., 2004a). Als Ausgangsvektor wurde dabei pAZL-C eingesetzt, welcher bereits die für ein C-Modul kodierende Gensequenz enthält. Zur Genexpression wurden die Vektoren pET21a sowie pET29a verwendet, je nach gewünschter Resistenz gegenüber Ampicillin (AmpR) bzw.
Kanamycin (KanR). Eine Subklonierung in pET29a erfolgte ausgehend von pET21a, so dass alle in dieser Arbeit erzeugten Konstrukte einen aminoterminalen T7-tag trugen.
pAZL-C pFastbac1 mit zusätzlicher
Zur Klonierung und Vermehrung von Plasmid-DNA wurde der Bakterienstamm Escherichia coli DH10B verwendet, zur Proteinproduktion der Stamm HMS174(DE3).
E. coli DH10B F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 lacX74 recA1 endA1
Restriktionsenzyme NEB, Frankfurt a. M., Deutschland
T4 DNA Ligase Promega, Madison, WI, USA
Lysozym AppliChem, Darmstadt, Deutschland
SAM (S-Adenosylmethionin) NEB, Frankfurt a. M., Deutschland
Humanes Serum Albumin (HSA) Sigma-Aldrich, Seelze, Deutschland
shrimp alkaline phosphatase, SAP Roche, Mannheim, Deutschland
α-T7-tag Antikörper (monoklonal, Maus) Novagen, Madison, WI, USA α-Maus-IgG-HRP (horseradish peroxidase) Konjugat (Ziege) Sigma, St. Louis, MO, USA Streptavidin-AP (Alkalische Phosphatase) Konjugat Sigma, St. Louis, MO, USA
2.1.5 Größenstandards und Kits
Precision Plus Protein Standards Dual Color BioRad, München, Deutschland ColorPlus Prestained Protein Marker (7-175 kDa) NEB, Frankfurt a. M., Deutschland DNA-Längenstandard (1 kb Ladder) NEB, Frankfurt a. M., Deutschland DNA-Längenstandard (100 bp Ladder) NEB, Frankfurt a. M., Deutschland
Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification System Promega, Madison, WI, USA Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega, Madison, WI, USA
ECL-Western Blot Detektionssystem Amersham Biosciences,Piscataway, NJ, USA
2.1.6 Chemikalien und Biochemikalien
Substanz Firma
1,1,1,3,3,3 Hexafluor-2-Propanol (HFIP) Merck, Darmstadt, Deutschland 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol (TRIS) Roth, Karlsruhe,Deutschland
2-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt, Deutschland
Acrylamidlösung Rothiphorese Gel 40 Roth, Karlsruhe, Deutschland Ammoniumperoxodisulfat (APS), p. a Roth, Karlsruhe, Deutschland Ampicillin Natriumsalz, >99 % Roth, Karlsruhe, Deutschland
Brillant Blau G 250 Roth, Karlsruhe, Deutschland
di-Kaliumhydrogenphosphat Roth, Karlsruhe, Deutschland
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Biochrom, Berlin, Deutschland Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Einfriermedium Gibco/Invitrogen, Darmstadt, Deutschland
Ethanol VWR, Darmstadt, Deutschland
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck, Darmstadt, Deutschland
Fötales Kälberserum Biochrom, Berlin, Deutschland
Fluorescein 5-Maleimid Pierce/Thermo Scientific, Rockford, IL,
USA
Formaldehyd, 37 %, p. a. Roth, Karlsruhe, Deutschland
Glycin Roth, Karlsruhe, Deutschland
Glyzerin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
GoldenhanceTM-EM Nanoprobes, Yaphank, NY, USA
Guanidiniumthiocyanat Merck, Darmstadt, Deutschland
HCl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Humanes Serum Albumin (HSA) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Kanamycinsulfat Roth, Karlsruhe, Deutschland
Kaliumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe, Deutschland
L-Lysin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Maleimid PEO2-Biotin Pierce/Thermo Scientific, Rockford, IL,
USA
Methanol Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Monomaleimido Nanogold Nanoprobes, Yaphank, NY, USA
N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-2- ethansulfonsäure (HEPES) Roth, Karlsruhe, Deutschland N,N,N´,N´- Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Natriumchlorid Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumdodecylsulfat (SDS), > 85 % Merck, Darmstadt, Deutschland Penicillin (10000 U/ml) /Streptomycin (10 mg/ml)–Lösung Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Trifluoressigsäure (TFA) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorid (TCEP-HCl) Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Trypsin-EDTA (0,05 %) Invitrogen, Darmstadt, Deutschland
Tween 20, molecular biology grade Merck, Darmstadt, Deutschland WST-1 (water soluble tetrazonium) Roche, Mannheim, Deutschland
Weitere verwendete Chemikalien stammen, falls nicht anders vermerkt, von der Firma Merck in Darmstadt oder Firma Roth in Karlsruhe und hatten den Reinheitsgrad p.a.. Alle Lösungen und Puffer wurden mit ultrareinem Wasser aus einer Milli-Q-Anlage von Millipore (Billerica, MA, USA), hergestellt.
2.1.7 Sonstige Materialien/Verbrauchsmaterialien
Aluminiumoxid-Tiegelchen für TGA Mettler Toledo, Gießen, Deutschland
Aluminiumtiegel für DSC Mettler Toledo, Gießen, Deutschland
Neubauer Zählkammer Lo Laboroptik, Friedrichsdorf, Deutschland
Petrischalen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Multiwell-Platten (96-well, 24-well) - NunclonTM Nunc, Roskilde, Dänemark Multiwell-Platten (96-well, 24-well) – für Suspensionszellen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Zellkulturflaschen Corning Lifesciences, NY, USA
Quarzglas Suparasil Küvetten (unterschiedliche Ausführungen) Hellma, Mühlheim, Deutschland Gelfiltrationssäule Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare, München, Deutschland Membranfilter (0,22 μm und 0,45 μm) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Membranfilter (0,1 µm) Millipore, Billerica, MA, USA
Micro Cantilever OMCL – AC 160 TS-W2 Olympus, Tokyo, Japan
Leitsilber Plano, Wetzlar, Deutschland
Plastik Modellbaukleber UHU GmbH & Co. KG, Bühl, Deutschland
REM-Probenhalter Agar Scientific Ltd., Essex, UK
TEM-Netzchen (grids, vergoldet, 400 mesh) Plano, Wetzlar, Deutschland
Thermanox® plastic cover slips Nalge Nunc Int., Rochester, NY, USA
SERVAGel™ TG 4-20 SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg,
Deutschland
2.1.8 Geräte und technische Hilfsmittel
Gerät Modell Firma
Absorptionsspektrophotometer Cary 50 Bio Varian, Darmstadt, Deutschland
Blotapparatur Fastblot B44 Biometra, Göttingen, Deutschland
Brechungsindexdetektor RI-71 Shodex, Tokyo, Japan
Brutschrank Heracell 150i Thermo Scientific, Waltham, MA,
USA
WB 560 K mytron Bio- und Solartechnik GmbH,
Heilbad Heiligenstadt, Deutschland
CD-Spektrometer J-715 Jasco, Tokyo, Japan
Dynamisch mechanische Analyse TA DMA 2980 TA Instruments, Newcastle, DE, USA
Fed-Batch Reaktor Minifors Infors HT, Bottmingen, Schweiz
Fluoreszenz-Imager Ettan DIGE GE Healthcare, München,
Deutschland
Fluoreszenzspektrometer FP-6500 Jasco, Essex, UK
FTIR-Spektrometer FTS6000
FTIR-Spektrometer Tensor 27 IR-Spektrometer Detektor: MCT
Messeinheit: MIRacle Germanium-ATR-Kristall
Bruker, Rheinstetten, Deutschland
Geldokumentation GelDoc XR‐System BioRad, München, Deutschland
Hochdruckhomogenisator M‐110S Niro Soavi, Lübeck, Deutschland
HPLC System Series 1100
Kalorimeter (DSC) SDTA 821e System Mettler Toledo, Gießen, Deutschland
Klimakammer Eigenbau (Gregor Lang)
Kontaktwinkelmessung OCA System Dataphysics Intruments GmbH,
Filderstadt Deutschland
Lichtmikroskop DMIL LED mit DFC 295
Farb-kamera
Lyophylle Alpha 1-2 LD plus Christ, Osterode, Deutschland
Massenspektrometer Bruker Reflex III Bruker, Bremen, Deutschland Ofen Heraeus Function Line UT 20 Thermo Scientific Inc., Waltham,
MA, USA
pH Meter Lab 860 Schott AG, Mainz, Deutschland
Platereader Mithras LB 940 Berthold Technologies, Sprendlingen,
Deutschland
Rasterelektronenmikroskop 1540EsB Cross Beam Zeiss, Oberkochen, Deutschland Rasterkraftmikroskop DimensionTM 3100
ausgestattet mit Nanoscope IV SPM Controller
Veeco Instruments Inc., Plainview, NY, USA
Sterilwerkbank HERAsafe KS Thermo Scientific, Waltham, MA,
USA
Thermocycler Primus MWG Biotech AG, Ebersberg,
Deutschland
Thermogravimeter (TGA) SDTA 861e Mettler Toledo, Gießen, Deutschland Thermomixer Thermo Compact/comfort Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Zugmaschine Universal Tester 5565 Instron, Norwood, MA, USA
2.1.9 Computerprogramme
Astra 5.3.4.14 Wyatt Technology Europe, Dernbach, Deutschland
ExPASy - SIB Bioinformatics Resource Portal http://expasy.org/
GENtle Magnus Manske, Köln, Deutschland
Nanoscope 6.14r1 Veeco Instruments Inc. N.Y., USA
Opus 6.5 Bruker Optics Corp., Billerica, MA, USA
OriginPro 8.1G OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA
Swiss-PdB-Viewer Deep View v 4.0.4 Swiss institute of bioinformatics,
http://www.expasy.org/spdbv, (Guex & Peitsch, 1997) Advantage Universal Analysis v5.4 TA Instruments, Newcastle, DE, USA
Vector NTI Advance 10 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA