4. ERGEBNISSE
4.7 Die Phosphorylierung von Cdc123 in wachsenden Zellen
Posttranslationale Modifikationen sind wichtige Determinanten der Aktivität, Interaktion, Lokalisation und Stabilität von Proteinen. Im Bereich der eukaryotischen Translationskomponenten sind zahlreiche posttranslationale Modifikationen bekannt, darunter die Ubiquitinierung von ribosomalen Untereinheiten (Spence et al., 2000), die Modifikation des Elongationsfaktor eEF1A mit Methylgruppen oder Glycerylphosphorylethanolamin (Merrick und Nyborg, 2000), die Derivatisierung eines Histidinrestes von eEF2 zu Diphtamid (Merrick und Nyborg, 2000) oder die (nach bisherigem Wissen) einmalige Hypusin-Modifikation von eIF5A (Park et al., 2010). Am weitesten verbreitet ist jedoch die Phosphorylierung, welche auch bei der Regulation der Translationsinitiation eine zentrale Rolle spielt (vgl. 3.2.3). Da in vitro Studien mit Protein-Microarrays eine Phosphorylierung von Cdc123 nahe gelegt hatten (Ptacek et al., 2005), sollte nun untersucht werden, ob Cdc123 tatsächlich phosphoryliert wird und ob dies eine regulatorische Funktion auf die eIF2-Assemblierung und damit auf die Translationsinitiation ausübt. In einem ersten Schritt wurde deshalb geklärt, ob Cdc123 in vivo in einer phosphorylierten Form vorliegt.
4.7.1 Cdc123 ist ein Phosphoprotein
Den ersten Hinweis auf eine Phosphorylierung von Cdc123 lieferte die Phosphatase-Behandlung von immunpräzipitiertem ha-Cdc123: Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ist eine veränderte Mobilität der dephosphorylierten Form in der SDS-Gelelektrophorese zu erkennen (Abb. 4.17a), was den Rückschluss zulässt, dass die unbehandelte Form phosphoryliert ist. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Cdc123, welches an N- oder C-Terminus mit einem flag-Epitop markiert war, erzielt und konnten, nachdem ein Cdc123-Antikörper zur Verfügung stand (vgl. Anhang 9.3), auch für Cdc123 ohne Epitop bestätigt werden (Abb. 4.17b). Cdc123 liegt also in wachsenden Zellen in phosphorylierter Form vor.
69 Abbildung 4.17: Cdc123 ist ein Phosphoprotein.
a, Die Stämme W6098 (leu2::pGAL1-ha3-CDC123-tCYC1-LEU2), W6890 (leu2::pGAL1-flag3-CDC123-tCYC1-LEU2) und W7474 (leu2::pGAL1-CDC123-flag3-tCYC1-LEU2) wurden in XYR bei 25°C kultiviert und der GAL1-Promotor für ca. 3 h durch Zugabe von 2% Galaktose induziert. Aus den Proteinlysaten wurden die epitopmarkierten Cdc123-Varianten mit 12CA5- bzw. α-flag-Antikörper präzipitiert. Die Proben wurden auf zwei Ansätze aufgeteilt, von welchen einer mit λ-Phosphatase behandelt wurde und der andere nicht. Die Analyse im Western Blot erfolgte mit 12CA5- bzw. α-flag-Antikörper.
b, Aus Proteinlysaten des Wildtyps K699, welcher in XYD bei 30°C kultiviert wurde, wurde Cdc123 mit affinitätsgereinigtem Antiserum präzipitiert. Eine Hälfte des Präzipitats wurde mit λ-Phosphatase behandelt, die andere diente als Kontrolle. Im Western Blot wurde Cdc123 mit affinitätsgereinigtem Antiserum nachgewiesen (*= Kreuzreaktion mit dem für die IP eingesetzten Antikörper).
c, Die Stämme W8716 (cdc123Δ::kanMX4 trp1::pGAL1-CDC123(1-360)-tCYC1-TRP1) und W8940 (cdc123Δ::kanMX4 trp1::pGAL1-CDC123(4-360)-tCYC1-TRP1) wurden in XYRG bei 25°C kultiviert, die Stämme W8803 (cdc123Δ::kanMX4 pRS314-pCDC123-ha3-CDC123(1-360)-tCYC1) und W8950 (cdc123Δ::kanMX4 pRS314-pCDC123-ha3-CDC123(4-360)-tCYC1) in XYD. Von den Proteinlysaten wurden 0,2 OD595 (W8716, W8940) bzw. 2 OD595 (W8803, W8950) für die Western-Blot-Analyse eingesetzt. Die Cdc123-Varianten wurden mit affinitätsgereinigtem Cdc123-Antiserum nachgewiesen.
d, flag-markierte Cdc123-Varianten wurden aus den Stämmen W6890 (leu2::pGAL1-flag3-CDC123-tCYC1-LEU2) und W7474 (leu2::pGAL1-CDC123-flag3-tCYC1-LEU2) gereinigt und per Massenspektrometrie auf Phosphorylierungen untersucht. Die identifizierten Phosphorylierungsstellen sind durch Fettdruck hervorgehoben.
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Anschließende Versuche, die Phosphorylierungsstelle(n) von Cdc123 durch Massenspektrometrie (in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. R. Deutzmann) zu identifizieren, waren jedoch wenig erfolgreich.
Zunächst wurde Cdc123 mit einem N-terminalen flag-Epitop markiert, in Hefe überexprimiert und gereinigt (Anhang 9.2.5). Die massenspektroskopische Analyse ergab – neben Phosphorylierungen im flag-Epitop – die Phosphorylierung der Serine an Position 2 und 3 von Cdc123 (Abb. 4.17d). Da diese direkt auf das Epitop folgen, wird die Phosphorylierung möglicherweise durch die Epitopmarkierung verursacht. So könnte durch die Fusion von Epitop und Cdc123 eine neue Erkennungssequenz für eine Kinase entstehen oder der N-terminale Bereich von Cdc123 könnte durch das Epitop stärker exponiert und damit für Kinasen zugänglich sein. Die Untersuchung einer N-terminalen Verkürzung von Cdc123 zeigte, dass die Serine 2 und 3 nicht notwendig für die Funktionalität von Cdc123 sind (vgl. 4.4.1). Ein interessanter Effekt war bei der SDS-Gelelektrophorese sichtbar (Abb. 4.17c): Beim Vergleich von Cdc123-Varianten ohne Epitop trat nur ein geringer Mobilitätsunterschied zwischen der N-terminal verkürzten und der Wildtyp-Form auf, wie es bei einem Unterschied von nur zwei Serinen zu erwarten ist. Bei N-terminal ha-epitopmarkierten Formen war der Mobilitätsunterschied viel größer, was dafür spricht, dass Cdc123 ohne N-terminales Epitop an den Serinen 2 und 3 nicht phosphoryliert ist und dass ein N-terminales ha- oder flag-Epitop zur Phosphorylierung an Serin 2 und/oder 3 führt.
In Ergänzung zur N-terminal markierten Form wurde auch C-terminal markiertes Cdc123-flag in der Massenspektrometrie untersucht: In diesem Fall war eine Phosphorylierung des letzten Serins von Cdc123 kurz vor dem flag-Epitop nachweisbar (Abb. 4.17d), womit wieder ein Einfluss des Epitops auf die Phosphorylierung plausibel ist.
4.7.2 Der C-terminale Bereich von Cdc123 ist phosphoryliert
Da die Phosphorylierungsstellen von Cdc123 mittels Massenspektrometrie nicht zweifelsfrei identifiziert werden konnten, wurden die in Abschnitt 4.4.3 hergestellten Cdc123-Varianten herangezogen. Aus Stämmen, welche die Cdc123-Varianten ohne Epitop vom GAL1-Promotor überexprimieren, wurde Cdc123 immunpräzipitiert und der Einfluss einer Phosphatasebehandlung auf die Mobilität in der SDS-Gelelektrophorese analysiert (Abb. 4.18a). Bei Wildtyp-Cdc123 (1-360) war der erwartete Shift durch Phosphatase-Behandlung sichtbar, ebenso bei der N-terminal verkürzten Variante (4-360) und der 4xA-Substitution (1-360, 4xA). Im Gegensatz dazu war bei der C-terminal verkürzten Form (1-340) und bei den Kombinationen mit C-terminaler Verkürzung (4-340 und 4-340, 4xA) kein Mobilitätsunterschied zwischen Phosphatase-behandelter und unbehandelter Form erkennbar. Der C-Terminus von Cdc123 (Aminosäuren 341-360) ist also phosphoryliert. Eine weitere Phosphorylierung von Cdc123 ist jedoch nicht ausgeschlossen, da eine einzelne Phosphorylierung möglicherweise nicht zu einem Mobilitätsunterschied in der eindimensionalen
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SDS-Gelelektrophorese führt. In der Tat wurden mittlerweile drei Phosphorylierungsstellen im C-Terminus von Cdc123 identifiziert (Bodenmiller et al., 2008): Es handelt sich um die Serine 353, 354 und 356 (Abb. 4.18b). Eine Phosphorylierung dieser Serine würde zusammen mit den umgebenden Glutamat- und Aspartat-Resten zu einer stark negativen Ladung des C-Terminus von Cdc123 führen, was die Interaktion von Cdc123 mit anderen Proteinen beeinflussen könnte. Die entsprechenden Serine sind in anderen Eukaryoten nicht konserviert, aber alle untersuchten Homologen weisen negativ geladene Reste in den letzten Aminosäuren auf (vgl. Abb. 3.6). Für eine Bedeutung des nicht konservierten C-terminalen Bereichs in Hefe spricht auch, dass die Verkürzung auf 340 Aminosäuren zu einem langsameren Wachstum führt (vgl. 4.4.3).
Abbildung 4.18: Der C-Terminus von Cdc123 ist phosphoryliert.
a, Die Stämme W8716, W8720, W8940, W8944, W8948 und W8979, welche die angegebenen Cdc123-Varianten vom GAL1-Promotor exprimieren (allgemeiner Genotyp cdc123Δ::kanMX4 trp1::pGAL1-CDC123-tCYC1-TRP1), wurden in XYRG bei 25°C kultiviert. Die Cdc123-Varianten wurden aus den Proteinlysaten mit affinitätsgereinigtem α-Cdc123-Antiserum präzipitiert. Eine Hälfte des Präzipitats wurde mit λ-Phosphatase behandelt, die andere diente als Kontrolle. Im Western Blot wurde Cdc123 mit affinitätsgereinigtem Antiserum nachgewiesen.
b, Im Bereich der letzten 20 Aminosäuren von Cdc123 wurden von anderen Arbeitsgruppen drei Phosphorylierungen identifiziert (Bodenmiller et al., 2008).