am augenhintergrund
Universitätsklinikum Jena
Klinik für Augenheilkunde
Abbildung 1
n FLIO-Auswertung der mittleren Fluoreszenzle-bensdauer Tm im Kanal 1 einer Kontrollperson mit SPC Image.
Abbildung 2
n Fluoreszenzlebensdauer Tm im Kanal 2 (560 – 700 nm) für Normalperson (links) und trockene AMD (rechts) mittels FLIO (triexponentiel-le Approximation), Farb-codierung in ps.
werden, bei denen sich die Gruppen mit retinaler Erkrankung von den Gesunden signifikant unter-scheiden.
Es wurden verschiedene Krankheitsbilder, wie al-tersbedingte Makuladegeneration (AMD: N=44), Diabetes mellitus mit und ohne Retinopathie (RD 1: N=57, RD 0: N=18), primäres Offenwinkelglau-kom (POWG: N=14) und Alzheimer-Patienten (AD:
N=11) mittels zeitaufgelöster Autofluoreszenz un-tersucht sowie gesunde Probanden (N=47). Im Frühstadium der AMD war eine Verlängerung der Lebensdauer T2 im kurzwelligen Kanal 1 im Ver-gleich zu gesunden Probanden nachweisbar [20].
Patienten mit trockener AMD zeigten im Kanal 2 eine Verlängerung der Fluoreszenzlebensdauer T1, T2, der mittleren Fluoreszenzlebensdauer Tm sowie Änderungen der Amplituden A1 und A2 verglichen mit Normalpersonen. Dies könnte auf eine Verringerung der normalen Melaninkon-zentration sowie eine Lipofuszinakkumulation bei Patienten mit trockener AMD hinweisen (Wildner et al. Veröffentlichung in Vorbereitung). In einem Beispiel sind in Abbildung 2 zum einen lokale Änderungen im Bereich der Drusen und zum
anderen globale Verlängerung der Fluoreszenz-lebensdauer Tm über das gesamte Bild des AMD- Patienten zu sehen im Vergleich zur Kontroll-person.
Patienten mit Diabetes mellitus ohne RD (RD 0) zeigten eine verlängerte Fluoreszenzlebensdauer T2 im Kanal 1 (490 – 560 nm). Diese Lebensdauer-verlängerung war mit milder und mäßiger nicht-proliferativer RD (RD 1) noch stärker ausgeprägt.
Ursachen könnten Änderungen im NADH-Stoff-wechsel sowie die Anreicherung von AGEs sein [21]. Im Vergleich von Patienten mit primärem Offenwinkelglaukom und Gesunden konnte in einer ersten Vorstudie eine Verringerung der
Abbildung 3
n FLIM-Aufnahme mittels 2-Photonen-Mikroskopie der mittleren Abklingzeit Tm (biexpontell) der Ganglien-zellschicht im Kanal 1 (links) und des RPE im Kanal 2 (rechts); Balken 20 µm [24].
Abbildung 4
n Fluoreszenzintensität (links) und FLIM-Aufnahme der mittleren Lebensdauer Tm (biexponentiell; rechts) eines AMD-Schnittpräpara-tes mittels 1-Photonen- Mikroskopie (BM, Bruch’
Membran; HL, Hyper-fluoreszenze Läsion).
Fluoreszenzlebensdauer T3 im Kanal 1 und Kanal 2 ermittelt werden. Bei Alzheimerpatienten (AD) zeigte sich ein linearer Zusammenhang zwischen zunehmendem Schweregrad ((Mini-Mental-Sta-tus-Test; MMST-Score) und dem relativen Anteil Q2 (Produkt der Fluoreszenzlebensdauer und der Amplitude der zweiten fluoreszierenden Kom-ponente (T2, A2) bezogen auf die Gesamtinten-sität der Fluoreszenz) im langwelligen Kanal 2 (R=-0.757, p=0.007). Weiterhin zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem in der Zerebrospinalflüssigkeit bestimmten phos-poryliertem Tauprotein (p-tau-181), welches als krankheitsspezifischer Marker der Alzheimerde-menz beschrieben wird [22], und Q2 im Kanal 2 (R=0.919, p=0.009) [Jentsch et al. Veröffent-lichung in Review].
Zur besseren Interpretation der zellulären Stoff-wechselvorgänge und der Anreicherung krank-heitsspezifischer Substanzen werden an der Universitätsaugenklinik Jena außerdem ex-vivo- Untersuchungen der zeitaufgelösten Autofluores-zenz an Zell- und Gewebekulturen von Spender-augen oder SchweineSpender-augen durchgeführt. Die FLIO-Apparatur nutzt die 1-Photonen-Anregung.
Damit ist das gemessene Fluoreszenzsignal des Augenhintergrundes ein Summensignal aus allen zusammenhängenden Schichten (Retina, RPE, Bruch Membran, Choroidea). Deshalb wurden zunächst isolierte anatomischen Strukturen (RPE, Retina, Linse, Kornea usw.) des Schweineauges
mit der FLIO-Anordnung gemessen, um die Fluoreszenzlebensdauer jeder Struktur des Auges zu bestimmen [23]. Weiterhin steht der Univer-sitätsaugenklinik Jena neben der FLIO-Apparatur für die in-vivo-Messung am Patienten noch ein 2-Photonen-Mikroskop (2-Ph-M) mit Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM)-Technik durch die Koope-ration mit dem Institut für Biomedizinische Tech-nik der TU Ilmenau zur Verfügung. Der Vorteil der 2-Photonen-Anregung des Mikroskops ist die ge-zielte Anregung einzelner Schichten in einem kompletten Gewebekomplex. Durch die ebenfalls in dem 2-Ph-M integrierte FLIM-Technik kann somit aus einem Gewebekomplex von Retina, RPE und Choroidea eines Schweineauges die Fluo-reszenzlebensdauer jeder einzelnen Schicht be-stimmt werden. Aus diesen Untersuchungen an nativen Schweineaugen konnten sehr kurze Le-bensdauern für das RPE (50 – 120 ps; Abbildung 3;
[24] ) bestimmt werden, welche der Lebensdauer T1 der in-vivo-Messungen entsprechen, sowie mittlere Lebensdauern um 400 ps für die einzel-nen retinalen Schichten (Nervenfaserschicht, Ganglienzellschicht (Abbildung 3), Rezeptorinnen-segmente usw. [24] ), die der Lebensdauer T2 der in-vivo-Messungen entsprechen.
Weiterhin wurden FLIM-Messungen mit 1-Photo-nen-Mikroskopie an fixierten Schnittpräparaten von AMD-Spenderaugen durchgeführt. Diese Untersuchungen konnten zeigen, dass sich das RPE deutlich von der Bruch’ Membran, Drusen und Choroidea durch eine sehr kurze Fluores-zenzlebens dauer unterscheidet. Die Fluoreszenz-lebens dauer der Drusen ist dagegen deutlich län-ger, wobei hyper- und hypofluoreszente Drusen gefunden wurden (Abbildung 4, [25] ).
Die zeitaufgelöste Autofluoreszenz ist bei reti-nalen Erkrankungen im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe verändert und kann im
Zusam-menhang mit der Akkumulation von krankheits-spezifischen Substanzen wie Lipofuszin oder AGEs sowie Änderungen des Energiestoffwech-sels interpretiert werden. Ein wesentlicher Vorteil von Beurteilungen des Metabolismus mittels Autofluoreszenz besteht im Gegensatz zur Ver-wendung von fluoreszierenden Markern darin, dass grundsätzlich keine biochemische Beein-flussung der zu untersuchenden Vorgänge erfolgt.
Durch die Möglichkeit der kombinierten Anwen-dung der Fluoreszenzlebensdauer-Ophthalmos-kopie (FLIO) bei Patienten und der ex-vivo-Unter-suchung mit 2-Photonen-Mikroskopie und FLIM stehen Untersuchungstechniken zur Verfügung, um die Autofluoreszenz des Augenhintergrundes und ihrer Veränderung durch Erkrankungen zu interpretieren.
l i t e r at u r
1. Beach, J. m., et al., Oximetry of retinal vessels by dual-wavelength imaging: calibration and influence of pigmentation. J appl physiol, 1999. 86 (2): p. 748 – 58.
2. garhofer, g., et al., use of the retinal vessel analyzer in ocular blood flow research. acta Ophthalmol, 2009.
3. hammer, m., et al., Retinal venous oxygen saturation increases by flicker light stimulation. invest Ophthalmol Vis sci, 2011. 52 (1): p. 274 – 7.
4. schweitzer, D., et al., in Vivo measurement of the Oxy-gen saturation of Retinal Vessels in healthy Volonteers.
ieee trans. Biomed. eng., 1999. 46: p. 1454 – 1465.
5. howells, O., f. eperjesi, and h. Bartlett, measuring macular pigment optical density in vivo: a review of techniques. graefes arch clin exp Ophthalmol, 2011.
249 (3): p. 315 – 47.
6. schweitzer, D., et al., simple and objective method for routine detection of the macular pigment xanthophyll. J Biomed Opt, 2010. 15 (6): p. 061714.
7. Beatty, s., et al., the role of oxidative stress in the patho-genesis of age-related macular degeneration. surv Ophthalmol, 2000. 45 (2): p. 115 – 34.
8. landrum, J. t. and R. a. Bone, lutein, zeaxanthin, and the macular pigment. arch Biochem Biophys, 2001. 385 (1): p. 28 – 40.
9. lakowicz, J. R., principles of fluorescence spectroscopy.
3rd ed. 2006, New York: springer. xxvi, 954 p.
10. Koenig, K. and i. Riemann, high-resolution multiphoton tomography of human skin with subcellular spatial resolution and picosecond time resolution. Journal of Biomedical Optics, 2003. 8 (3): p. 432 – 439.
11. Dimitrow, e., et al., spectral fluorescence lifetime detec-tion and selective melanin imaging by multiphoton laser tomography for melanoma diagnosis. experimental Dermatology, 2009. 18 (6): p. 509 – 515.
12. li, D., W. Zheng, and J. Y. Qu, two-photon autofluores-cence microscopy of multicolor excitation. Opt. lett., 2009. 34 (2): p. 202 – 204.
13. mycek, m. a., K. t. schomacker, and N. s. Nishioka, colo-nic polyp differentiation using time-resolved autofluore-scence spectroscopy. gastrointest endosc, 1998. 48 (4):
p. 390 – 4.
14. heikal, a. a., intracellular coenzymes as natural bio-markers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomark med, 2010. 4 (2): p. 241 – 63.
15. skala, m. c., et al., in vivo multiphoton microscopy of NaDh and faD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. procee-dings of the National academy of sciences of the united states of america, 2007. 104 (49): p. 19494 – 19499.
16. Berezin, m. Y. and s. achilefu, fluorescence lifetime measurements and biological imaging. chem Rev, 2010. 110 (5): p. 2641 – 84.
17. chorvat, D. and a. chorvatova, multi-wavelength fluore-scence lifetime spectroscopy: a new approach to the study of endogenous fluorescence in living cells and tissues. laser physics letters, 2009. 6 (3): p. 175 – 193.
18. schweitzer, D., metabolic mapping, in medical Retina:
focus on Retinal imaging, f. holz, editor. 2010, springer Berlin heidelberg Berlin, heidelberg.
19. schweitzer, D., et al., towards metabolic mapping of the human retina. microsc Res tech, 2007. 70 (5): p. 410 – 9.
20. schweitzer, D., et al., comparison of parameters of time-resolved autofluorescence between healthy sub-jects and patients suffering from early amD. Ophthal-mologe, 2009. 106 (8): p. 714 – 722.
21. schweitzer, D., et al. Detection of early metabolic altera-tions in the ocular fundus of diabetic patients by time-resolved autofluorescence of endogenous fluorophores.
2011. Optical society of america.
22. andreasen, N., evaluation of csf-tau and csf-abeta42 as Diagnostic markers for alzheimer Disease in clinical practice. archives of Neurology, 2001. 58 (3): p. 373 – 379.
23. schweitzer, D., et al. spectral and time-resolved studies on ocular structures. 2007. munich, germany: spie.
24. peters, s., m. hammer, and D. schweitzer, two-photon excited fluorescence microscopy application for ex vivo investigation of ocular fundus samples, in european conference on Biomedical Optics (ecBO) munich, ger-many, p. so and e. Beaurepaire, editors. 2011, Optical society of america. p. 808605.
25. schweitzer, D., et al., time-resolved autofluorescence imaging of human donor retina tissue from donors with significant extramacular drusen. invest Ophthalmol Vis sci, 2012. 53 (7): p. 3376 – 86.
sache ist bisher unklar. Um den oder die auslösen-den Faktoren zu ermitteln wurde in auslösen-den letzten Jahren verstärkt auf zellulärer und molekularer Ebene geforscht. Dabei rückte auch das Immun-system in den Fokus der Ursachenermittlung, u. a. konnten veränderte Antikörpermuster gegen Retina und Sehnerv bei Glaukom Patienten nach-gewiesen werden [2, 3].
Um eine mögliche direkte Beteiligung der Anti-körper am Prozess der Ganglienzelldegeneration nachzuweisen, wurden immunologische Verän-Das Glaukom ist eine neurodegenerative
Er-krankung, welche durch einen kontinuierlichen Verlust retinaler Ganglienzellen (RGZ) und der Sehnervenfasern gekennzeichnet ist. Eine verbes-serte Kenntnis der Pathogenese der Erkrankung ist notwendig, um in Zukunft eine Behandlung der Ursachen und nicht nur der Symptome zu entwi-ckeln. Ein erhöhter Augeninnendruck (IOD) gilt zwar als Hauptrisikofaktor, doch werden bei etwa 30 % der Patienten normale Druckwerte gemessen [1]. Die Druckerhöhung kann folglich nicht alle Aspekte der Erkrankung erklären, die genaue
Ur-d r . s t e p h a n i e c . J O a c h i m , s a n Ur-d r a K u e h n1, s a b r i n a r e i n e h r , p r O f. d r . h . b u r K h a r d d i c K