Augenklinik Lübeck
Abbildung 1
n Zellisolation aus mit Melanomzellen versehenem humanen Blut zur Validie-rung und OptimieValidie-rung der immunmagnetischen Isolation. Die Hälfte der Blutprobe von einer gesunden Freiwilligen (34 Jahre) wurde mit kultivier-ten uvealen Melanomzellen versetzt, während die andere Hälfte nur mit der Vehikellösung gemischt wurde. Beide Blutproben wurden anschließend für die immunmagnetische Zellisolation verwendet.
Mittels Doppel-Immunfär-bungen konnten uveale Melanomzellen positiv für den Melanommarker NG2 (grün) und negativ für den Leukozytenmarker CD45 (rot) nur in der ersten Gruppe nachgewiesen werden (links).
In der Vergangenheit verwendeten unterschied-liche Arbeitsgruppen eine PCR-basierte Methode, um Melanom-assoziierte Transkripte aus dem Blut von uvealen Melanompatienten zu isolieren [16 – 21]. Bei dieser Technik werden eine Reihe von verschiedenen Melanommarkern wie z. B. Tyro-sinase mRNA, gp100 und MelanA/Mart-1 mRNA zur Identifizierung eingesetzt. Das Problem bei dieser Methode ist, dass die Detektionsrate von 0 bis 100 Prozent variiert, die Methode nicht gut reproduzierbar ist, falsch-positive und falsch- negative Ergebnisse vorliegen können und keine Zellen zur weiteren Diagnostik vorliegen [22].
Dieses Problem wird durch die Detektion ganzer zirkulierender Melanomzellen (ZMZ) umgangen.
Der immunomagnetische Assay zur ZMZ Detek-tion beruht auf der IsolaDetek-tion von intakten Zellen aus dem Blut. In unserer kürzlich publizierten Studie verwendeten wir den monoklonalen Anti-körper 9.2.27, der gegen das Melanom-assozierte Chondroitinsulfat Proteoglykan (MCSP-Antigen) gerichtet ist [23]. Bei Anwendung dieses Anti-körpers gelingt es aber nur bei 19 Prozent der 52 untersuchten Melanompatienten zirkulierende Melanomzellen zu isolieren. Betrachtet man jedoch die zu erwartende Anzahl von Patienten, die klinisch manifeste Metastasen entwickeln werden, so ist die Detektionsrate zu niedrig und wahrscheinlich signifikant mit falsch-negativen Ergebnissen belastet.
Um eine Verbesserung dieser wertvollen Technik herbeizuführen, modifizierten wir unser Protokoll in vielfältiger Weise und sicherten durch unter-schiedliche positive und negative Kontrollen die Sicherheit und Reproduzierbarkeit unseres neuen Assays (Abbildung 1). Die Detektion von ZMZ wird nun seit zwei Jahren in unserer Routinediagnostik verwendet. Eine wesentliche und zugleich er-schreckende Erkenntnis der bisherigen Ergeb-nisse war der Nachweis und die Bestätigung von ZMZ in über 90 % der Patienten. Die Entstehung und Lage des Tumors in einem der am stärksten durchbluteten Gewebe des Körpers lässt solch ein Ergebnis zwar erwarten, dieses steht jedoch im Widerspruch zur Tatsache, dass nur die Hälfte der Patienten Metastasen entwickeln werden. Es entsteht zunächst also der Verdacht, dass trotz penibler Kontrollen, die Methodik falsch-positive Resultate liefert.
Ein weiterer wertvoller Schritt war deshalb die Etablierung des Monosomie-3-Nachweises an den isolierten Zellen (Abbildung 2). Hierbei erwies sich, dass knapp die Hälfte der Patienten Mono-somie-3 positive Zellen im Kreislauf aufwies.
Dieses Resultat unterstützt die Hypothese, dass diese chromosomale Aberration wesentlich für die Entwicklung klinisch-manifester Metastasen ist.
Doch scheint diese nicht primär für die Streuung sondern vielmehr für die Absiedlung der
Mela-nomzellen verantwortlich zu sein. Erst zukünftige Studien werden zeigen, ob der Monosomie-3- Nach weis in ZMZ mit der tatsächlichen Entwick-lung von klinisch manifesten Metastasen korre-liert.
Die Anwendung dieser weiterentwickelten Technik der immunomagnetischen Zellanreicherung und genotypischen Charakterisierung soll jedoch nicht nur die Patienten identifizieren, die von einer gezielten Therapie profitieren können, sondern neben Mehrfachbestimmungen im Verlauf der Erkrankung auch ein Monitoring zur Wirksamkeit der Behandlung erlauben. Neue Wirkstoffklassen, wie z. B. der Proteinkinase C Inhibitor AEB071, dem MEK-Inhibitor AZD6244 (Selumetinib), eine Kombination aus RAD001 (Everolimus) und Pasi-reotide (SOM230) und Ipilimumab werden derzeit in Phase 2 Studien zur Behandlung von metasta-sierten uvealen Melanomen getestet. Inwieweit diese neuen Medikamente die stattgehabte Metastasierung und klinisch manifeste Metasta-sen erfolgreich hemmen können, bleibt zu bewei-sen [25]. Sinnvoller erscheint es, früher in diebewei-sen Prozess einzugreifen. Die breite prophylaktische Anwendung an Patienten mit uvealem Melanom ohne Metastasierung verbietet sich derzeit auf-grund des potentiellen Nebenwirkungsprofils.
Angedacht ist die Anwendung bei Patienten, die für Monosomie 3 positiv getestet wurden. Pro-blematisch ist jedoch ein geeignetes Protokoll auszuwählen, da eine Metastasierung erst nach 5 oder mehr Jahren auftreten kann. Es besteht somit der Bedarf ein Monitoring einzuführen, das die Wirksamkeit der Therapie vor Auftreten klinisch manifester Metastasen ermöglicht. Hierzu wäre die Detektion von ZMZ in der Lage.
Der Nachweis und die Genotypisierung der zirku-lierenden Melanomzellen bedeuten einen Quan-tensprung in der Diagnostik und Therapie des uvealen Melanoms. Hochrisikopatienten können hierdurch selektiert werden und die Wirksamkeit neuer Therapien frühzeitig und sinnvoll überprüft werden. Die Untersuchung der Eigenschaften der
Abbildung 2 Einzel-signal oder ein Dublet wurde als Monosomie-3 bewertet (links). Die Abbildung rechts zeigt eine NG2-positive ZMZ mit Disomie-3 neben zwei NG2-negativen Leukozyten.
Die Pfeile deuten auf die Immunobeads hin.
ZMZ wird schlussendlich auch unser Verständnis zur Streuung und Absiedlung erweitern.
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Prof. Dr. med. Salvatore Grisanti, Jahrgang 1967, ist seit 2008 Direktor und Lehrstuhlinha-ber der Universitäts-Augenklinik Lübeck. Nach der Schulausbildung studierte er an der Uni-versität zu Köln und promovierte dort 1993.
Nach einen 2-Jährigen Forschungsaufenthalt in den USA (University of Alabama at Birming-ham und Schepens Eye Research Institute an der Harvard University Boston) setzte er seine Facharztausbildung an der Universitäts-Au-genklinik Köln fort und erhielt dort in den Jah-ren 1999 die Anerkennung als Facharzt und 2000 die Venia legendi für das Fach Augenheil-kunde. Seine Laufbahn setzte er von 2001 bis 2008 an der Universitäts-Augenklinik Tübin-gen fort. Seine klinisch-wissenschaftlichen Schwerpunkte liegen im Bereich von Fibrose- und Angiogenese-Prozessen im Auge, sowie in der Klinik und Pathophysiologie des uvea-len Melanoms.
Prof. Dr. med. Salvatore Grisanti Universitäts-Augenklinik Lübeck
im Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Ratzeburger Allee 160
23538 Hansestadt Lübeck
K O n ta K t
Dr. rer. nat. Ayseguel Tura, Jahrgang 1977, ist wissenschaftliche Mitarbeiterin der Universi-täts-Augenklinik Lübeck. Nach der Schulaus-bildung in Istanbul, studierte sie an der Uni-versität Bogaziçi, Istanbul Molekularbiologie und Genetik und erhielt 2001 den Magister für das Fach. Von 2001 bis 2007 war sie Mitglied an der »Graduate School of Neural and Behavi-oural Sciences« an der Universität Tübingen und promovierte dort 2007. Ihr wissenschaft-licher Schwerpunkt ist die Untersuchung von intrazellulären Signalwegen, wie z. B. die Rho-Kinase Signalkaskade.
Dr. rer. nat. Ayseguel Tura Universitäts-Augenklinik Lübeck
im Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Ratzeburger Allee 160
23538 Hansestadt Lübeck
K O n ta K t
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Priv.-Doz. Dr. med. Julia Lüke, Jahrgang 1979, ist Oberärztin der Universitäts-Augenklinik, Lübeck. Nach der Schulausbildung studierte sie an der Universität zu Lübeck und promo-vierte dort 2006. Sie erhielt 2011 die Anerken-nung als Fachärztin für Augenheilkunde. 2012 wurde sie habilitiert und erhielt die Venia legendi für das Fach Augenheilkunde. Ihr kli-nisch-wissenschaftlicher Schwerpunkt liegt im Bereich des uvealen Melanoms mit besonde-rem Fokus auf die Angiogenese und Metasta-sierung.
Priv.-Doz. Dr. med. Julia Lüke Universitäts-Augenklinik Lübeck
im Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Ratzeburger Allee 160
23538 Hansestadt Lübeck