4.1 Frühträchtigkeit
4.1.2 Histochemische Analysen
4.1.2.1 Lektinfärbung mit DAB
Die Lektinfärbungen der Epon-eingebetteten Semi-Dünnschnitte von Fetalmembran, teilweise in Assoziation mit Uterusepithel von Tag 20, 23 und 32 post inseminationem (p.i.) wurden mit den folgenden Lektinen durchgeführt:
Dolichos biflorus Agglutinin (DBA) Erithrina cristagalli Agglutinin (ECA) Maackia amurensis Agglutinin (MAL) Phaseolus vulgaris Leukoagglutinin (PHA)
Die Färbung der gebundenen Strukturen erfolgte mit DAB.
Zu Tag 20 der Trächtigkeit wurden die Granula der binukleären Zellen des Trophoblastepithels von allen Lektinen mit Ausnahme von DBA deutlich bis stark angefärbt.
Dabei waren in der DBA-Färbung zwar einige Zellen stärker als das umliegende Gewebe angefärbt, jedoch waren diese morphologisch nicht als BNC zu
Tag 43
Tab. 3: Zusammenfassung der Verteilung von PAG-immunoreaktiven Isoformen im Western Blot
Ergebnisse 54
identifizieren. Auch stellte sich die Färbung der positiven Zellen häufig als Kernfärbung dar.
Mit ECA ließen sich viele Zellen durch intensiv gefärbte Granula in ihrem Zytoplasma eindeutig als BNC ansprechen. MAL zeigt ebenfalls eine selektive zytoplasmatische Anfärbung der BNC. Dabei wurden die größeren BNC intensiver angefärbt als die kleinvolumigen. Ein ganz ähnliches Färbungsmuster zeigte die PHA-Färbung, bei der die spezifische Anfärbung des Zytoplasmas ebenfalls bei den größeren BNC stärker ausfiel als bei den kleineren.
Zu Tag 23 der Trächtigkeit ergaben sich gegenüber Tag 20 nur geringe Änderungen des Färbeverhaltens der Lektine (Abb.13 a-d). DBA zeigte zu diesem Zeitpunkt erste Färbereaktionen an einzelnen BNC, jedoch ohne deutliche Hervorhebung der Granula im insgesamt recht schwach homogen angefärbten Zytoplasma. Die ECA-Färbung zeigte eine allgemein starke Anfärbung des gesamten Gewebes. Trotz der Hintergrundfärbung waren die BNC an ihrem intensiv gefärbten Zytoplasma noch gut zu erkennen.
Nahezu alle BNC wurden von MAL deutlich angefärbt. Dabei ließen sich die zytoplasmatischen Granula gut erkennen. Auch jetzt stellte sich das Färbungsbild von PHA ganz ähnlich dem vom MAL dar, wobei die selektive Anfärbung der Granula noch stärker als bei MAL ausfiel.
Um Tag 32 zeigte sich für die Lektine DBA, ECA und MAL ein deutlich geändertes Färbungsmuster (Abb.14: a-f). DBA färbte zu diesem Zeitpunkt alle als solche erkennbaren BNC stark an, wobei die zytoplasmatischen Granula deutlich sichtbar markiert wurden. Mit den Lektinen ECA und MAL hingegen war eine spezifische Markierung der BNC nicht mehr gegeben. In beiden Präparaten konnte nur unter starker Vergrößerung in wenigen Zellen eine geringgradig stärkere Anfärbung des Zytoplasmas dargestellt werden, die bei MAL aufgrund der insgesamt schwächeren Hintergrundfärbung deutlicher ausfiel. Die PHA-Färbung zeigte ein unverändert BNC-spezifisches Färbungsmuster, bei dem die zytoplasmatischen Granula intensiv markiert wurden.
Ergebnisse 55 4.1.2.2 Doppelfluoreszenzfärbung mit Anti-boPAG-Antiserum und Lektinen Anhand der Doppelfluoreszenzfärbungen war es möglich, eine direkte Zuordnung der Lektin- bzw. CT1- Färbung zu Anti-boPAG-Antiserum -markierten BNC vorzunehmen.
Die Färbungen wurden an Semi-Dünnschnitten derselben Epon-eingebetteten Probenblöcke vorgenommen, von denen auch oben beschriebene Schnitte für die Lektinfärbungen stammen. Die Präparate wurden mit dem CT1-Antikörper, den Lektinen DBA, MAL und PHA und jeweils mit polyklonalem Anti-boPAG-Antiserum als Referenzfärbung für PAG-positive Zellen inkubiert.
4.1.2.2.1 Tag 20
Zu Tag 20 der Trächtigkeit war die Bindung des Anti-boPAG-Antiserums an die Granula der BNC innerhalb der Präparatserie sehr heterogen. Vor allem in Kombination mit dem CT1-Antikörper blieb die Färbung recht unspezifisch, und das Zytoplasma der BNC war nur teilweise stärker gefärbt als die Epithelzellen, ohne granuläre Strukturen aufzuweisen.
CT1- Bindung
Auch die CT1-Färbung zeigte kein BNC-spezifisches Färbeverhalten. Die signalgebenden Strukturen stellten sich vorwiegend als einzelne granuläre Einschlüsse dar, die in den Epithelzellen verteilt lagen. Die stärkeren Signale fanden sich vorwiegend im basalen Bereich des Epithels.
DBA- Bindung
Das Färbungsmuster von DBA zeigte ebenfalls keine spezifische Anfärbung der BNC-Granula. Die wenigen Bereiche mit deutlichen Signalen befanden sich außerhalb der BNC im Epithelgewebe und ließen sich nicht einzelnen Zellen zuordnen.
MAL- Bindung
Im gesamten Epithel waren deutliche MAL-positive granuläre Signale sichtbar, die sich vor allem an der apikalen Epithelseite befanden.
Ergebnisse 56
An einigen Stellen kamen die MAL-positiven Granula verdichtet vor und zeichneten die Umrisse von BNC ab. In wenigen Bereichen konnte deutliche Kolokalisation von MAL-positiven Granula und PAG-positiven BNC gefunden werden.
PHA - Bindung
Am deutlichsten wurden die BNC mit PHA angefärbt. Vermutlich alle BNC waren durch stark spezifische granuläre Färbung von den umliegenden Epithelzellen optisch hervorgehoben.
In diesem Falle konnte die PHA-Färbung besser zur Identifikation der binukleären Zellen herangezogen werden als die üblicherweise als Referenzfärbung genutzte Anti-PAG-Färbung.
4.1.2.2.2 Tag 23
Auch in diesen Präparaten wurde die Bindung des Anti-boPAG-Antiserums von der zweiten Färbungsreagenz beeinflusst. Mit dem CT1 Antikörper zeigte das insgesamt schwach reagierende Anti-boPAG-Antiserum sehr geringe Spezifität für PAG-positive Granula mit starker Hintergrundfärbung.
Als Referenzfärbung konnte auch in dieser Schnittserie die PHA-Färbung aufgrund ihrer hochspezifischen und intensiven Anfärbung der BNC-Granula eindeutigere Ergebnisse als die PAG-Färbung liefern (Abb.15 a-i)
CT1- Bindung
Es war keine Anfärbung von Granula im Cytoplasma der BNC mit CT1 erkennbar.
Die Färbung beschränkte sich auf Hintergrundfärbung und ließ deutlich die Zellkerngrenzen erkennen, in denen stärker gefärbte Einschlüsse sichtbar waren. Die PAG-Gegenfärbung zeigte im Wesentlichen genau das gleiche Färbungsmuster wie CT1; auch hier wurden keine zytoplasmatischen Granula markiert, stärkere Signale zeigten Einschlüsse in den Zellkernen.
DBA- Bindung
DBA zeigte ein ganz ähnliches Färbeverhalten wie CT1, wobei die Zellkerngrenzen deutlicher und das Zytoplasma inhomogener angefärbt erschienen. Die
PAG-Ergebnisse 57 Färbung hierzu zeigte, dass die Bereiche schwächerer DBA-Anfärbung im Zytoplasma PAG-positiveren granulär strukturierten Bereichen entsprechen.
MAL- Bindung
Obwohl auch MAL-positive Kerneinschlüsse zu sehen waren, bildeten die stark gefärbten Granula im Zytoplasma das Hauptmerkmal der Färbung. Diese entsprachen weitestgehend den Bereichen, in denen auch PAG-positive Granula zu sehen waren.
PHA- Bindung
PHA zeigte ein sehr Granula-spezifisches Färbungsbild. Hier beschränkte sich die Färbung auf granuläre Signale des Zytoplasmas der BNC; Hintergrund und Zellkerne erschienen optisch leer. In der Gegenfärbung übertrahlte PHA die PAG-Signale. Schwächere PAG-Signale wurden auch von der Basalmembran und den Zellkernen emittiert. In diesem Fall schien PHA aufgrund seiner Spezifität ein besserer Marker für PAG-positive Granula als der PAG-Antikörper selbst zu sein.
4.1.2.2.3 Tag 32
Zum 32. Tag der Trächtigkeit hatten sich die Färbungsmuster von CT1, DBA und MAL vollkommen verändert (Abb. 16 a-i).
CT1- Bindung
CT1 zeigte eine starke Färbungsreaktion in allen BNC, die auch jetzt nicht deutlich PAG-markiert waren, und vornehmlich an ihren morphologischen Merkmalen, sowie im Vergleich zu ihren PAG-positiven Anschnitten in den Folgepräparaten identifiziert wurden. Unter Verwendung des für die Doppelfluoreszenz geeigneten Lichtfilters, überstrahlten die CT1-Signale die kolokalisierten Signale der PAG-Färbung stark.
DBA- Bindung
Die DBA-Färbung deckte sich mit den deutlichen PAG-Signalen in den BNC; alle PAG-positiven BNC wurden auch von DBA zytoplasmatisch angefärbt.
Ergebnisse 58
MAL- Bindung
Die einzige von MAL angefärbte Zelle ähnelte morphologisch zwar einer BNC, wurde jedoch nicht vom Anti-PAG-Antikörper als solche markiert.
Alle anderen PAG-positiven BNC blieben MAL-negativ. In einem anderen Präparat des selben Materials waren nur zwei von 50 PAG-positiven BNC auch MAL positiv.
PHA- Bindung
Wie auch in den anderen Präparaten zeigte PHA hier eine gleichbleibend starke Färbung der BNC Granula.
4.1.2.2.4 Tag 35 und Tag 43
Die Präparate ab Tag 35 ließen aufgrund ihrer Größe und hoher Anzahl an BNC eine genauere quantitative Auswertung der Färbungsreaktionen zu.
Die Bindungsmuster der eingesetzten Antikörper und Lektine zeichneten in den Präparaten von Tag 35 (n=1) und Tag 43 (n=2) eine ähnliche Tendenz ab und werden deswegen hier zusammen beschrieben.
CT1- Bindung
Die Granula der PAG-positiven BNC wurden auch mit CT1 markiert. Sowohl an Tag 35 als auch an Tag 43 wurden mit Werten über 97 % nahezu alle PAG-positiven BNC vom CT1-Antikörper gebunden.
DBA- Bindung
DBA-Signale konnten im Zytoplasma von 98,5 % der PAG-positiven BNC zum Tag 35, und in 99,1 und 100 % der BNC zu Tag 43 nachgewiesen werden.
Ergebnisse 59
CT1-/Lektinbindung Tag 35 und 43
0 20 40 60 80 100
markierte BNC %
CT1 DBA MAL PHA
MAL- Bindung
Auch die MAL-Bindung folgte einer ab Tag 32 deutlichen Tendenz. Im Gegensatz zu CT1 und DBA zeigte sie jedoch mit Werten unter fünf Prozent angefärbter BNC eine stark reduzierte Bindung an diese Zellen.
PHA- Bindung
Wiederum ohne Veränderung des beständig starken und BNC-spezifischen Färbeverhaltens wurden an beiden Präparaten alle bzw. nahezu alle binukleären Zellen von PHA unter deutlicher Hervorhebung ihrer zytoplasmatischen Granula gebunden.
____Tag 35______ _____Tag 43_____
Abb. 12: CT1- und Lektinbindung zu Tag 35 und 43 Die Grafik zeigt das sehr starke Bindungsverhalten des CT1-Antikörpers und der Lektine Dolichos biflorus Agglutinin und Phaseolus vulgaris Agglutinin im Gegensatz zum Maackia amurensisLektin, welches im Mittel an weniger als 3% der PAG-positiven BNC bindet
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