10 Anhang
10.2.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Feste Medien Standart-I-Nähragar
zur Bestimmung der Gesamtkeimzahl Zusammensetzung (g/l):
Pepton 15,0
Hefeextrakt 3,0 Natriumchlorid 6,0
D-(+)-Glucose 1,0 Agar-Agar 12,0 15 min. bei 121 °C autoklavieren pH: 7,5 + 0,2 bei 25 °C
OCLA-Agar
Selektivmedium zur Identifizierung und Differenzierung von L. monocytogenes und anderen Listeria ssp. aus Lebensmitteln.
Zusammensetzung (g/l):
Pepton 18,5 Hefeextrakt 4,0 Natriumchlorid 9,5 Natriumpyruvat 2,0 Lithiumchlorid 15,0 Maltose 4,0 X-glucosid Chromogene Mischung 0,2
Agar 14,0 15 min. bei 121 °C autoklavieren pH: 7,2 ± 0,2 bei 25 °C
Chromogene-Listeria-Selektiv-Supplement Zusammensetzung (g/l):
Nalidixinsäure 0,02
Polymixin B 76,700 IU
Ceftazidim 0,02 Amphotericin 0,01
Chromogen-Listeria-Differential-Supplement Zusammensetzung (g/l):
Lecithin-Lösung 40 ml
Flüssige Medien
Sterile physiologische Kochsalzlösung (NaCl)
Zur Herstellung der Verdünnungsreihen bei der Probenaufbereitung Zusammensetzung (g/l):
Aqua dest 1000,0
Natriumchlorid 8,5
Pepton aus Casein 1,0
15 min. bei 121 °C autoklavieren
Brain Heart Infusion-Bouillon (BHI)
Zur Anzüchtung des Impfstammes von Listeria monocytogenes Zusammensetzung (g/l):
Nährsubstrat
(Hirn-, Herzextrakt und Peptone) 27,5
D(+)-Glucose 2,0 Natriumchlorid 5,0 di-Natriumhydrogenphosphat 2,5
15 min. bei 121 °C autoklavieren
Fraser-Anreicherungsbouillon
Zur selektiven, zweistufigen Anreicherung von Listeria ssp. aus Lebensmitteln und Umweltmaterial.
Zusammensetzung (g/l):
Proteose-Pepton 5,0 Caseinpepton 5,0 Fleischextrakt „Lab-Lemco“ 5,0
Hefeextrakt 5,0 Natriumchlorid 20,0 Dinatriumhydrogenphosphat 12,0
Kaliumdihydrogenphosphat 1,35
Äsculin 1,0 Lithiumchlorid 3,0 15 min. bei 121 °C autoklavieren pH: 7,2 ± 0,2 bei 25 °C
Fraser-Selektiv-Supplement Zusammensetzung (je Fläschchen) Selektivsupplement:
Nalidixinsäure 10,0 mg
Acriflavin 12,5 mg
Ammoniumeisen(III)-citrat-Supplement:
Ammoniumeisen(III)–citrat 500,0 mg
Geräte und Verbrauchsmaterialien
aw-Kryometer Fa. Nagy Messsysteme GmbH, Gäufelden Brutschrank 30 °C Fa. Heraeus, Hanau
Brutschrank 37 °C Fa. Memmert, Schwabach High Pressure Food Processor
SO 12644
Fa. Engineered Pressure Systems International NV, Temse, Belgien
Hochdruckanlage TY HDS 08-003
Fa. Uhde High Pressure Technologies GmbH, Hagen
Klimakammer Fa. VIESSMANN Werke, Allendorf
Muffelofen Fa. Heraeus, Hanau
pH-Meter Fa. Knick, Berlin
Photometer (Typ CE1021) Fa. Cecil instruments Ltd., Cambridge, England Photometer Heλios Fa. Unicam, Cambridge, England
Spektrophotometer Fa. minolta Camera Co. Ltd., Osaka, Japan Sterilisationsschrank Fa. Memmert, Schwabach
Stomacher 400 Fa. Seward, Thetford, England Trockenschrank Fa. Heraeus, Hanau
Vakuumbeutel 13 x 18 cm Fa. dagema eG, Willich
Vakuummaschine Typ VC999 Fa. Inauen Maschinen AG, Herisau, Schweiz Zerkleinerungsmaschine
(Typ WD 114)
Fa. Seydelmann, Stuttgart
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Zusammenhang zwischen Oxidationszustand des Eisens im
Myoglobinmolekül und der Farbe des Produktes modifiziert nach JOSUPEIT
(2006) 6
Abb. 2: Koordinatenachsen des CIELAB-Systems modifiziert nach KLETTNER und
STIEBING (1980) 7 Abb. 3: Listeria monocytogenes 14
Abb. 4: Intrazellulärer Lebensraum und Vermehrung von Listeria monocytogenes
modifiziert nach HOF et al. (1994): 15 Abb. 5: OCLA-Agar (OXOID 2008) 19 Abb. 6: An das RKI übermittelte Listeriose-Fälle nach Form, Altersgruppen und
Jahren (2001–2005) (RKI 2006) 24 Abb. 7: Schematischer Aufbau einer Hochdruckanlage modifiziert nach UHDE HIGH
PRESSURE TECHNOLOGIES (2007) 27 Abb. 8: Unbehandelte Listeria monocytogenes-Zelle in Citratpuffer (pH 5,6) (x
30.000) (RITZ et al. 2002) 37 Abb. 9: Hochdruckbehandelte (400 MPa, 10 min) Listeria monocytogenes-Zelle in
Citratpuffer (pH 5,6) (x 30.000) (RITZ et al. 2002) 38 Abb. 10: Flussdiagramm der Versuchsdurchführung 41 Abb. 11: Befüllung der Hochdruckanlage High Pressure Food Processor SO 12644
der Firma Engineered Pressure Systems International NV, Temse/Belgien 47 Abb. 12: HPP-Pilotanlage der Firma Uhde, maximaler Arbeitdruck: 600 MPa,
Arbeitsvolumen: 4 l, Innendurchmesser: 120 mm, Werksfoto (UHDE HIGH
PRESSURE TECHNOLOGIES 2008) 47 Abb. 13: Flussdiagramm qualitativer Nachweis von Listeria monocytogenes 49
Abb. 14: Flussdiagramm quantitativer Nachweis von Listeria monocytogenes 51 Abb. 15: Sensorische Untersuchung der kurzgereiften Rohwurst aus Geflügelfleisch
58 Abb. 16: Verlauf der mesophilen aeroben Gesamtkeimzahl (MW, +S) in kurzgereifter
Rohwurst aus Geflügelfleisch in den unbeimpften Proben (U) für die
verschiedenen Behandlungsvarianten (A = unbehandelt, B = 300 MPa 5 min, C
= 500 MPa 5 min, je n = 6) über einen Zeitraum von 16 Tagen ab HPP
(Buchstaben = signifikanteTagesunterschiede) 60
Abb. 17: Verlauf der mesophilen aeroben Gesamtkeimzahl (MW, +S) in kurzgereifter Rohwurst aus Geflügelfleisch in den unbeimpften Proben (U) für die
verschiedenen Behandlungsvarianten (D = unbehandelt E = 500 MPa 1 min, F = 700 MPa 1 min, je n = 6) über einen Zeitraum von 16 Tagen ab HPP
(Buchstaben = signifikanteTagesunterschiede) 61 Abb. 18: Verlauf der quantitativen Keimzahlen (MW, +S) von Listeria monocytogenes
in kurzgereifter Rohwurst aus Geflügelfleisch in den mit 10 KBE/g L.m.
beimpften Proben (L3) für die verschiedenen Behandlungsvarianten (A = unbehandelt, B = 300 MPa 5 min, je n = 6) über einen Zeitraum von 16 Tagen ab HPP (Buchstaben = signifikanteTagesunterschiede)
3
63 Abb. 19: Verlauf der quantitativen Keimzahlen (MW, +S) von Listeria monocytogenes
in kurzgereifter Rohwurst aus Geflügelfleisch in den mit 10 KBE/g L.m.
beimpften Proben (L6) für die verschiedenen Behandlungsvarianten (A = unbehandelt, B = 300 MPa 5 min, C = 500 MPa 5 min, je n = 6) über einen Zeitraum von 16 Tagen ab HPP (Buchstaben = signifikante Tagesunterschiede)
6
64 Abb. 20: Verlauf der quantitativen Keimzahlen (MW, +S) von Listeria monocytogenes
in kurzgereifter Rohwurst aus Geflügelfleisch in den mit 10 KBE/g L.m.
beimpften Proben (L3) für die verschiedenen Behandlungsvarianten (D = unbehandelt E = 500 MPa 1 min, F = 700 MPa 1 min, je n = 6) über einen Zeitraum von 16 Tagen ab HPP (Buchstaben = signifikante Tagesunterschiede)
3
65 Abb. 21: Verlauf der quantitativen Keimzahlen (MW, +S) von Listeria monocytogenes
in kurzgereifter Rohwurst aus Geflügelfleisch in den mit 10 KBE/g L.m.
beimpften Proben (L6) für die verschiedenen Behandlungsvarianten (D = unbehandelt E = 500 MPa 1 min, F = 700 MPa 1 min, je n = 6) über einen Zeitraum von 16 Tagen ab HPP (Buchstaben = signifikante Tagesunterschiede)
6
66 Abb. 22: Mittlere pH-Werte (MW, +S) für die verschiedenen Behandlungs- (A =
unbehandelt, B = 300 MPa 5 min, C = 500 MPa 5 min) und Beimpfungsvarianten (U = unbeimpft, L3 = 10 KbE/g L.m., L6 = 10 KbE/g L.m.) an Tag 1 und 16 nach HPP (n = 6, Buchstaben = signifikante Tagesunterschiede)
3 6
71 Abb. 23: Mittlere pH-Werte (MW, +S) für die verschiedenen Behandlungs- (D =
unbehandelt, E = 500 MPa 1 min, F = 700 MPa 1 min) und Beimpfungsvarianten (U = unbeimpft, L3 = 10 KbE/g L.m., L6 = 10 KbE/g L.m.) an Tag 1 und 16 nach HPP (n = 6, Buchstaben = signifikante Tagesunterschiede)
3 6
72
Abb. 24: Mittlere Farbwerte (MW, +S) für die verschiedenen Behandlungsvarianten (A = unbehandelt, B = 300 MPa 5 min, C = 500 MPa 5 min) an Tag 1 und 16
nach HPP (n = 6, Buchstaben = signifikante Tagesunterschiede) 75 Abb. 25: Mittlere Farbwerte (MW, +S) für die verschiedenen Behandlungsvarianten
(D = unbehandelt, E = 500 MPa 1 min, F = 700 MPa 1 min) an Tag 1 und 16
nach HPP (n = 6, Buchstaben = signifikante Tagesunterschiede) 76 Abb. 26: Ergebnisse der sensorischen Untersuchung (MW) an Tag 2 nach HPP für
die verschiedenen Behandlungsvarianten (A = unbehandelt, B = 300 MPa 5 min, C = 500 MPa 5 min) für je n = 6 kurzgereifte Rohwürste (Prüferpanel) 83 Abb. 27: Ergebnisse der sensorischen Untersuchung (MW) an Tag 17 nach HPP für
die verschiedenen Behandlungsvarianten (A = unbehandelt, B = 300 MPa 5 min, C = 500 MPa 5 min) für je n = 6 kurzgereifte Rohwürste (Prüferpanel) 84 Abb. 28: von links nach rechts: 500 MPa 5 min, 300 MPa 5 min, unbehandelte
kurzgereifte Rohwurst 85 Abb. 29: Ergebnisse der sensorischen Untersuchung (MW) an Tag 2 nach HPP für
die verschiedenen Behandlungsvarianten (D = unbehandelt, E = 500 MPa 1 min, F = 700 MPa 1 min) für je n = 6 kurzgereifte Rohwürste (Prüferpanel) 86 Abb. 30: Ergebnisse der sensorischen Untersuchung (MW) an Tag 17 nach HPP für
die verschiedenen Behandlungsvarianten (D = unbehandelt, E = 500 MPa 1 min, F = 700 MPa 1 min) für je n = 6 kurzgereifte Rohwürste (Prüferpanel) 87
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Auszug der Lebensmittelkriterien gemäß Anhang I der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 der Kommission vom 15. November 2005 über Mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel für Listeria monocytogenes... 13 Tabelle 2: Differenzierung innerhalb der Spezies L. monocytogenes in verschiedene
Serovare anhand spezifischer Oberflächen(O)- und Geißel(H)-Antigene
modifiziert nach GRAY u. KILLINGER (1966) ... 16 Tabelle 3: Temperaturveränderungen bestimmter Substanzen während einer
adiabatischen Kompression (TING et al. 2002)... 30 Tabelle 4: Ungefähre Hitze- und Druckresistenz für bestimmte pathogene
Mikroorganismen modifiziert nach CARLEZ et al. (1993)... 35
Tabelle 5: Übersicht Abkürzungen für Druckbehandlung und Beimpfung... 42 Tabelle 6: Untersuchungen an den verschiedenen Lagerungstagen nach HPP... 43 Tabelle 7: Qualitativer Nachweis von Listeria monocytogenes über einen
Lagerungszeitraum von 16 Tagen ab HPP (n = 6) ... 68 Tabelle 8: Qualitativer Nachweis von Listeria monocytogenes über einen
Lagerungszeitraum von 16 Tagen ab HPP (n = 6) ... 69 Tabelle 9: Ergebnisse der chemischen Untersuchung der Rohwürste (MW, ±S) für
Tag 1 und 16 nach HPP (n = 6, Buchstaben = signifikante Tagesunterschiede, grau hinterlegte Felder = signifikante Unterschiede zu Tag 1 nach HPP) ... 79 Tabelle 10: Ergebnisse der chemischen Untersuchung der Rohwürste (MW, ±S) für
Tag 1 und 16 nach HPP (n = 6, Buchstaben = signifikante Tagesunterschiede, grau hinterlegte Felder = signifikante Unterschiede zu Tag 1 nach HPP) ... 81 Tabelle 11: Ermittelte aerobe mesophile Gesamtkeimzahlen und Keimzahlen von
Listeria monocytogenes (L.m.) (lg KbE/g) für den Tag 0 ab HPP für je n = 6 ...151 Tabelle 12: Ermittelte aerobe mesophile Gesamtkeimzahlen und Keimzahlen von
Listeria monocytogenes (L.m.) (lg KbE/g) für die Tage1,6,9, 16 ab HPP für je n = 6 ...152 Tabelle 13: Ermittelte pHWerte für die Lagerungstage 1, 6, 9, 16 ab HPP und a
-Werte für die Tage 1 und 16 nach HPP für je n = 6
w
...156 Tabelle 14: Ermittelte L*, a* und b*-Werte für die Lagerungstage 1, 6, 9, 16 ab HPP
...161 Tabelle 15: Ermittelte Ergebnisse der chemischen Vollanalyse (Asche,
Trockensubstanz (TS), Fett, Hydroxyprolin (HP), Rohprotein,
Nichtproteinstickstoff (NPN) und Umrötung in %) für die Lagerungstage 1 und 16 ab HPP für je n = 6 ...163 Tabelle 16: Ermittelte Nitrit- und Nitrat-Werte (in mg/kg) für die Lagerungstage 1 und
16 ab HPP für je n = 6 ...165 Tabelle 17: Ermittelte Ergebnisse für das Aussehen im Anschnitt für die
Lagerungstage 2, 7, 10, 17 ab HPP für je n = 6 (gemittelt aus n = 6 Prüfern)..167 Tabelle 18: Ermittelte Ergebnisse für die Farbe und die Farbhaltung für die
Lagerungstage 2, 7, 10, 17 ab HPP für je n = 6 (gemittelt aus n = 6 Prüfern)..168 Tabelle 19: Ermittelte Ergebnisse für die Zusammensetzung und die Konsistenz für
die Lagerungstage 2, 7, 10, 17 ab HPP für je n = 6 (gemittelt aus n = 6 Prüfern) ...171
Tabelle 20: Ermittelte Ergebnisse für den Geschmack und den Geruch für die
Lagerungstage 2, 7, 10, 17 ab HPP für je n = 6 (gemittelt aus n = 6 Prüfern)..172
Tabelle 21: Ermittelte Ergebnisse für die DLG-Qualitätszahl für die Lagerungstage 2, 7, 10, 17 ab HPP für je n = 6 (gemittelt aus n = 6 Prüfern)...174
Tabelle 22: Speziesdifferenzierung mittels biochemischer Untersuchung (DIN EN ISO 11290-1) ...176
Tabelle 23: Speziesdifferenzierung mittels PCR nach BUBERT et al. (1992) ...177
Tabelle 24: Serotypisierung mittels Objektträgeragglutination (OTA) ...178
Tabelle 25: Serotypengruppierung mittels PCR nach DOUMITH et al. (2004) ...178
Danksagungen
Zuallererst möchte ich mich bei Prof. Dr. G. Klein für die Förderung und Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. B. Nowak danke ich besonders für die Überlassung des interessanten Themas und die ausgezeichnete Betreuung und Unterstützung in Form von Ratschlägen, Diskussionen, Anregungen und tatkräftige Hilfe beim Anfertigen dieses Werkes.
Frau Dr. T. von Müffling möchte ich sehr herzlich danken für ihre große Unterstützung bei dieser Arbeit sowie die netten gemeinsamen Fahrten nach Garrel und Quakenbrück.
Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. Julia Jähne und Herrn Dr. Christian Strotmann, die mir unersetzlich bei Planung, Organisation und Durchführung meiner Arbeit halfen, jederzeit ein offenes Ohr für Probleme hatten und auch die nicht so ernste Seite des Lebens nicht zu kurz kommen ließen. Weitermachen!
Besonders bedanken möchte ich mich bei den vielen helfenden Händen, die mich nicht nur bei der Durchführung meiner Versuche tatkräftig unterstützten. Besonders zu nennen sind Frau Bettina Engel-Abé., Frau Marion Busse, Frau Marija Livio und Herr Dietmar Köke sowie meine Mitdoktoranden Marcus, Antje, Cristiana, Christin, Kerstin, Kerstin, Christiane und zahlreiche Praktikanten sowie Sandra, Stephen und Philine.
Sehr herzlich danke ich Ana Belismelis für ihre sprachliche Unterstützung in Spanien und die unermüdliche Hilfe im Labor.
Dem I.A.T.A. in Valencia und Dr. Antonio Martínez López gilt mein Dank für die Bereitstellung der Hochdruckanlage und Chelo Pino für die Durchführung der Hochdruckbehandlung sowie die nette Betreuung in Spanien.
Auch dem D.I.L. in Quakenbrück danke ich für die Bereitstellung der Hochdruckanlage und die Durchführung der HPP.