Histiotypische Expression einer CD44 Isoform (v6) in primären

-v5

v6

~100 kD

~130 kD

~140 kD

~160 kD

-CD44std

v7/8

97TM1 U1752 H2126

werden konnte, daß ein Antikörpernachweis eine adäquate alternative Methode darstellt, wurden Tumoren unterschiedlichen histologischen Ursprungs mit spezifisch gegen CD44-Isoformen gerichteten Antikörpern gefärbt.

Bevor die Antikörper für eine immunhistochemische Analyse eingesetzt wurden, wurde ihre spezifische Reaktion an Zellextrakten einiger Zellinien getestet und im Western-Blot bestätigt.

Abb. 26 Spezifitätstest der monoklonalen CD44- Antikörper

Western-Blot mit unterschiedlichen CD44 Antikörpern. Zur Testung der Spezifität der käuflichen Antikörper wurde 150µg Ganzzellextrakt jeder Linie auf einem 5% SDS-Gel aufgetragen und die Proteinen nach erfolgtem Gellauf auf einer Nitrocellulosemembran immobilisiert. Die spezifischen Antikörper wurden 1:250 verdünnt, ein Nachweis spezifischer Bindungen erfolgte mit einem biotinylierten Zweitantikörper und DAB als Substrat.

Die Ergebnisse der RT-PCR konnten mit diesem Test bestätigt werden, so daß die Antikörper als hochspezifisch bindend gelten können.

Kryopräservierte und paraffineingebettete Tumoren wurden mit den getesteten Antikörpern auf die Expression von CD44 und einigen varianten Exons dieses Rezeptors untersucht.

Solche Färbungen lassen eine genaue Lokalisation der Antigen-Antikörper-Reaktion zu, da einzelne Zellen angefärbt werden und so eine Auswertung von Tumorzellanteilen selbst

möglich wird. Für die Analysen mit unterschiedlichen Antikörpern wurden Serienschnitte hergestellt, so daß die Untersuchungen eines Tumors in ihrer Lokalisation vergleichbar waren.

Eine Reaktion mit dem gegen die Standardform gerichteten Antikörper konnte im Bindegewebe, in Fibroblasten und Makrophagen, in den Alveoli, Pneumozyten, in

infiltrierenden Makrophagen und entlang des die Bronchien ausstattenden Epithels detektiert werden. Keinerlei Antikörperreaktion zeigte sich dagegen im Knorpelgewebe.

Zusätzlich zu den CD44-Färbungen wurden Schnitte mit einem gegen Ki67-gerichteten Antikörper gefärbt. Das Ki67/MIB1-Protein ist ein in der S/G2-Phase spezifisch auftretendes Nicht-Histon Protein, das dadurch nur in proliferierenden Zellen zu finden ist. Mit Ausnahme von Bronchioalveolarkarzinomen, die nur sehr wenige replizierende Zellen enthalten, erlaubt die Anti-Ki67 gerichtete Färbung die Identifizierung proliferierenden Gewebes und damit eine gute Abgrenzung von Tumorzellen zum Umgebungsgewebe.

Die Auswertung der immunhistochemischen Färbungen an einem großen Teil der untersuchten Tumoren ergab, daß unterschiedliche Tumortypen variable Grade an Immunogenität mit den jeweiligen CD44-Antikörpern zeigten.

So färbten sich Plattenepithelkarzinome und Bronchioalveolarkarzinome deutlich stärker und einheitlicher an als Adenokarzinome. Großzellige Karzinome zeigten häufig nur einen geringen Anteil an angefärbten, positiven Zellen, der 10% der Gesamtzahl aller Tumorzellen unterschritt. Ein solch geringer Anteil das untersuchte Protein exprimierender Zellen wurde in der Auswertung als negativ gewertet. Die untersuchten SCLC-Tumoren färbten sich nicht mit den CD44-Antikörpern an. Karzinoide hingegen zeigten eine starke Reaktion, was auf eine hohe CD44-Expression schließen läßt.

Innerhalb der Tumoren selbst fand sich generell die stärkste Antikörperreaktion an Zellen, die an der Grenze der Tumorinfiltration zu finden waren, während zentrale, im Tumorgewebe liegende Bereiche häufig keine Antikörperreaktion aufwiesen.

Die Tumoren wurden mit den beschrieben Antikörpern gegen unterschiedliche Epitope des CD44-Rezeptors mehrfach gefärbt und lichtmikroskopisch ausgewertet. Gezeigt sind Fotografien typischer immunhistochemischer Färbungen unterschiedlicher histologischer Tumoren mit gegen verschiedene CD44-Isoformen gerichteten Antikörpern (Anti-CD44 Färbungen links und Anti-v6 Färbungen rechts).

Die gewählte mikroskopische Vergrößerung war 160fach. Alle Färbungen wurden mit monoklonalen Antikörpern durchgeführt, und deren spezifische Bindung mit biotinylierten

Zweitantikörpern und AEC als Substrat nachgewiesen. Die Zellkerne sind mit Hämatoxylin gegengefärbt.

Abb. 27 Aufnahmen der Anti-CD44 Färbungen eines Plattenepithelkarzinoms (1655) (links:CD44; rechts:v6)

Abb. 28 Aufnamen eines mit unterschiedlichen CD44-Antikörpern gefärbten Adenokarzinoms (5740) (links:CD44; rechts:v6)

Abb. 29 Fotografien eines großzelligen Tumors mit anti-CD44 Färbung (1469) (links:CD44; rechts:v6)

Abb. 30 Aufnahmen eines anti-CD44 (links) und -v6 (rechts) gefärbten Bronchioalveolarkarzinoms (10578)

Abb. 31 Aufnahmen der CD44-Antikörperfärbungen eines kleinzelligen Tumors (5729)(CD44 links; v6 rechts)

Tumor CD44 std v5 v6 v7/8 Ki67 TNM-Status

klinic. Stag. Grading

(% pos. Zellen) Intensität (% pos. Zellen)

ADC

A 90 +++ - - - 70 T1N1M0 II G1

80 20 + - - - 50 T2N0M0 II G2

81 10 + - - - 30 T4N3M0 IIIB G

97 50 + (+) - + 30 IIIA G2

100 30 + - - + 30 T3N1M0 IIIA G2

117 55 ++ (+) - + 5 T2N0M0 I G2

121 60 + - - - 10 T2N0M0 I G2

122 10 + - - - 5 T2N3M0 IIIB G2

138 30 + - - - 25 T3N2M0 IIIA G3

330 60 +++ (+) - + <5 T3N2M0 I G1

640 25 + - - (+) 40 T3N2M0 IIIA G3

4389 35 + + + - 10 T1N1M0 II G2

5563 0 - - - - 10 T1N0M0 I G2

5740 10 + + + + <1 T2N0M0 II G1

12107 10 + - - - <1 T1N0M0 I G1

15166 15 + - - + <1 T1N0M0 I G2

BAC

31-1 0 - - - 4 T1N0M0 I G1

32-1 0 - + (+) - 1 T1N0M0 I G1

2624 50 +++ + + + <1 T1N0M0 I G1

10578 90 +++ + + + <2 T2N0M0 II G1

10674 40 +++ - + - 2 T2N1M0 III G1

10909 30 +++ (+) + + 10 T3N0M0 II G1

SCLC

93 <5 + - - - 80 T2N1M0 I G4

113 <5 + - - - 80 T2N3M0 I G4

Karzinoid

99 >90 ++ - - - <1 I GX

83 >90 ++ + + - <1 T1N0M0 - GX

353 >90 ++ - - +/- <1 T2N0M0 I GX

476 >90 ++ + - - <1 T1N0M0 - GX

LCC

77 5 + - - - 80 T1N1M0 I G4

87 50 + - - - 60 T3N2M0 IV G4

89 35 + - - + >90 T2N1M0 II G4

109 80 ++ - - - 30 T3N2M0 IIIA G4

570 70 ++ (+) - (+) <5 T2N1M0 II G4

680 10 + - - - <5 T2N3M0 IIIA G4

1469 >60 ++ + + + 40 T3N1M0 III G4

11401 <10 + - + - <5 T1N1M0 II G4

SCC

90 >90 +++ + + + 75 T2N2M0 IIIB G2

112 >90 +++ + + + 60 T2N0M0 I G2

132 >90 ++ + + + n.s. T2N0M0 I G1

323 >90 ++ + + + 40 T2N1M0 II G2

324 >90 ++ + + + 70 T3N1-2M0 II G2

556 >90 ++ + + + 30 T2N0M0 I G1

564 <10 + - - - 20 T2N2M0 IIIA G3

565 80 +++ + + + 20 T2N1M0 I G3

579 >90 +++ + + + 5 T4N3M0 IIIB G3

610 80 +++ + + + n.s. II G2

634 >90 ++ + + + n.s. T2N1M0 II G3

653 >90 +++ + + + 20 T2N3M0 IIIA G3

657 >90 ++ (+) + + 40 T2N2M0 IIIA G1

690 >90 +++ + + + 80 T2N1-2M0 IIIA G3

1134 <5 - - - (+) 10 T2N1-2M0 IIIA G2

1154 80 ++ + + + 60 T3N0M0 II G2

1271 <5 - (+) - - 15 T2N2M0 II G2

1655 >90 +++ + + + 45 T3N0M0 II G2

1720 80 ++ + + + 45 T2N1-2M0 IIIA G3

2229 60 ++ + + + 40 T1N1M0 II G3

2616 10 + + + 10 T2N1-2M0 IIIA G2

6130 0 - - - - 30 T1N1M0 II G2

9165 10 + + + + 10 T2N2M0 IIIA G2

11681 50 ++ + + + 50 T2N0M0 I G2

915-16 50 +++ + + + 20 T1N0M0 I G2

LCC/SCC

552 90 + + + + + T4NX IIIB G4

586 50 + + + + + II G4

1478 70 ++ + + - 30 T3N1M0 III G4

Tab. 19 Immunhistochemischer Nachweis von CD44-Isoformen in Bronchialkarzinomen mit Angabe des durch Ki67-Nachweis erhobenen Proliferationsindexes und klinischer Tumordaten

Die immunhistochemische Untersuchung der Expression unterschiedlicher Epitope des CD44-Rezeptors zeigte, daß ein großer Teil der Tumoren sowohl v5 exprimiert (39/64; 60,9%), v7/8 (37/64; 57,8%) als auch v6 (33/64; 51,6%).

Interessanterweise zeigten vor allem SCC eine Reaktion mit Antikörpern gegen alle untersuchten Epitope (19/25), was den Schluß zuläßt, daß diese drei bzw. vier Epitope (v5, v6, v7/8) häufig co-exprimiert werden. Ebenso zeigten BAC (2/6) und kombinierte Tumoren aus SCC und LCC (Mischtumoren) (2/3) diese Co-Expression aller drei bzw. vier

untersuchten Epitope. Es konnte beobachten werden, daß vor allem in den kombinierten Tumoren häufig nur Zellinseln angefärbt waren, die aber nicht eindeutig histologisch einer bestimmten Tumorform zugeordnet werden konnten. Weiterhin wurde eine kombinierte v5 bis v7/8 Expression in 1/16 ADC, 1/8 LCC aber keinem der 4 Karzinoide gefunden. Die 2 SCLC-Tumoren zeigten keine detektierbare Expression des CD44-Rezeptors.

Der größte Unterschied im Expressionsmuster wurde für das Epitop v6 festgestellt. Während CD44v6 in 20/25 (80%) der SCC und 5/6 (83%) aller Bronchioalveolarkarzinome gefunden wurde, konnte diese Variante nur in 2/8 (25%) der untersuchten LCC und 2/16 (12,5%) aller ADC nachgewiesen werden.

Da Adenokarzinome histologisch sehr eng verwandt mit Bronchioalveolarkarzinomen sind, ergibt sich so eine histologische Unterscheidungsmöglichkeit dieser beiden Tumorgruppen.

% positive Fälle Histologie Anzahl der

Fälle

CD44s CD44v5 CD44v6 CD44v7/8

ADC 16 93,8 37,5 12,5 43,8

BAC 6 66,7 66,7 83,3 50

SCC 25 84,0 88 84 80

LCC 8 75,0 25 25 37,5

LCC/SCC 3 100 100 66,7 100

SCLC 3 33,3 33,3 0 0

Karzinoide 3 100 33,3 33,3 33,3

Tab. 20 Tabellarische Zusammenstellung der Tumorhistologie und Expression der CD44-Isoformen

Im Dokument Expression von Oberflächenrezeptoren beim Bronchialkarziom (Seite 134-142)