2.9 Immunhistologische Methoden
2.9.1 Markierte Streptavidin-Biotin Methode
Die bei nachfolgenden Untersuchungen verwendete markierte Streptavidin-Biotin (LSAB = labeled streptavidin biotin) Methode ist eine spezielle Form der indirekten enzymatischen Immunhistologie.
Abb. 4 Schematische Darstellung der Antikörperbindung bei der direkten und indirekten Immunhistologie.
Im Unterschied zur direkten Immunhistologie, bei der der antigenspezifische Primärantikörper direkt mit einem Enzym (z.B. Meerrettichperoxidase) gekoppelt ist, sind die Primärantikörper bei der indirekten Methode nicht enzymgekoppelt sondern unmarkiert. Während das Enzym bei der direkten Methode nach der Inkubation mit einem entsprechenden Substrat zu einer Farbreaktion führt (Enzym-Substratkomplex Abb. 4), erfolgt die Farbreaktion bei der indirekten Immunhistologie erst nach Zugabe eines enzymgekoppelten Sekundärantikörpers (Abb. 4). Durch die Bindung von mehreren Sekundärantikörpern an den antigenspezifischen Primärantikörper kommt es zu einer höheren Konzentration von Enzym als bei der direkten Methode und damit zu
Plasmamembran
Primärantikörper Primärantikörper
Sekundärantikörper
Direkt Indirekt
Enzym-Substratkomplex
Antigen
einer Amplifikation des Farbsignals. Bei der LSAB-Methode wird zusätzlich die hohe Affinität zwischen dem synthetischen Molekül Streptavidin und Biotin ausgenutzt, um eine zweite Amplifikation des Signals zu erreichen. Dafür wird das Streptavidin mit mehreren Enzymen kovalent gekoppelt. Der Sekundärantikörper ist statt nur mit dem Enzym mit mehreren Biotinmolekülen konjugiert. So können am Antikörper zahlreiche Streptavidinmoleküle und damit überproportional viel Enzym binden (Abb. 5).
Abb. 5 Schematische Darstellung der Vorgänge bei der markierten Streptavidin- Biotin-Immunhistologie.
Das Meerrettichperoxidase gekoppelte Streptavidin bindet an Biotin. Die Meerrettichperoxidase führt dann mit einem Substrat (AEC) zur Farbreaktion.
Abkürzungen: AEC = 3-Amino-9-Ethylcarbazol
Abhängig von der Spezies, aus der das zu untersuchende Gewebe stammt, der Fixierung der Proben, sowie der Lage des zu untersuchenden Epitops wird die Verwendung unterschiedlicher Protokolle nötig. Auch bei den im Folgenden verwendeten Antikörpern musste dieser Tatsache Rechnung getragen werden.
Meerrettichperoxidase AEC
Biotin
Sekundärantikörper Streptavidin
2.9.2 Verwendete Antikörper
Die verwendeten Antikörper sind in Tab. 5 und Tab. 6 aufgeführt. Die untersuchten Epitope befinden sich an verschiedenen Stellen in der Zelle. CD4, CD8, und CD25 sind Oberflächenepitope.
IgA ist ein Immunglobulin, das sowohl intrazellulär in Vesikeln als auch extrazellulär auf der Zellmembran und im Extrazellularraum vorkommt.
Tab. 5 Primärantikörper
Antigen Klon Donor/Isotyp Verdünnung Art Diluent Hersteller
CD4 74-12-4 Maus
IgG2b
1:50 mAk Monet Blue VMRD,
Pullman, USA
1:10 - Monet Blue Chemicon,
Hempshire, UK Abkürzungen: CD = Cluster of Differentiation, Ig = Immunglobulin, mAk = monoklonaler Antikörper,
Tab.6 Sekundärantikörper
Antigen Klon Donor Verdünnung Art Diluent Hersteller Anti Maus
IgG1
- Ziege 1:50 pAk Antikörper
Diluent
SouthernBiotech, Birmingham, USA Anti Maus
IgG2a
- Ziege 1:50 pAk Antikörper
Diluent
SouthernBiotech, Birmingham, USA Anti Maus
IgG2b
- Ziege 1:50 pAk Antikörper
Diluent
SouthernBiotech, Birmingham, USA Abkürzungen: CD = Cluster of Differentiation, Ig = Immunglobulin, pAk = polyklonaler Antikörper,
Die Antikörper gegen IgA und CD25 können auf Paraformaldehyd-fixierten Gewebeschnitten angewendet werden. Neben der Lage des nachzuweisenden Epitops ist auch die Gewebegängigkeit des verwendeten Antikörpers von großer Bedeutung. Die Antikörper gegen CD4 und CD8 konnten nur auf Schnitten aus unbehandelten Gefrierproben verwendet werden.
Sämtliche Inkubationsschritte wurden in einer Klimakammer ausgeführt, um ein Austrocknen der Schnitte zu verhindern. Alle Inkubationsschritte, bei denen keine näheren Angaben zur Temperatur gemacht worden sind, wurden bei Raumtemperatur (RT) vorgenommen. Die Waschschritte erfolgten in Glasküvetten mit einem Flüssigkeitsvolumen von 80 ml. Das zur enzymatischen Entwicklung verwendete 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) wurde kurz vor Gebrauch aus einem kommerziellen Kit (Zymed, Deutschland) frisch angesetzt, da es nur für etwa 20 Minuten stabil war. Die Farbentwicklung erfolgte in allen Fällen unter Sichtkontrolle am Mikroskop.
TBS wurde mit 350 µl Tween/1000 ml verwendet, um die Benetzungseigenschaften der Lösung zu verbessern.
2.9.2.1 Darstellung von CD4 Oberflächenantigen
Die aus TissueTec® Gefrierproben angefertigten Gewebeschnitte wurden mit einem wasserabweisenden DakoPen® (Dako, Deutschland) umrandet, um einem Austrocknen vorzubeugen. Anschließend wurden die Schnitte für 90 Sekunden in einem Gemisch aus Methanol und eiskaltem Aceton (Verhältnis 1:1) bei 4°C fixiert, um eine bessere Haftung während der Immunhistologie zu gewährleisten. Nach der Fixierung wurden die Objektträger mit TBS/Tween gespült und zweimal fünf Minuten in TBS/Tween gewaschen. Im Anschluss folgte die Inkubation
mit 30 µl des Primärantikörpers über Nacht bei 4°C. Am nächsten Tag wurden die Schnitte vorsichtig gewaschen und für fünf Minuten in TBS/Tween gestellt. Danach wurden 30 µl Sekundärantikörper aufgebracht und die Schnitte damit für 30 Minuten inkubiert. Nach dem Sekundärantikörper folgte ein Waschschritt mit TBS/Tween. Dann wurden die Schnitte mit 30 µl eines Streptavidin-Biotin-Komplexes für 20 Minuten bedeckt und wiederum mit TBS/Tween gewaschen. Die Sichtbarmachung des Signals erfolgte mit 30 µl AEC für zwei bis sechs Minuten.
Die Reaktion wurde anschließend fünf Minuten lang in Aqua dest. gestoppt.
2.9.2.2 Darstellung von CD8 Oberflächenantigen
Die Gewebeschnitte für die Darstellung des CD8 Epitops wurden genauso fixiert wie oben beschrieben. Sie wurde vor der Inkubation mit dem Primärantikörper für zehn Minuten mit 30 µl eines 5%igem Schweinenormalserums in TBS geblockt, um unspezifische Bindungen des Primärantikörpers zu verhindern. Das Serum wurde vorsichtig abgeklopft und 30 µl des Antikörpers in einer Verdünnung von 1:100 in van Gogh Revival Series aufgetragen und über Nacht bei 4°C auf dem Objektträger belassen. Am nächsten Tag wurden die Objektträger mit TBS/Tween gewaschen, erneut dieses Mal für 30 Minuten mit 5%igem Schweinenormalserum geblockt, abgeklopft und dann mit einem biotinylierten, isotypspezifischen α-Maus IgG2a Sekundärantikörper für 30 Minuten inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde für 20 Minuten 30 µl des Streptavidin-Meerrettichperoxidase Komplexes (Streptavidin-HRP-Komplex) aufgetragen. Es folgte ein weiterer Waschschritt, dem sich die Farbreaktion von sechs bis sieben Minuten mit 30 µl AEC anschloss. Gestoppt wurde die Reaktion durch eine fünfminütige Inkubation der Objektträger in Aqua dest..
Da weder bei diesem Epitop noch bei dem Nachweis von CD4 unspezifische Färbungen von Zellen im Isotyp zu erkennen waren, und diese auch nach mehrmaliger Wiederholung nicht nachgewiesen wurden, konnten auf die sonst bei der Verwendung eines horseradish peroxidase (HRP)-gestützten, enzymatischen Systems übliche Blockierung endogener Peroxidasen mit H2O2 verzichtet werden, zumal die Verwendung von Wasserstoffperoxid die Darstellung der Epitope erheblich erschwerte oder sogar gänzlich verhinderte.
2.9.2.3 Darstellung von CD25-Oberflächenantigen und intrazellulärem IgA
Für den Nachweis von IgA und CD25 wurden paraformaldehydfixierte Paraffinschnitte verwendet.
Sie mussten zunächst entparafffiniert werden. Um die durch Paraformaldehyd hervorgerufene Vernetzung von Proteinen (Maskierung) rückgängig zu machen, wurden die Objektträger in Target Retrieval Puffer® (Dako, Deutschland) für 45 Minuten bei 95°C im Wasserbad inkubiert. Sie wurden dann langsam im Wasserbad auf 80°C abgekühlt und anschließend außerhalb des Wasserbades auf Raumtemperatur gebracht. Nach zweimal fünfminütigem Waschen in TBS/Tween wurden unspezifische Antikörperbindungen für 30 Minuten mit TBS + 5% Schweinenormalserum (TBS/5% SNS) geblockt. Die Schnitte wurden abgeklopft und mit 30 µl eines der beiden Primärantikörper über Nacht bei 4°C inkubiert. Am folgenden Tag wurde der Antikörper abgespült und nach Waschen in TBS/Tween erneut mit 30 µl TBS/5% SNS inkubiert, abgeklopft und 30 µl Sekundärantikörper aufpipettiert. Dieser wurde für 30 Minuten auf den Schnitten belassen und danach mit TBS/Tween gewaschen. Damit keine Entwicklung des Farbsubstrats durch die im Darm ubiquitär vorkommende endogene Peroxidase erfolgen konnte, wurde sie in Methanol mit 1,2%
H2O2 in 30 Minuten geblockt. Nach zweimaligem gründlichen Waschen mit TBS/Tween für jeweils fünf Minuten wurden die Objektträger für 20 Minuten mit 30 µl Streptavidin-HRP-Komplex inkubiert und nach erneutem Waschen mit TBS/Tween für 15 Minuten mit AEC entwickelt. Das Stoppen der Farbreaktion erfolgte mit Aqua dest..
2.9.2.4 Gegenfärbung mit Hämalaun
Um eine bessere Differenzierung und Auswertung der Schnitte zu ermöglichen, erfolgte bei allen Antikörpern unabhängig von den jeweiligen Protokollen eine Gegenfärbung mit Hämalaun für 15 Sekunden. Das Gewebe wurde danach in Leitungswasser fünf Minuten gebläut und nach einer weiteren fünfminütigen Inkubation in Aqua dest. eingedeckt. Als Eindeckmedium wurde Faramount® (Dako, Deutschland) verwendet.
2.9.3 Auswertung
Die Beurteilung der Gewebeschnitte wurde an verblindeten Objektträgern von immer demselben Untersucher durchgeführt. Auswertung und Darstellung erfolgten mit einem Lichtmikroskop
(Labophot-2, Nikon, Japan) und einer angeschlossenen Digitalkamera (Coolpix 5000, Nikon, Japan) und einem digitalen Zähler (Assistent® Counter AC-8, Karl Hecht GmbH &Co. KG, Sondheim).
Die zu untersuchenden Zellen wurden gegen Restzellen gezählt, dabei wurde jede Zelle, die keine typischen Merkmale der zu untersuchenden Population aufwies, als Restzelle gewertet.
Die Hämalaun-Eosin-gefärbten Schnitte wurden zunächst in 200facher und 400facher Vergrößerung unter dem Mikroskop allgemein beurteilt. Es wurde in Schnittbereichen gezählt, in denen die mikroskopische Struktur des Darms klar zu erkennen war. Im Dünndarm mussten Krypten und Zotten eindeutig zu differenzieren sein. Im Dickdarm war das Vorhandensein durchgängiger Lumina der Krypten bis zur Grenze zwischen Submukosa und Mukosa ausschlaggebend für die Verwendbarkeit des Schnittes. Das Oberflächenepithel sollte sich in beiden Darmabschnitten weitest gehend einschichtig darstellen.
Es wurden immer mindestens 1000 Gesamtzellen (Zielzellen + Restzellen) gezählt. Einige Zellen wie z.B. die neutrophilen Granulozyten kamen in bestimmten Darmabschnitten nur in sehr kleiner Zahl vor. War dies der Fall, wurde über die Gesamtzellzahl von 1000 Zellen hinaus solange weitergezählt, bis mindestens 30 positive Zellen gezählt waren.
Als positiv wurden nur Zellen gewertet, bei denen die Zellmorphologie eindeutig erhalten war.
Zellkern und Zytoplasmamembran mussten deutlich erkennbar und optisch intakt sein. Bei den hier verwendeten immunhistologischen Färbungen stellten sich die positiven Zellen rot dar. Als positiv wurden bei Oberflächenfärbungen (CD4, CD8 und CD25 Zellen) gewertet, bei denen mindestens die Hälfte bis zu zwei Drittel der Oberfläche angefärbt war. Bei intrazellulären Färbungen (IgA) war die Zelle positiv, wenn das Zytoplasma deutlich rot gefärbt war und den Zellkern zu 2/3 umschloss.
Granulozyten, Mastzellen, CD4+ und IgA+ Zellen wurden mangels Vorkommen im Epithel nur in der Lamina propria gezählt. CD25 wurde ebenfalls nur in der Lamina propria gezählt, da sie im Epithel nur sehr vereinzelt zu finden waren.
Beginnend an der Grenze zwischen Submukosa und Mukosa wurden die Zellen der Lamina propria in einem Gesichtsfeld bei 1000facher Vergrößerung (10fache Vergrößerung durch das Okular + 100fache Vergrößerung durch ein Ölimmersions-Objektiv) gezählt. Im Anschluss wurde das Gesichtsfeld um genau eine Breite nach luminal verschoben usw. bis zum luminalen Abschluss der Mukosa. Dann erfolgte eine Verschiebung um ein Gesichtsfeld nach rechts, um in gleicher Weise in serosaler Richtung auszuwerten. Auch nach Erreichen der zu zählenden Zellzahl (1000 Zellen oder
mindestens 30 positive Zellen) wurde die Zählung bis zum nächsten luminalen bzw. serosalen Gesichtsfeld fortgesetzt.
CD8+ Zellen wurden gesondert in Lamina Propria und Epithel ausgewertet, wobei zusätzlich jeweils zwischen basalem und apikalem Bereich der Mukosa unterschieden wurde. Als intraepithelial galten Zellen, die mit mindestens 2/3 ihrer Zelloberfläche an Epithelzellen grenzten.
Der apikale Bereich umfasste im Dünndarm die Zotten von der Zottenspitze bis zur Basis (Übergang zu den Krypten). Beim basalen Bereich handelte es sich um den Abschnitt vom Beginn der Krypten bis zur Submukosa.
Im Dickdarm erschwerte das Fehlen von Zotten eine reproduzierbare Differenzierung zwischen apikal und basal. Per definitionem wurde das erste luminale mikroskopische Gesichtsfeld, das den Sichtbereich bei 1000facher Vergrößerung komplett ausfüllte, als apikal gewertet. Das erste serosale Blickfeld an der Grenze zur Submukosa bei 1000facher Vergrößerung wurde als basal definiert. Die Gesichtsfelder haben sich nicht überschnitten.
Die angefertigten Fotos wurden mit der Adobe® Photoshop® 7 Software bearbeitet.