Material & Methode
Abb. 93: Gorilla Julchen bei der Beprobung.
Tab. 12: Numerische Zuordnung der möglichen Verhaltensweisen mit dem Tennisball sowie deren Definition.
Nr. Art der Nutzung Definition
1 Hand Das Tier versucht mit der Hand, jedoch ohne den Ball dabei in eine der anderen Kategorien passend, zu manipulieren, um an den Inhalt zu gelangen
2 Schütteln Der Ball wird dabei in der Hand gehalten und heftig hin und her bewegt.
Zum Teil wird die andere Hand darunter gehalten
3 Pressen Der Ball wird durch eine der vier Extremitäten gegen einen festen Untergrund gedrückt
4 Klemmen Der Ball bzw. die Bälle werden unter der Achsel, im Nacken oder in der Leiste festgehalten
5 Tragen Der Ball bzw. die Bälle werden mit dem Mund oder der Hand von einem zu einem anderen Ort transportiert
6 Mund Das Tier nimmt den Ball oral auf und manipuliert ihn mit den Lippen oder den Zähnen
7 Spiel Der Ball wird in solitäres Objektspiel, Sozialspiel oder soziales Objektspiel einbezogen
8 Rollen Der Ball wird durch eine der vier Extremitäten auf einer festen Unterlage bewegt
9 Fressen Der Ball wird von einem Tier kontaktiert, während dieses Nahrung aufnimmt
10 Stock Ein Stock oder ein vergleichbarer Holzgegenstand wird zur Manipulation des Balls oder der Bälle eingesetzt
11 Schauen Der Ball bzw. die Bälle werden von einem Tier aus max. einer Körperlänge Entfernung begutachtet
12 Wasser Der Ball wird mit Wasser außen benetzt, bzw. ein geöffneter Ball wird mit Wasser gefüllt
13 Klopfen Der Ball wird rhythmisch von einem der Tiere gegen einen weiteren Gegenstand geschlagen
Ebenfalls wurde das Sozialverhalten aufgenommen, wie bei K1 beschrieben.
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Tab. 13: Anzahl der Speichelproben in Abhängigkeit von Tier und Haltungsbedingung.
Tierart Tierzahl Haltungsbedingung
Pan paniscus 12
Gorilla g. gorilla 10
Pongo abelii 7
Altes Menschenaffenhaus 911 650 597
Neues Menschenaffenhaus 457 311 370
Beschäftigung 503 133 564
Summe Speichelproben 1.871 1.094 1.531
Für alle Speichelproben wurde mittels Enzym-Immuno-Assay (EIA) die Cortisol Konzentration bestimmt (PALME &MÖSTL 1996). Von 437 Proben - 131 Bonobo-, 154 Gorilla- und 118 Orang-Utanproben - erfolgte zusätzlich eine Bestimmung der Cortisonkonzentration (RETTENBACHER ET AL.2004). Die Charakteristika der beiden EIAs können der Tabelle 14 entnommen werden.
Die Kreuzreaktionen des Cortisol EIAs sind bei PALME & MÖSTL (1996) sowie die für den Cortison-Assay bei RETTENBACHER ET AL.(2004)publiziert worden.
Tab. 14: Charakteristika der zwei EIAs.
EIA Cortisol Cortison
Label (DADOO-Biotin gekoppelt an) cortisol-3-CMO
cortisone-20-CMO
Antikörper (AK) (Trägerprotein: Bovinen Serumalbumin.
AK hergestellt in Kaninchen)
cortisol-3-CMO
cortison-21-HS
Standard Cortisol Cortison
Antikörper Arbeitsverdünnung (x 103) 1:100 1:20 Label Arbeitsverdünnung (x 103) 1:1.500 1:5.000 Intraassay-Varriationskoeffizient (n=37) 14,5 15,9 Interassay- Varriationskoeffizient (n=93 bzw. 9) 14,12 18,06
Zusätzlich wurden im Rahmen der Untersuchung weitere Kreuzreaktionen der beiden Assays bestimmt (Anhang III, Tab. A6).
Material & Methode
3.4.1 Speichelbeprobung
Das Studiendesign dieser Untersuchung setzte voraus, dass die Menschenaffen im Frank-furter Zoo bei Aufforderung eigenständig ihre Speichelproben sammelten und aushändig-ten. Zu diesem Zwecke wurden die Menschenaffen mittels (engl.) positive reinforcement training (vgl. Kapitel 3.1.2.a) von den Tierpflegern motiviert, eine Watte entgegenzunehmen, zu kauen und diese zurück zugeben. Zur Speichelsammlung fand die Salivette® (Sarstedt,
#51.1534 Watterolle ohne Präparierung) Anwendung. Zu Beginn des Trainings waren die Tiere bereits mit einer beliebten Kleinigkeit, beispielsweise Trockenobst, einer Traube oder einer Erdnuss entlohnt worden, wenn sie die Salivette lediglich mit den Lippen berührten.
Dieser Vorgang steigerte sich, bis die Menschenaffen, wie nach Vorgabe, die Watte kauten und diese zurückgaben. Manche der Arten, wie beispielsweise Orang-Utans und Bonobos, begriffen diesen Vorgang schneller als die Gorillas. So schluckten die Gorillas zum Teil die Watte herunter oder aber wollten diese gar nicht erst in den Mund nehmen. Um die Attrak-tivität der Watte zu erhöhen, war diese zuvor präpariert worden, indem sie in Zuckerwasser gelegt wurde. Um einem Watterollenmangel entgegen zu wirken, der durch das Abschlucken von Watte durch die Tiere oder andere Umstände auftreten konnte, wurden zusätzliche Watterollen (Kent Dental®, #953565 Gr.2, ø10mm) vorbereitet. Die feuchten Watterollen waren auf einer Plastikunterlage ausgebreitet und im Heizungskeller getrocknet worden.
Während des Beobachtungszeitraumes war im Aufnahmezyklus jedem Individuum der jeweiligen beobachteten Primatenart eine Watterolle gereicht worden. Nach dem Kauen der Watterollen reichten die Tiere sie gegen eine der erwähnten Belohnungen wieder aus dem Gehege heraus. Die gekauten Wattestücke wurden in die Salivetten-Einhänggefäße zurück-gegeben und mit Namen, Uhrzeit und dem jeweiligen Datum versehen und bei -20°C eingefroren. Die Hormonanalyse erfolgte am Department für biomedizinische Wissenschaf-ten/Biochemie der Veterinärmedizinischen Universität Wien.
Zentrifugation
Die Proben waren zunächst aus der Gefriertruhe entnommen und in eine Halterung gestellt worden, bis sie Raumtemperatur erreichten. In einer Zentrifuge „Minifuge RF von Haeraus“
wurden sie 10 Min. bei 1.500g zentrifugiert. Die wässrige Phase war mittels einer Eppendorf
Material & Methode
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Pipette abgenommen und in ein Titertube (BIORAD, Mirco Test Tubes, non steril #223-9390) überführt worden.
3.4.2 Hormonelle Analysen
3.4.2.a Biologische Validierung der verwendeten Assays
Bei der biologischen Validierung wurde ein Moment bzw. eine Situation ausgewählt, bei der davon ausgegangen werden konnte, dass sich die Glucocorticoide im Blut erhöhten. Solche Stressoren können beispielsweise eine Narkose, ein Transport oder die Isolierung einzelner Tiere von ihrer Gruppe sein (MÖSTL ET AL.2002,TOUMA & PALME 2005). Eine weitere häufig genutzte Methode ist ein Testverfahren, bei dem das Adrenocorticotrope Hormon (ACTH) verabreicht wird, um die Cortisolkonzentration im Blut zu steigern (PALME 2005). Diese Methode fand unter anderem auch bei Primaten, speziell auch bei Menschenaffen Anwendung (HEISTERMANN ET AL.2006). In dieser Studie diente zur Validierung zunächst der Umzug der Tiere in das neue Menschenaffenhaus sowie Narkosen bei Gorillas und Orang-Utans.
3.4.2.b Chemische Validierung der verwendeten Assays
Zur chemischen Validierung kann die ‚High performance liquid chromatography‘ (HPLC) herangezogen werden (CEKAN 1979). Bevor die Proben auf die Säule aufgetragen werden konnten, wurden diese zunächst gepoolt, um eine entsprechende Probenmenge zu erhalten.
Bei allen drei Arten wurden dabei ausschließlich die Proben von adulten Tieren verwendet.
Bei den Orang-Utans war der Pool „Weibchen“ von Speichelproben verschiedener Weibchen gebildet worden. Der Probenpool „Männchen“ setzt sich aus Proben von nur einem Tier zusammen. Diese Zusammenstellung galt in gleicher Weise für die Pools der Bonobos und Gorillas. Bei den letzt genannten wurde eine weitere Zusammenstellung von schwangeren Tieren gebildet. Diese basiert bei den Bonobos auf verschiedenen Individuen, wohingegen bei den Gorillas die Proben von nur einem Tier verwendet wurden. Die Proben waren zur Vorreinigung mittels Sep-Pak® C18 extrahiert worden (TESKEY-GERSTL ET AL. 2000). Diesem Schritt folgte das Verdünnen der Speichelproben mit 10ml Wasser und deren Aufgetragen.
Anschließend wurde mit 10ml destilliertem Wasser nachgewaschen und die Proben mit 5ml Ethanol eluiert und anschließend unter einem Stickstoffstrom eingedampft. Diesem folgte
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die Aufnahme der Extrakte in 100µl 50% Methanol. Zur Bestimmung der Polaritätsmarker erfolgte eine Zugabe von 3H-Corticosteron. Die Extrakte wurden mittels HPLC (Novapak C18, 3,9 x 150mm, Milipore Corporation, Milford, MA, USA) aufgetrennt. Diese Separation der Steroide erfolgte bei einem linearen Gradienten von 50-75% Methanol in 40 Min. (Fluss:
1ml/Min.). Es wurden drei Fraktionen pro Minute (jede Fraktion 20 sec.) mittels Fraktions-kollektor gesammelt. Diese Fraktionen wurden 1:5 mit dem im Anhang III beschriebenen Assay-Puffer verdünnt. Die Menge der immunreaktiven Substanzen in den 95 Fraktionen wurden mit dem jeweiligen EIAs quantifiziert. Des Weiteren wurde das Elutionsverhalten der Reinsubstanz von Cortisol und Cortison mittels UV-Detektion (Absorption bei 254nm) gemessen.
Die Durchführung der EIAs sind ‚standard operating procedures‘ (SOPs) und sind im Anhang III zu finden.