3.3 Expression des CD44-Rezeptors in Bronchialkarzinomen
3.3.1 Der CD44-Rezepor wird in Bronchialkarzinomzellinien exprimiert
Lungentumoren zu analysieren, wurde zunächst RNA aus subkonfluent wachsenden Linien isoliert, revers transkribiert und die so erhaltene cDNA für die PCR-Untersuchung eingesetzt.
Zur Expressionsanalyse wurden Primer ausgewählt, die den in jeder Isoform enthaltenen konservierten Bereich, wie in Abb. 23 dargestellt, abdeckten. Diese ließen sich mit spezifisch gegen einzelne variable Exons gerichteten Primern kombinieren, so daß eine Detektion immer von dem untersuchten Exon bis in die konservierte Domäne stattfand. Dieses Verfahren
ermöglichte einen Exon-spezifische RT-PCR-Nachweis. Die Expression des CD44-Gens mit seinen variablen Exons konnte vollständig untersucht werden.
Teilweise zeigte sich, daß mehrere PCR-Produkte unterschiedlicher Länge mit dem selben Primerpaar in einem Reaktionsansatz auftraten. Die detektierten multiplen PCR-Fragmente deuten darauf hin, daß das nachgewiesene Exon in mehreren unterschiedlichen CD44-mRNAs präsent war. Dies ist aufgrund der vielen möglichen, durch den Spleißvorgang bedingten Kombinationen und der Art der gewählten Primer denkbar, da teilweise die Amplifikation des DNA-Fragmentes über mehrere variable Exons erfolgte.
Auch die Menge an transkribierter CD44 mRNA variierte zwischen einzelnen Linien. So zeigten vor allem SCLC- und Adenokarzinomzellinien teilweise nur eine sehr schwache Amplifikationsbande. In drei Linien (1 NSCLC, 2 SCLC) ließ sich keine cDNA für ein CD44 Transkript nachweisen. Auffällig war, daß das Exon v5 ausschließlich von NSCLC-Linien exprimiert wurde.
Abb. 24 Zusammenstellung der RT-PCR-Ergebnisse für die Zellinie 97TM1
Die PCRs wurden mit den beschriebenen Primerkombinationen durchgeführt. Gezeigt ist eine Silberfärbung zur Detektion amplifizierter DNA-Fragmente nach PAGE (6% Gel). GAPDH ist als interne Kontrolle zur
Abschätzung relativer Mengen mit aufgetragen. Die Analyse der variablen Exons zeigte teilweise, daß mehrere das Exon enthaltende Form exprimiert werden. Die CD44std-Primer amplifizieren alle vorkommenden CD44-Formen. Prominent sind hierbei vor allem die als CD44H/CD44s beschrieben Form, die keines der variabel einspleißbaren Exons enthält und die als CD44E beschriebene, epitheliale Form, die die Exons v8 bis v10 einschließt.
M GAPDH v10 v9 v8 v7 v6 v5 v4 v3 v2 CD44s TM
- CD44E
- CD44std
bp
492 369 246
123
-Die Auswertung der RT-PCR Analysen zeigte, daß CD44-mRNA in allen Subtypen der untersuchten Linien zu finden ist, allerdings in Linien kleinzelligen Ursprungs weniger häufig als in Linien nicht-kleinzelliger Abstammung.
Zusätzlich ließ sich beobachten, daß die Exons v8, v9 und v10 in den untersuchten Linien grundsätzlich kombiniert exprimiert werden. Die gemeinsame Expression variabler Stücke ist als epitheliale Form des CD44-Rezeptors beschrieben worden und läßt sich häufig auch in anderen Geweben beobachten.
NSCLC-Linien
SCC LCC ADC
Standard RT-PCR
Temp;
Zyklenzahl
32M1 U1752 97TM1 H103 U1810 H23 H125 H820 H1573 H2009 H2077 H2126
CD44s 59°; 25 +++ ++ +++ +++ +++ + + ++ + ++ - +
TM 59°; 25 ++ ++ ++ ++ +++ + + + + ++ - +
Exon-spezifische RT-PCR
v2 56°; 25 - + + - - - - + - + -
-v3 57°; 25 - ++ ++ - - - - + + - -
-v4 56°; 25 - ++ ++ - - - - + + + - +
v5 56°; 25 - ++ + - - - - + + -
-v6 56°; 25 + ++ + + - - - + - + - +
v7 58°; 25 + ++ + - - - - + + - -
-v8 59°; 25 + ++ +++ + - - - ++ + ++ - ++
v9 59°; 25 + ++ ++ + - - - ++ + ++ - ++
v10 58°; 25 + ++ ++ + - - - ++ + + - ++
Tab. 13 Expression der CD44-Isoformen in nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomzellinien
Die Expressionsstärke wurde ermittelt und aufgeführt wie folgt:
starke Expression: +++
moderate Expression: ++
schwache Expression: +
keine Expression:
-Das Exon v5 wurde ausschließlich von Zellen nicht-kleinzelligen Ursprung exprimiert.
Bei der Analyse der kleinzelligen Linien stellte sich heraus, daß nur drei Linien (37,5%) in der Lage sind, variable Exons einzuspleißen. Hingegen sind in Zellinien nicht-kleinzelligen Ursprungs erheblich häufiger variable Exons nachzuweisen, acht von elf CD44 positive Linien (72,7%) zeigen Isoformen.
SCLC-Linien
H24 H69 DMS79 H82 H146 H510 H526 H841
Standard RT-PCR
Temp;
Zyklenzahl
CD44s 59°; 25 + + ++ - ++ - +
-TM 59°; 25 + + ++ + ++ - -
- Exon-spezifische RT-PCR
v2 56°; 25 - - + - + - -
-v3 57°; 25 - - ++ - ++ - -
-v4 56°; 25 - - ++ - ++ - -
-v5 56°; 25 - - -
-v6 56°; 25 - - ++ - ++ - -
-v7 58°; 25 - - ++ - ++ - -
-v8 59°; 25 + + ++ - ++ - +
-v9 59°; 25 + + ++ - + - +
-v10 58°; 25 + + ++ - ++ - +
-Tab. 14 CD44-Isoformexpression in SCLC-Bronchialkarzinomzellinien
Die Expressionsstärke wurde ermittelt und ist wie folgt aufgeführt:
starke Expression: +++
moderate Expression: ++
schwache Expression: +
keine Expression:
-Die RT-PCR Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:
NSCLC SCLC
Standard RT-PCR
CD44s 11/12 91,7 % 5/8 62,5 %
TM 11/12 91,7 % 5/8 62,5 %
Exon spezifische RT-PCR
v2 4/12 33,3 % 2/8 25 %
v3 4/12 33,3 % 2/8 25 %
v4 6/12 50 % 2/8 25 %
v5 4/12 33,3 % 0/8 0 %
v6 7/12 58,3 % 2/8 25 %
v7 5/12 41,7 % 2/8 25 %
v8 8/12 66,7 % 5/8 62,5 %
v9 8/12 66,7 % 5/8 62,5 %
v10 8/12 66,7 % 5/8 62,5 %
Tab. 15 Zusammenfassende Auswertung der CD44-Expressionsergebnisse
Um die Translation der nachgewiesenen CD44-Transkripte zu bestätigen, wurden an den untersuchten Zellinien die Epitope v5, v6 und v7/8 des CD44-Rezeptors mit monoklonalen Antikörpern nachgewiesen. Dazu wurden subkonfluente, adhärent wachsende Zellen auf Objektträger ausgesät bzw. von Suspensions-Linien Zytospins hergestellt, an denen der Antikörper-Nachweis erfolgte.
Die Zellen auf den Objektträgern wurden fixiert, die endogene Peroxidase geblockt und mit jeweils Epitop-spezifischen Antiseren über Nacht bei 4°C inkubiert. Der Nachweis von spezifischen Bindungen erfolgte mit einem biotingekoppelten Zweitantikörper und AEC als Substrat. Die Zellen wurden anschließend entweder mit Hoechst 33258 oder mit Hämatoxylin gegengefärbt. Es wurden in drei unabhängigen Experimenten von jeder untersuchten Zellinie mit jedem Antikörper Objektträger gefärbt. Die Auswertung erfolgte am Lichtmikroskop.
NSCLC-Linien
SCC LCC ADC
AK gegen 32M1 U1752 97TM1 H103 U1810 H23 H125 H820 H1573 H2009 H2077 H2126
CD44s ++ ++ ++ +++ ++ + + ++ + + - +
v5 + + + - - - - + + - -
-v6 + - + - - - - + - - - +
v7/8 + + + + + ++ ++ ++ + + - +
Tab. 16 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen nicht-kleinzelliger Zellinien mit CD44 Epitop-spezifischen Antikörpern
SCLC-Linien
AK gegen H24 H69 DMS79 H82 H146 H510 H526 H841
CD44s - + ++ - + - +
-v5 - - -
-v6 - - + - + - -
-v7/8 + + + - + - +
-Tab. 17 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen kleinzelliger Zellinien mit gegen CD44-Isoformen gerichteten Antikörpern
Die Auswertung der immunhistochemischen Färbungen zeigte, daß 11/12 NSCLC Linien und 4/8 SCLC Linien den CD44-Rezeptor exprimieren. Auch konnten die RT-PCR Analysen bestätigt werden, daß die Epitope v7/8 die am häufigsten exprimierten variablen Exons der untersuchten Bronchialkarzinomzellinien sind. Ebenso ließ sich das Ergebnis der RT-PCR bestätigt werden, daß das Exon v5 nur von nicht-kleinzelligen Zellinien exprimiert wird.
Exon-spezifische Antikörper NSCLC SCLC
CD44s 11/12 91,7 % 4/8 50 %
v5 5/12 41,7 % 0/8 0 %
v6 4/12 33,3 % 2/8 25 %
v7/8 11/12 91,7 % 5/8 62,5 %
Tab. 18 Tabellarische Zusammenfassung der immunhistochemischen Ergebnisse
Mit wenigen Ausnahmen konnten die RT-PCR Ergebnisse immunhistochemisch bestätigt werden.
Unterschiedliche Ergebnisse traten vor allem in solchen Fällen auf, in denen mit Hilfe der PCR nur eine sehr schwache Expression des Transkripts nachweisbar war; hier detektierten die Antikörper in einigen Fällen kein Protein. So waren zwar in den Linien NCIH82 und -H24 mRNA für den CD44 Rezeptor nachweisbar, (eingeschränkt in der -H82 Linie), jedoch gelang kein immunhistochemischer Nachweis mit einem gegen den extrazellulären Teil von CD44 gerichteten Antikörper. Ebenso ließ sich in den Linien NCIH103, H1573, H1752 und -H2009 mRNA des varianten Exons v6 detektieren, ein immunhistochemischer Nachweis gelang jedoch nicht.
In der Zellinie NCI-H82 gelang ausschließlich ein mRNA Nachweis der
Transmembrandomäne. Ein Fehlen des vollständigen CD44 Rezeptors ist somit
wahrscheinlich. In Fall der Zellinie NCI-H24 konnte zwar der Rezeptor nicht mit einem gegen CD44 gerichteten Antikörper nachgewiesen werden, jedoch gelang ein Rezeptornachweis mit einem Epitop-spezifischen Antikörper. Der fehlende Nachweis läßt sich mit einem
Nichterkennen des nicht gegen spezifische Epitope gerichteten Antikörpers erklären.
Da in den nicht-kleinzelligen Zellinien U1752, NCI-H103 und -H2009 eine mRNA Expression des Exons v6 belegbar war, eine Isoform des Rezeptors mit v6 jedoch nicht nachgewiesen werden konnte, kann dies u.a. bedeuten, daß die Translation der v6
beinhaltenden mRNA unterdrückt wird. Daß die Transkription eines Gens nicht zwangsläufig zur Synthese des Proteins führt, ist ein Phänomen, das vielfach beobachtet wird.
Andere differierende Ergebnisse betreffen das Vorkommen einer positiven Immunhistochemie ohne entsprechenden mRNA-Nachweis. Da die Amplifikation der mRNA Transkripte in der RT-PCR auf 25 Zyklen limitiert war, sind sehr geringe Mengen an cDNA nicht unbedingt nachweisbar bzw. spielen evtl. vorhandene Inhibitoren im Reaktionsansatz eine wichtige Rolle. So ließ sich in der Zellinie EPLC 32M1 immunhistochemisch das Epitop v5 ebenso wie in den Linien NCI-H125 und U1810 die Epitope v7/8 nachweisen, ohne das eine mRNA-Expression belegt werden konnte.
Zusammenfassend läßt sich auf Grund der RT-PCR Analysen und der immunhistochemischen Färbungen festhalten, daß die Mehrzahl der Linien, unabhängig von ihrem histologischen Ursprung, das CD44-Gen transkribieren und das Protein synthetisieren.