4.2 Mitte der Trächtigkeit : Histochemische Analysen in Doppelfluoreszenz
4.3.1 Lektinhistochemie mit DAB-Färbung
CT1 DBA MAL PHA Tag 5
a.p. M I S M I S M I S M I S
HLP 1583 +++ +++ +++ ++(+) ++(+) ++(+) (+) (+) (+) +++ ++ +(+) HLP 1585 +++ +++ +++ +++ +++ ++ +(+) + + +++ ++ ++
HLP 1587 +++ +++ +++ ++ + + + + +(+) +++ ++ ++
S1F +(+) +++ +(+) (+) ++ + ++(+) ++ +(+) +++ ++ ++
Tag 1 a.p.
S2F + +(+) +(+) - - - +++ +++ +++ +++ +++ +++
S3F + + + - - - ++ ++ ++ +++ +++ +++
Für die Untersuchung wurden 5 µm Anschnitte von Paraffin-eingebettetem Plazentagewebe verwendet, welches fünf Tage und einen Tag ante partum während Sectiones caesarea entnommen wurde. Die Auswertung der Färbungsreaktionen erfolgte semiquantitativ unter Beurteilung der Färbungsqualität hinsichtlich ihrer Intensität und der spezifischen Anfärbung der BNC nach einem Punktesystem (Tab.4).
CT1
Mit Ausnahme des Präparates S1F zeigte der Antikörper in allen Schnitten eine starke und spezifische Anfärbung sehr großer BNC Mengen. Die Ausnahme bildet das Präprat S1F, in welchem die Anzahl der markierten BNC sehr viel geringer war.
Trotz deutlicher Anfärbung war die Spezifität der Antikörperbindung für die BNC über Tab. 4: Semiquantitative und qualitative Auswertung der DAB-Schnitte von Tag 5 und 1 ante partum
M = Menge gefärbter BNC; I = Intensität der Färbung; S = Spezifität der Färbung für BNC;
+++ = viele/ stark; ++ = mehrere/ mäßig; + = einzelne/ schwach; - = negativ
Ergebnisse 70
den gesamten Schnitt recht inhomogen und zeigte an einigen Bereichen auch starke Hintergrundfärbung.
In den Präparaten des letzten Trächtigkeitstages änderte sich das Färbungsmuster, insofern nur noch wenige BNC markiert wurden, und auch nur schwach anfärbbar waren.
DBA
In drei von vier Präparaten wurden mehrere bis sehr viele BNC von DBA markiert.
Die Intensität der Färbung variierte von schwach bis stark und hob die BNC aufgrund von unterschiedlich starker Hintergrundfärbung nicht in allen Fällen deutlich hervor.
Mit Ausnahme des Präparats S1F, in welchem nur vereinzelt deutlich angefärbte BNC vorlagen, waren im Allgemeinen die BNC jedoch zu diesem Zeitpunkt der Trächtigkeit DBA-positiv.
Im Gegensatz dazu wurde einen Tag vor dem Geburtstermin kein DBA mehr von den BNC gebunden. In beiden untersuchten Präparaten waren alle BNC negativ.
MAL
MAL zeigte in allen HLP-Präparaten 5 Tage a.p. eine sehr schwache Anfärbung weniger BNC, die vor allem in kleinen Ansammlungen in Blutgefäßnähe lagen.
Mehrere BNC wurden nur in dem Schnitt S1F deutlich von dem Lektin markiert.
In den Schnitten einen Tag a.p. banden viele bis sehr viele BNC das MAL und zeigten starke und spezifische Anfärbung ihres Zytoplasmas.
PHA
In allen Präparaten wurden sehr viele, vermutlich alle BNC von PHA angefärbt. Die Färbung des Zytoplasmas der BNC war zwar stets deutlich, jedoch weniger intensiv als die CT1-Färbung.
Auch in den Schnitten des Tages vor der Geburt waren sehr viele BNC spezifisch und stark angefärbt.
Ergebnisse 71
Ergebnisse 72
Ergebnisse 73 4.3.2 Doppelfluoreszenzfärbung mit Anti-boPAG-Antiserum und Lektinen
Das gleiche Material wie für die DAB-Färbung wurde in Doppelimmunofluoreszenz mit dem CT1-Antikörper und den Lektinen DBA, MAL und PHA mit jeweils dem PAG-Antikörper als Referenzfärbung für PAG-positive BNC gefärbt.
Die Auszählung der Antikörper- bzw. Lektin-bindenen BNC erfolgte prozentual an PAG-positiven BNC.
CT1 – Bindung
Fünf Tage vor der Geburt wurde noch ein Großteil an BNC, in drei von vier Schnitten über 75 %, von CT1 markiert. Einziger Ausnahmewert war das Präparat S1F, bei dem nur 7,5 % der PAG-positiven BNC auch CT1 positiv waren.
In den Präparaten von einem Tag a.p. ließen sich nur noch sehr wenige BNC, im Mittel 3,1 %, mit dem CT1-Antikörper anfärben.
Tag 5 a.p. Anteil an PAG-positiven BNC % Tag 1 a.p. Anteil an PAG-positiven BNC %
HLP 1583 75,2 S2 1,0
HLP 1585 82,8 S3 4,3
HLP 1587 93,4
S1F 7,5
Mittelwert 64,7 (ohne S1: 83,8) 3,1
DBA – Bindung
Das DBA zeigte ebenfalls zum früheren Zeitpunkt, also Tag 5 a.p., eine starke Affinität zu den BNC, die dann am Tag vor der Geburt drastisch reduziert war. So wurden in den ersten Präparaten mit einer Ausnahme Werte zwischen 91,3 % und 99,7 % gebundener BNC erhoben, während in Präparaten des späteren Zeitpunktes nur noch durchschnittlich 4,9 % der PAG-positiven BNC auch DBA-positiv waren.
Tab. 5: CT1-Bindung zur späten Trächtigkeit
Ergebnisse 74
Auch hier wich der im Präparat S1F von 5.Tag a.p. ermittelte Wert von nur 10,9 % DBA-positiven BNC deutlich von den übrigen dieser Reihe ab.
Tag 5 a.p. Anteil an PAG-positiven BNC Tag 1 a.p. Anteil an PAG-positiven BNC
HLP 1583 98,2 S2 9,0
HLP 1585 91,3 S3 0,9
HLP 1587 99,7
S1F 10,9
Mittelwert 75,0 (ohne S1: 96,4) 4,9
MAL – Bindung (Abb. 23 a-i)
Die Anzahl MAL-positiver BNC variierte in den Schnitten von Tag 5 a.p. zwischen 0,9
% und 21,0 % sehr stark. Den extremen Wert von 92,0 % (Schnitt S1F) ausgenommen, waren durchschnittlich 9,1 % der BNC MAL-positiv.
In den beiden Präparaten des Tages vor der Geburt stellte sich mit Werten von 99,3 % und 100 % eine einheitlich starke MAL-Bindung an die BNC dar.
Tag 5 a.p. Anteil an PAG-positiven BNC % Tag 1 a.p. Anteil an PAG-positiven BNC %
HLP 1583 0,9 S2 99,3
HLP 1585 5,3 S3 100,0
HLP 1587 21,0
S1F 92,0
Mittelwert 29,8 (ohne S1: 9,1) 99,7
Tab. 6: DBA-Bindung zur späten Trächtigkeit
Tab. 7 : MAL-Bindung zur späten Trächtigkeit
Ergebnisse 75 PHA – Bindung
Sowohl in den Präparaten des fünften als auch in denen des letzten Tages vor der Geburt schienen alle PAG-positiven BNC einheitlich stark und mit hoher Spezifität von PHA gebunden zu werden.
Tag 5 a.p. Anteil an PAG-positiven BNC % Tag 1 a.p. Anteil an PAG-positiven BNC %
HLP 1583 100,0 S2 100,0
HLP 1585 100,0 S3 100,0
HLP 1587 100,0
S1 100,0
Mittelwert 100,0 100,0
Die zum Teil extremen Abweichungen von der Gesamttendenz in den Präparaten der Spätträchtigkeit zum Tag 5 a.p. gehen allesamt auf einen Materialblock zurück. Die Anschnitte der S1F-Reihe entstammen Plazentamaterial, das im Rahmen einer Sectio caesarea entnommen wurde. Nach Angaben des Entsenders handelte es sich um ein Tier der Rasse Fleckvieh, welches sich fünf Tage vor errechnetem Geburtstermin befand, als der operative Eingriff vorgenommen wurde.
Die Ergebnisse hinsichtlich des Bindungsverhaltens der Lektine und des CT1-Antikörpers an die zytoplasmatischen Granula der binukleären Zellen entprechen jedoch eher dem Bild, welches in Präparaten eines späteren Zeitpunktes der Trächtigkeit zu sehen ist.
Unter Berücksichtigung individueller Schwankungen der Trächtigkeitsdauer, wäre es aufgrund der Einzigartigkeit der Ausnahme (ein einziges Präparat) und der Konstanz der ausreißenden Werte, die die beiden indikativen Lektine und den CT1-Antikörper gleichermaßen betreffen, zu erwägen, den Trächtigkeitszeitpunkt des Tieres näher am Geburtstermin zu vermuten.
Tab. 8: PHA-Bindung zur späten Trächtigkeit
Ergebnisse 76
CT1-/Lektinbindung Tag 5 a.p. ohne S1F
0 20 40 60 80 100
markierte BNC %
MW MW MW MW
CT1 DBA MAL PHA
Abb. 14: Bindungsverhalten von CT1 und der Lektine zu Tag 5 a.p. ohne Schnitt S1F Die vollen Säulen stellen die Werte der HLP-Schnitte dar, die schraffierten Säulen geben jeweils den Mittelwert der Säulenwerte wieder. Es wird deutlich, dass zum 5.
Tag a. p. sowohl CT1 als auch DBA noch an viele BNC binden, während MAL noch relativ wenige BNC markiert.
Ergebnisse 77
CT1-/Lektinbindung Tag 1 a.p.
0 20 40 60 80 100
markierte BNC %
MW MW MW MW
CT1 DBA MAL PHA
Abb. 15 : Bindungsverhalten von CT1 und der Lektine zu Tag 1 a.p.
Einen Tag ante partum stellt sich ein deutlich unterschiedliches Antikörper- bzw.
Lektinbindungsverhalten dar. In der Grafik sind die beiden untersuchten Präparate (volle Säulen) und deren Mittelwert (schraffiert) dargestellt. Während CT1 und DBA nur geringe Anzahlen an BNC binden, zeigt die MAL-Bindung nun sehr hohe Werte. Das PHA-Lektin bindet unverändert an allen BNC.
Ergebnisse 78
Ergebnisse 79
Ergebnisse 80