EGF/Axl--Kinase Rezeptorkonstrukt hat keinen

werden chimäre Rezeptoren konstruiert. Solche Chimären bestehen aus einem extrazellulären Teil eines Rezeptors, dessen Ligand in ausreichender Menge zur Verfügung steht, einer Transmembrandomäne und der Kinasedomäne des zu untersuchenden Rezeptors. Wird nun ein solcher Rezeptor in Zellen transfiziert, läßt sich durch Zugabe des Liganden die

Kinasedomäne aktivieren und ein meßbarer, auschließlich durch die Kinasedomäne des zu untersuchenden Rezeptors vermittelter Effekt studieren. Dabei muß, um Artefakte

auszuschließen, sowohl die Funktionalität des Rezeptorchimärs wie auch die Abwesenheit des die extrazelluläre Domäne stellenden Rezeptors in den Zellen gewährleistet sein.

Ein solches chimäres Rezeptorkonstrukt aus EGF-Rezeptor und Axl-Kinase wurde breites von anderen Arbeitsgruppen zur differenzierten Klärung der zellulären Funktion von Axl in der

Myelopoese in eine myeloide Vorläuferzellinie transfiziert. Die gewählten 32D Zellen, eine IL-3 abhängig wachsende Zellinie, konnten Wachstumsfaktor-unabhängig wachsen, wenn sie die (aktivierte) Axl-Kinase exprimierten. Die Wildtyp-Axl-Kinase selbst ließ diese Zellen nicht IL-3 unabhängig wachsen und verstärkte auch nicht ihr Überleben unter Abwesenheit des Wachstumsfaktors. Allerdings ließ sich sowohl bei Zellen, die mit dem Wildtyp-Axl-Gen wie auch mit dem chimären Rezeptorgen transfiziert wurden, eine Unempfindlichkeit gegen eine Zelldichtearretierung in G1 beobachten. Diese Zellen wiesen auch im Vergleich mit der Ausgangslinie und Leervektor-transfizierten Zellen ein größeres Zytoplasma auf und zeigten Anzeichen einer Differenzierung zu Promyelozyten und Myelozyten. Ein transformierter Phänotyp war aber, wie schon der mitogene Effekt der Kinase, abhängig von der Axl-Kinase-Aktivierung durch den Liganden (McCloskey et al., 1994).

Da über die Wirkung der Axl-Kinase im Bronchialkarzinom nichts bekannt war, wurden zur Klärung unter anderem einige der zellbiologischen Studien ebenfalls am Beispiel eines chimären Rezeptormoleküls durchgeführt. Dieses war aus der extrazellulären Domäne des EGF-Rezeptors und der Transmembrandomäne und Kinasedomäne des Axl-Rezeptors konstruiert. Der Einfluß der Axl-Kinaseaktivität konnte so in Stimulationsexperimenten untersucht werden, da für Stimulationsversuche des Wildtyprezeptors kein rekombinantes Gas6 zur Verfügung stand. Das Chimär war so konstruiert, daß die Axl-Kinase durch Bindung von EGF an die extrazelluläre EGF-Rezeptordomäne aktiviert wird (Braunger et al., 1998).

Damit war die Axl-Kinaseaktivität durch Zugabe von EGF regulierbar. Die

Funktionsfähigkeit des Chimärs, die Kinasedomäneaktivierung nach EGF-Stimulation und Dimerisierung des Rezeptors, wurde durch die Arbeitsgruppe von J.W.G. Janssen (Braunger et al., 1998) - der die Expressionsvektoren freundlicherweise zur Verfügung stellte - und Untersuchungen innerhalb der Arbeitsgruppe mit Hilfe von Autophosphorylierungsassays gezeigt. Die Kinaseaktivierung ist damit auch unabhängig vom Vorhandensein des pp190 Proteins, das als notwendig für die Aktivierung des Wildtyprezeptors postuliert wird.

Die Verwendung eines solchen Rezeptorchimärs verhindert zusätzlich einen störenden Einfluß von endogenen Gas6 und die bei einer Stimulation des Wildtyp-Axl-Rezeptors nicht auszuschließende Wirkung auf endogen exprimierte weitere Axl-RTK-Familienmitglieder.

Alle transfizierten Bronchialkarzinomzellinien waren EGF-Rezeptor negativ, so daß auch hier kein Effekt durch Zugabe von EGF auf einen endogen vorhandenen EGF-Rezeptor zu

erwarten war.

Um eine Wirkung des Expressionsvektors allein auszuschließen, wurden die Zellinien zur Negativkontrolle mit dem leeren Expressionsvektor transfiziert. Diese Zellen zeigten nach EGF Stimulation keine Induktion der Proliferation. Allerdings konnte bei allen transfizierten Zellinien ein leicht zytotoxischer Effekt nach EGF-Zugabe beobachtet werden, der aber zu keiner Beeinträchtigung der Proliferation der überlebenden Zellen führte. Abgesehen von dieser Wirkung auf die Zellen konnte kein Unterschied in der Proliferationsrate zwischen stimulierten und unstimulierten Leervektor-transfizierten Zellen beobachtet werden, so daß der Expressionsvektor allein keinerlei Effekt auf das Proliferationsverhalten hatte. Damit können die Ergebnisse der Wachstumskinetiken der mit dem Chimärkonstrukt transfizierten Zellen auf einen Effekt des eingebrachten Rezeptors zurückgeführt werden.

Die Wachstumskinetiken der mit dem Chimärrezeptor transfizierten Zellen zeigte ebenso wie die der Leervektor-Zellen einen leicht zytotoxischen Effekt des EGFs direkt nach Zugabe. Die Wachstumskurven der stimulierten und unstimulierten Zellen unterschieden sich im weiteren Verlauf der Untersuchung nur marginal, so daß das transfizierte Rezeptorkonstrukt keinen mitogenen Effekt auf die Zellproliferation der untersuchten Zellen hatte (siehe Abb. 19, Abb.

20 und Abb. 21).

Da die Funktionsfähigkeit des verwendeten Chimärs demonstriert wurde, bedeutet dieser Befund, daß die Axl-Kinase in Bronchialkarzinomzellinien keinen Effekt auf die

Zellproliferation hat. Eine Wirtszell-spezifische Wirkung von Axl ist in der Literatur vielfach beschrieben worden, so daß Axl zwar die Proliferation von Fibroblasten (3T3-Zellen),

Schwannzellen und Leukämiezellen stimuliert (Goruppi et al., 1996; Fridell et al., 1996; Li et al., 1996), diese Wirkung aber auf Bronchialkarzinomzellen nicht hat. Dies deckt sich mit Befunden aus der Untersuchung glatter Muskelzellen, die ebenfalls keine

Proliferationsinduktion zeigten (Fridell et al., 1998).

Eine solche Aussage ist aber nicht uneingeschränkt zu machen, da mit einem ähnlichen Rezeptor/Axl-Kinase-Konstrukt (Extrazellular- und Transmembrandomäne des

EGF-Rezeptors, Axl-Kinasedomäne) in IL-3 Zellen beobachtet wurde, daß diese Zellen nach Transfektion und Stimulation eine von Wachstumsfaktor unabhängige Proliferation aufweisen. Wildtyp-Axl-RTK transfizierte Zellen hingegen zeigten diesen Effekt nicht.

Ursächlich hierfür konnte gezeigt werden, daß das chimäre Konstrukt andere intrazelluläre Signaltransduktionswege als die Wildtyp Axl-RTK anschaltet. Eine artifizielle Wirkung des chimären Rezeptorkonstruktes ist also nicht auszuschließen.

Das durch die Expression und Aktivierung des Chimärs in IL-3 Zellen induzierte

Zellüberleben und der beobachtete mitogene Effekt waren abhängig von der Ras/extrazellulär Signal regulierten Proteinkinase (ERK)-Kaskade. Die verschiedenen Funktionen,

Apoptoseschutz bzw. Proliferationsinduktion, von Axl wurden dabei durch unterschiedliche Schwellenwerte der Ras/ERK-Aktivierung hervorgerufen (Fridell et al., 1996). Obwohl der Phosphatidylinositol 3 Kinase-Weg durch des Chimär aktiviert werden kann, schien dieser entbehrlich für die beobachtete biologische Wirkung der Axl-Kinase.

Ist aber eine Ras/ERK-Aktivierung nicht gegeben, so läßt sich durch Gas6 in Axl-Wildtyp-exprimierenden Zellen weder die Apoptose blockieren noch Proliferation induzieren.

Überhaupt scheint der Ras/ERK-Signalweg nicht von einer Gas6-Axl-Interaktion induziert zu werden, obwohl der Rezeptor durch sie phosphoryliert wird.

Die Ursache für die unterschiedliche Wirkung von chimärem Rezeptor und Wildtyp-Axl könnte der Aufbau der Extrazellulardomäne sein, der evtl. entscheidend für die Wahl des Signaltransduktionsweges ist. Es konnte gezeigt werden, daß chimäre Rezeptoren

Homodimere bilden, der Axl-Rezeptor aber evtl. auf eine Heterodimerisierung zur Entfaltung seiner Wirkung angewiesen ist. Es ist ebenso denkbar, daß die beobachteten Effekte beide durch die Axl-Kinase vermittelt werden können, jedoch beim Wildtyprezeptor durch unterschiedliche Liganden hervorgerufen werden. Da nur Gas6 bislang als physiologischer Ligand für Axl beschrieben wurde, könnte das chimäre Rezeptorkonstrukt den Effekt eines bislang unbekannten Liganden nachahmen, denn der mitogene bzw. transformierende Effekt beider Konstrukte (Chimär; Wildtyp) ist völlig unterschiedlich (Apoptoseschutz,

Proliferationsinduktion). Die extrazelluläre Domäne eines chimären Rezeptors scheint somit entscheidend die intrazelluläre Antwort verändern zu können (Fridell et al., 1996), auch unphysiologische Reaktionen eines solchen Rezeptors sind nicht auszuschließen.

In wie weit die unterschiedliche Konstruktion der Chimärrezeptoren (die in dieser Arbeit verwendeten besitzen die Transmembrandomäne des Axl-Rezeptors, die in der Literatur untersuchten die des EGF-Rezeptors) eine entscheidende Rolle auf die Aktivierung und Wirkung dieses Chimärs spielt, ist spekulativ. Da aber schon der extrazelluläre Teil eine entscheidende Rolle für die angeschaltete Signaltransduktionskaskade spielt, ist dieser Aspekt nicht außer Acht zu lassen. Es ist aber davon auszugehen, daß ein aus mehren Axl-Anteilen bestehendes Konstrukt eine physiologischere Übertragung wiedergibt als ein nur mit der Kinasedomäne versehenes. Es bleibt fraglich, ob das chimäre Rezeptorkonstrukt die

physiologische Aufgabe von Axl übernehmen kann und ob Befunde über die Wirkung eines

solchen Konstruktes uneingeschränkt zu übertragen sind. Die Ergebnisse von Versuchen mit einem solchen Konstrukt können jedoch Hinweise auf eine Wirkung liefern und sind deshalb durchaus zu beachten.

Wie Ergebnisse zeigten, die nach Abschluß der Experimente für diese Arbeit gewonnen wurden, wird von dem chimären Konstrukt vor allem der Phosphatidylinositol-3 Kinase Weg angeschaltet, wie es in der Literatur (McCloskey et al., 1994; Fridell et al., 1996) beschrieben worden ist. Ob dieser Weg von der Wildtyp-Kinase ebenfalls angeschaltet wird, ist fraglich, da eine Beteiligung des MAP-Kinaseweges in der Literatur beschrieben ist (Bellosta et al., 1997). Für die verschiedenen Wirkungsweisen von Axl werden unterschiedliche

Signaltransduktionswege verantwortlich gemacht. So wird diskutiert, ob der mitogene Effekt über den PI3-Kinase Weg vermittelt wird und der Schutz vor Apoptose über die Src-Kinase (Goruppi et al., 1997). Andere Arbeitsgruppen sehen ebenfalls eine mitogene Antwort nach Aktivierung der Axl-Kinase über den PI3-Kinase-Weg (McCloskey et al., 1994: chimäres Konstrukt aus Ratten-EGF-R und humaner Axl-Kinase). Dies würde wiederum bedeuten, daß das stimulierte chimäre Rezeptorkonstrukt in der Lage sein sollte, einen mitogenen Effekt zu vermitteln. Diese Hypothese wird unterstützt durch die Beobachtung, daß eine starke

Überexpression von chimären EGF-R/Axl-Konstrukten durch homophile Bindungen auch zu einer Aktivierung führt (Fridell et al., 1996). Weitere Publikationen berichten jedoch von einer Beteiligung des MAP-Kinaseweges bei der Induktion der Proliferation (Goruppi et al., 1996: endogenes Axl der Maus stimuliert mit rekombinantem humanem Gas6; Fridell et al., 1996: chimäres Konstrukt aus Ratten-EGF-R und humaner Axl-Kinase über ras/ERK).

Da in den Bronchialkarzinomzellinien kein proliferativer Effekt beobachtet wurde, ist davon auszugehen, daß die Axl-Kinase unter den gewählten Bedingungen keinen mitogenen Effekt auf Bronchialkarzinomzellinien hat.

4.3.1.6 Keine mitogene Wirkung von endogen exprimiertem Gas6 auf