Die Depletion von Cdc123 verringert die Assoziation der eIF2-Untereinheiten und

In einem haploiden Stamm wurde die einzige Kopie von CDC123 unter die Kontrolle des regulierbaren GALL-Promotors gestellt. Nach dem Überführen von Raffinose/Galaktose- in Glukose-Medium wurde die Auswirkung der Repression der CDC123-Expression auf Wachstum und Zellzyklusprogression verfolgt (Abb. 4.5). Zunächst nahm der Anteil an Zellen mit 1C-DNA-Gehalt ab, wie es für Stämme aus dem W303-Hintergrund beim Wechsel von Raffinose/Galaktose zu Glukose typisch ist. Bei längerer Kultivierung in Glukosemedium wurden die Folgen der Cdc123-Depletion sichtbar: die Zellen akkumulierten in der G1-Phase (Abb. 4.5c) und nahmen an Größe zu, was sich in der Zunahme des Vorwärtsstreulichts (Forward Scatter, FSC) zeigte (Abb. 4.5d). Dieses Verhalten wurde auch bei der Depletion von eIF2 oder eIF2B beobachtet (Weinzierl, 2011). Bei Depletion von Cdc123 treten die Effekte auf Zellzyklus und Zellgröße allerdings später ein, was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass CDC123 durch den GALL-Promotor stark überexprimiert wird und die Cdc123-Menge erst 9 h nach der Repression des GALL-Promotors das endogene Cdc123-Niveau erreicht (Abb. 4.5a). Die Depletionsstudien unterstreichen also den funktionellen Zusammenhang von Cdc123 und eIF2.

46

Abbildung 4.5: Die Depletion von Cdc123 führt zu einem Arrest der Zellen in G1.

Der Stamm W9791, in welchem CDC123 unter der Kontrolle des GALL-Promotors steht, wurde in XYRG bei 25°C angezogen und in der exponentiellen Wachstumsphase in XYD umgesetzt. Zu den angegebenen Zeiten wurden Proben für Proteinlysate und Ethanol-Fixierung entnommen. Während der Zeitreihe wurde die Kultur fortwährend verdünnt, um eine Zelldichte von OD₆₀₀ < 1 zu gewährleisten.

a, Die Menge an Cdc123 in den Proteinlysaten wurde durch Western-Blot-Analyse mit einem affinitätsgereinigten Antiserum untersucht. Als Kontrolle (K) diente der Stamm W9796, welcher CDC123 vom endogenen Promotor exprimiert und in XYRG kultiviert wurde.

b, Das Wachstum wurde durch Messung der OD600 der Kultur verfolgt. Auf der horizontalen Achse ist die Zeit in Stunden dargestellt und auf der vertikalen Achse die Anzahl der Teilungen seit dem Beginn der Zeitreihe. Zur Berechnung der Anzahl der Teilungen wurde die gemessene OD₆₀₀ um die Verdünnung der Kultur seit Beginn der Zeitreihe korrigiert, der Quotient zur OD₆₀₀ am Beginn der Zeitreihe gebildet und davon der Logarithmus zur Basis 2 genommen.

c, Zur Analyse der Zellzyklusprogression wurden Ethanol-fixierte Proben mit Sytox Green gefärbt und im Durchflusszytometer gemessen.

d, Der Forward Scatter (FSC) der Zellen wurde im Durchflusszytometer gemessen und als Box-Plot dargestellt.

Um die Rolle von Cdc123 für die Integrität des heterotrimeren eIF2-Komplexes zu überprüfen, wurden die Auswirkungen der Depletion von Cdc123 auf die Interaktion der eIF2-Untereinheiten durch Immunpräzipitation von flag-Sui3 untersucht (Abb. 4.6). Zusätzlich wurde die Interaktion von eIF2 und eIF2B analysiert, wofür Gcd1 (eIF2Bγ) mit einem myc13-Epitop markiert wurde.

47

Abbildung 4.6: Die Depletion von Cdc123 beeinträchtigt die Assoziation der drei eIF2-Untereinheiten und die Interaktion von eIF2 mit eIF2B.

Die Stämme W10451 (kanMX4-pSUI3-flag3-SUI3 GCD1-myc13-HIS3MX6) und W10452 (natNT2-pGALL-CDC123 kanMX4-pSUI3-flag3-SUI3 GCD1-myc13-HIS3MX6) wurden in XYRG bei 25°C angezogen, in der exponentiellen Wachstumsphase in XYD umgesetzt und zu den angegebenen Zeiten Proben genommen. Während der Zeitreihe wurde die Kultur fortwährend verdünnt, um eine Zelldichte von OD₆₀₀ < 1 zu gewährleisten.

a, Aus Proteinlysaten wurde flag-Sui3 mittels α-Flag-Antikörper immunpräzipitiert. Lysate (WCE) und Präzipitate (α-flag IP) wurden im Western Blot analysiert, wobei die Antikörper α-Flag und 9E10, Antiseren für Sui2 und Sui3 und affinitätsgereinigte Antiseren für Cdc123 und Gcd11 verwendet wurden. Bei den Lysaten ist ein Ausschnitt der Ponceau-gefärbten Membran gezeigt und die Lage der Standardbanden angegeben.

b, Zur Analyse der Zellzyklusprogression wurden Ethanol-fixierte Proben mit Sytox Green gefärbt und im Durchflusszytometer gemessen.

48

In den Proteinlysaten zeigte sich bei längerer Depletion von Cdc123 (24-29 h nach dem Shift in Glukosemedium) eine Abnahme von Gcd11 und möglicherweise auch von flag-Sui3. Außerdem ist in Raffinose/Galaktosemedium (0 h-Wert) weniger Gcd1-myc nachweisbar, was vermutlich auf eine verstärkte Degradation beim Zellaufschluss zurückzuführen ist: Gcd1-myc ist mit 86 kD das größte der hier untersuchten Proteine und die Ponceau-Färbung zeigte, dass bei den Lysaten aus Raffinose/Galaktosemedium im Bereich >80 kD deutlich weniger Protein vorhanden war als bei den Lysaten aus Glukosemedium (vgl. Abb. 4.6a). Die Immunpräzipitation von flag-Sui3 ergab, dass 19 h nach der Repression der CDC123-Expression die Interaktion von Sui3 mit den anderen eIF2-Untereinheiten (Sui2, Gcd11) und mit eIF2B (Gcd1-myc) abnimmt (Abb. 4.6a). Zu diesem Zeitpunkt trat auch die Akkumulation der Zellen in der G1-Phase ein (Abb. 4.6b). Die Effekte wurden durch die Depletion von Cdc123 und nicht durch den Wechsel der Kohlenstoffquelle verursacht, da sie bei einem Stamm, der CDC123 vom endogenen Promotor exprimiert, nicht auftraten. Ähnlich wie cdc123-Mutanten (Richter, 2006) führt also auch die Depletion von Cdc123 zu einer leichten Abnahme der Gcd11-Menge und einer deutlich verringerten Assoziation der eIF2-Untereinheiten.

Dies hatte eine reduzierte Interaktion von eIF2 mit eIF2B und die Akkumulation der Zellen in der G1-Phase zur Folge. Im Gegensatz zu anderen Versuchen (vgl. 4.2.1) war bei der Immunpräzipitation von flag-Sui3 eine schwache Interaktion von Sui3 mit Cdc123 nachweisbar. Dabei handelt es sich vermutlich nicht um eine direkte Interaktion, sondern eine indirekte Interaktion über Gcd11. Dies deutet darauf hin, dass sich die Bindung von Sui3 und Cdc123 an Gcd11 nicht gegenseitig ausschließt.

Möglicherweise gibt es bei der von Cdc123 unterstützten Assemblierung von eIF2 eine Zwischenstufe, bei der sowohl Cdc123 als auch Sui3 an Gcd11 gebunden sind. Da die Interaktion von Cdc123 und Sui3 bei Überexpression von Cdc123 stark zunahm, scheint die Cdc123-Menge in vivo limitierend zu sein.

4.3.2 Nur die Depletion von Cdc123, aber nicht die Depletion von