Gelelektrophoresen

Elektrische Felder üben auf geladene Teilchen eine Kraft aus, die abhängig ist von der Gesamtladung des Teilchens und der Stärke des wirkenden Feldes. Die wirkende Kraft führt zur Wanderung des Teilchen, dessen Mobilität bei gegebener Ladung und Feldstärke von ihrer Größe und Form und der Durchlässigkeit der Matrix abhängig ist, da Reibung der Mobilität entgegenwirkt. Aufgrund unterschiedlicher Mobilität können Teilchen durch eine

Gelelektrophorese voneinander getrennt werden. Die Laufgeschwindigkeit von DNA in einem Spannungsfeld verhält sich proportional zur Größe des Fragmentes.

2.4.3.8.1 Horizontalgelelektrophorese

In Agarosegelen können schnell und einfach DNA-Fragmente nach ihrer Größe und ihrer Konformation, linear, verdrillt, bzw. superverdrillt, aufgetrennt werden. Dazu wird ein horizontales Gel gegossen, dessen Anteil an Agarose sich nach der zu erwartenden Fragmentgröße richtet. Je kleiner ein Fragment ist, desto höher sollte die

Agarosekonzentration sein. So lassen sich Fragmente zwischen 100 und 1200 bp am besten in

einem 1 bis 1,5 % Agarosegel auftrennen. Zur Herstellung eines solchen Geles wird eine entsprechende Menge Agarose eingewogen, mit 1x TAE-Puffer vermischt und durch Aufkochen schlierenfrei gelöst. Nach Abkühlen auf ca. 60°C wurden 2µl/100ml

Ethidiumbromidlösung (0,1% in H2O) hinzugefügt, vermischt und in einen entsprechenden Gelschlitten gegossen. Durch die Zugabe von Ethidiumbromid ist es möglich, da

Ethidiumbromid zwischen die Basenpaare doppelsträngiger DNA interkaliert, DNA unter UV-Licht sichtbar zu machen. Die aufzutragenden Proben wurden mit Probenpuffer versetzt, die Elektrophorese der Fragmente erfolgte bei 80V für ca. 1,5 Stunden. Das Gel wurde anschließend auf einem UV-Transilluminator ausgewertet.

2.4.3.8.2 PAGE

In Polyacrylamidgelen können Fragmente, die eine sehr ähnliche Größe haben, noch gut voneinander getrennt werden. Zusätzlich lassen sich durch die Polyacrylamid-Elektrophorese (PAGE) geringere Mengen an DNA detektieren als in Agarosegelen. Die Matrix von

Polyacrylamidgelen besteht aus Acryamidpolymeren, die über N´N´-Methylbisacrylamid quervernetzt sind. Die Durchlässigkeit der Gelmatrix hängt von der Konzentration der Polyacrylamid-Monomere und der Quervernetzung, also von der Konzentration der bifunktionellen Gruppe ab. Ein 6% Gel enthielt folgende Bestandteile:

Menge Komponente

2,5ml 10x TBE

10ml Acrylamid/Bisacryl (30%)

37,5ml H₂O

500µl APS (10%)

50µl TEMED

Der Ansatz wurde durchmischt und zwischen zwei vorbereitete Glasplatten gegossen. Nach erfolgter Polymerisation wurde das Gel in die Elektrophoreseapparatur eingespannt und mit 1x TBE-Laufpuffer bei 80V ca. 20min unter Spannung gesetzt. Die aufzutragenden Proben wurden in Ladepuffer aufgenommen und ohne anliegende Spannung aufgetragen. Der Einlauf der Proben ins Gel erfolgte bei 80V, danach wurde eine Spannung von 120V angelegt für ca.

1,5 Stunden. Abhängig von einer evtl. radioaktiven Markierung der Proben wurden die Gele getrocknet und auf einem Röntgenfilmes exponiert bzw. silbergefärbt.

2.4.3.8.3 Denaturierende DNA-Gele (Sequenzgele)

Sequenzgele bestehen aus einer speziellen Gellösung, die sich durch eine hohe Bandenschärfe auszeichnet. Um Sekundärstrukturen in den DNA-Fragmenten zu vermeiden, wird dem Gel denaturierender Harnstoff zugefügt, so daß die Fragmente ausschließlich nach ihrer Länge aufgetrennt werden. Da Sequenzgele, um eine besonders deutliche Schärfe zu haben, sehr dünn sind, muß, zum besseren Ablösen des Gels von der Glasplatte, eine der beiden

Glasplatten mit Dimethylchlorsilan eingerieben werden. Für den Gel-Mix wurden angesetzt:

6%iges denaturierendes Polyacrylamidgel 200ml AA/BA (30%)

100ml 10x TBE 420g Harnstoff ad 1000ml mit H2O

Die Lösung wurde filtriert und entgast und die Polymerisation mit 1ml APS (10%) und 5µl TEMED gestartet. "Haifischzahnkämme" wurden zunächst mit der Flachseite in die

Gellösung gesteckt, nachdem sie mit APS benetzt wurden. Der Probenauftrag erfolgte nach Polymerisation in die durch die Kammzähne gebildeten Taschen. Die Elektrophorese erfolgte bei 50 W (max. 65W) und 1500mA für vier bis sechs Stunden.

2.4.3.8.4 SDS-Gelelektrophorese

Bei der SDS-Gelelektrophorese werden Proteine nur nach ihrem Molekulargewicht und nicht nach ihrer Ladung aufgetrennt. Dazu werden die Proben mit Natriumdodecylsulfat (SDS) denaturiert und mitβ-Mercaptoethanol reduziert. SDS bindet mit seinen aliphatischen Schwänzen an hydrophobe Regionen in Proteinen und führt somit viele negative Ladungen ein, welche die eigentliche Ladung des Proteins unwichtig werden lassen. Die Mobilität von Proteinen in einem SDS-Gel hängt also nur noch von ihrer Größe und nicht mehr von ihrem isoelektrischen Punkt ab. Die Proben werden dazu mit SDS-Probenpuffer vermischt und für 5min bei 95°C erhitzt.

Denaturierende SDS-Proteingele bestehen aus zwei Teilen, einem Sammelgel und einem Trenngel. Das Sammelgel dient der Konzentration der Proteine auf ein minimales Volumen (Ionenverhältnisse), so daß alle Proteine gleichzeitig in das Trenngel einlaufen können. Das Trenngel dient dann der Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht. Diese Zweiteiligkeit macht es nötig, daß zuerst in vorbereitete Glasplatten das Trenngel gegossen

wird und dieses überschichtet wird mit Butanol, um bei der Polymerisation eine glatte Oberfläche zu erhalten. Ist das Trenngel dann vollständig polymerisiert, wird das Butanol verworfen und die Oberfläche mit Wasser gereinigt. Auf das Trenngel wurde nun das Sammelgel gegossen, in das auch der zum Erhalt von Auftragstaschen ein Kamm gesteckt wurde. Nach Polymerisation des Sammelgels wurde das Gel in eine vertikale Gelapparatur mit 1x SDS-Laufpuffer gespannt und die vorbereiteten Proben aufgetragen.

Ein SDS-Gel hat folgend Zusammensetzung:

Komponente Trenngel 5% Trenngel 7,5% Trenngel 10% Sammelgel

0,75M Tris pH 8,8 15ml 15ml 15ml /

0,625M Tris pH 6,8 / / / 3ml

H₂O 10ml 7,5ml 5ml 9,45ml

AA/BA (30%) 5ml 7,5m 10ml 2,55ml

10% SDS 300µl 300µl 300µl 150µl

10% APS 300µl 300µl 300µl 75µl

TEMED 15µl 15µl 15µl 7,5µl

Für den Probenlauf durch das Sammelgel wurde eine Stromstärke von 27mA angelegt, während des Laufes durch das Trenngel diese auf 35mA erhöht. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Sammelgel, da es keine Proteine enthielt, entfernt.