Nur die Depletion von Cdc123, aber nicht die Depletion von Initiationsfaktoren

In einem weiteren Experiment wurde die Depletion von Cdc123 mit der Depletion von Translationsinitiationsfaktoren (Weinzierl, 2011) verglichen. Dabei stand die Integrität von eIF2 im Vordergrund, welche durch Immunpräzipitation von Gcd11-myc untersucht wurde. Zunächst wurden mit einzelnen Stämmen Zeitreihen zur Repression des GALL-Promotors und Immunpräzipitation von Gcd11-myc durchgeführt. Dabei traten jedoch technische Probleme auf, welche die Interpretation der Ergebnisse erschwerten (Anhang 9.2.1): Zum einen enthielten die Proteinlysate bei Kultur der Zellen in Raffinose/Galaktosemedium (0 h-Wert) weniger Proteine im Bereich >70kD, was auch die Menge an Gcd11-myc (78 kD) reduzierte. Zum anderen zeigten die Proteinlysate nach längerer Depletion von Initiationsfaktoren eine starke Degradation von Gcd11-myc. Beide Probleme sind

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vermutlich darauf zurückzuführen, dass Zellen unter ungünstigen Bedingungen (Kultur in Raffinose/Galaktosemedium oder Defekte bei der Translationsinitiation) größere Vakuolen haben und durch die Freisetzung der vakuolären Proteasen beim Zellaufschluss deshalb mehr Proteindegradation stattfindet.

Da diese Versuche gezeigt hatten, dass Vergleiche von verschiedenen Zeitwerten nach Repression des GALL-Promotors oder von Depletions- und Wildtypstämmen auf Grund der unterschiedlichen Degradationsmuster von Gcd11-myc nur schlecht möglich sind, wurde ein direkter Vergleich der Depletion verschiedener Translationsinitiationsfaktoren angestrebt. Dafür wurden neben pGALL-CDC123 folgende Depletionsstämme ausgewählt, welche im Rahmen einer Diplomarbeit hergestellt und charakterisiert worden waren (Weinzierl, 2011): pGALL-SUI2 (Depletion von eIF2α), pGALL-SUI3 (eIF2β), pGALL-ha3-GCD1 (eIF2Bγ), pGALL-TIF5 (eIF5) und pGALL-CDC33 (eIF4E). Die Depletion des Cap-Bindeproteins eIF4E (Cdc33) diente als Kontrolle, da der Vergleich mit einem Wildtypstamm aus den oben erläuterten Gründen nicht möglich war und kein Effekt der Cdc33-Depletion auf die eIF2-Integrität erwartet wurde.

Die Expression des GALL-Promotors wurde für 15 h reprimiert mit Ausnahme von CDC123: Da die Versuche in Abschnitt 4.3.1 gezeigt hatten, dass CDC123 durch den GALL-Promotor stark überexprimiert wird und die Effekte der Depletion deutlich später eintreten als bei der Depletion von eIF2, wurde bei pGALL-CDC123 neben dem 15 h-Wert auch ein 24 h-Wert untersucht. Wie erwartet waren die Auswirkungen der Cdc123-Depletion nach 15 h nur gering, weshalb in Abb. 4.7 nur der 24 h-Wert gezeigt ist.

Alle Depletionen zeigen die erwarteten Auswirkungen auf den Zellzyklus (Abb. 4.7b): Die Depletion von eIF2 (Sui2 bzw. Sui3), eIF2B (Gcd1) oder Cdc123 führen zu einem deutlichen Arrest in der G1-Phase, die Depletion von Tif5 oder Cdc33 dagegen nicht (Weinzierl, 2011).

Nach Depletion des Cap-Bindeproteins Cdc33 (Spur 6 in Abb. 4.7a) ist die Interaktion von Gcd11-myc mit Sui2, Sui3 und Cdc123 deutlich nachweisbar. Die co-präzipitierten Mengen wurden als Referenz für die Depletion der anderen Initiationsfaktoren verwendet.

Bei den Stämmen pGALL-SUI2 (Spur 1)und pGALL-SUI3 (Spur 2) ist die Depletion der entsprechenden eIF2-Untereinheiten in den Proteinlysaten sichtbar. Wie zu erwarten, verringert sich dadurch auch die Interaktion von Gcd11-myc mit dem entsprechenden Protein. Bei der Depletion von Sui3 ist die Interaktion der anderen beiden eIF2-Untereinheiten (Gcd11-myc und Sui2) unbeeinträchtigt, die Bindung von Sui2 an Gcd11 ist also unabhängig von Sui3. Dagegen ist bei der Depletion von Sui2 eine Abnahme der Interaktion von Gcd11-myc mit Sui3 erkennbar (im Vergleich zur Depletion von Cdc33);

möglicherweise stabilisiert die Bindung von Sui2 also die Sui3-Gcd11-Interaktion. Die Interaktion von Gcd11-myc mit Cdc123 wird durch die Depletion von Sui2 oder Sui3 nicht beeinflusst.

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Abbildung 4.7: Die Depletion von Cdc123, aber nicht die Depletion von Translationsinitiationsfaktoren beeinträchtigt die Interaktion von Gcd11 mit Sui2 und Sui3.

Die Stämme W9798 (natNT2-pGALL-SUI2 myc13-HIS3MX6), W9802 (natNT2-pGALL-SUI3 GCD11-myc13-HIS3MX6), W9788 (natNT2-pGALL-CDC123 GCD11-GCD11-myc13-HIS3MX6), W9822 (natNT2-pGALL-ha3-GCD1 GCD11-myc13-HIS3MX6), W9847 TIF5 GCD11-myc13-HIS3MX6) und W9943 (natNT2-pGALL-CDC33 GCD11-myc13-HIS3MX6) wurden in XYRG bei 25°C angezogen, in der exponentiellen Wachstumsphase in XYD umgesetzt und nach 15 h bzw. 24 h im Fall von W9788 geerntet.

a, Aus den Proteinlysaten wurde Gcd11-myc mittels 9E10-Antikörper immunpräzipitiert. Lysate (WCE) und Präzipitate (α-myc IP) wurden im Western Blot mittels 9E10-Antikörper, Antiseren für Sui2 und Sui3 und affinitätsgereinigtem Antiserum für Cdc123 analysiert. Bei den Präzipitaten wurde die Signalstärke der Western-Blot-Banden mittels der Software des Odyssey Imagers quantifiziert und unter den entsprechenden Banden in % angegeben, wobei das Signal in Spur 6 (Depletion von Cdc33) als Referenz (Signalstärke = 100%) verwendet wurde.

b, Zur Analyse der Zellzyklusprogression wurden Ethanol-fixierte Proben mit Sytox Green gefärbt und im Durchflusszytometer gemessen.

c, Der Forward Scatter (FSC) der Zellen wurde im Durchflusszytometer gemessen und als Box-Plot dargestellt.

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Die Repression von pGALL-CDC123 (Spur 3) führt zur Reduktion der Cdc123-Menge im Lysat und in der Immunpräzipitation von Gcd11-myc. Außerdem ist die Interaktion von Gcd11-myc mit Sui2 und Sui3 verringert, wie nach den Ergebnissen aus Abschnitt 4.3.1 erwartet.

Bei der Depletion einer eIF2B-Untereinheit durch Repression von pGALL-ha3-GCD1 (Spur 4) wird die Interaktion von Gcd11-myc mit Sui2 und Cdc123 nicht beeinträchtigt, wohingegen die Interaktion von Gcd11-myc mit Sui3 leicht abnimmt. Die Depletion der anderen essentiellen eIF2B-Untereinheiten (Gcd2 = eIF2Bδ, Gcd6 = eIF2Bε und Gcd7 = eIF2Bβ) lieferte das gleiche Ergebnis (Daten nicht gezeigt). Dies könnte darauf hinweisen, dass die Bindung von Sui3 an Gcd11 schwächer ist, wenn dieses GDP und nicht GTP gebunden hat. eIF2B könnte die Sui3-Gcd11-Interaktion in diesem Fall sowohl durch die Bindung des eIF2-GDP-Komplexes als auch durch die Beschleunigung des GDP-GTP-Austausches stabilisieren.

Die Depletion von Tif5 (Spur 5), welches zusammen mit dem ternären Komplex und weiteren Initiationsfaktoren als Multifaktorkomplex (MFC) zum 40S-Ribosom rekrutiert wird und nach der Erkennung des Startcodons die GTPase-Aktivität von eIF2 stimuliert (vgl. 3.2), hat keine eindeutige Auswirkung auf untersuchten Interaktionen: Die Interaktion von Gcd11-myc mit Sui2 ist nicht beeinträchtigt, die Interaktion von Gcd11-myc mit Sui3 und Cdc123 könnte dagegen leicht reduziert zu sein. Da der Nachweis von Sui3 und Cdc123 auf dem gleichen Western Blot erfolgte, kann jedoch nicht gänzlich ausgeschlossen werden, dass ein Beladungsfehler vorlag.

Insgesamt wird die Interpretation der Ergebnisse allerdings durch die Unterschiede hinsichtlich der Gcd11-myc-Degradation erschwert. Da die Präzipitation und die Detektion von Gcd11-myc über das C-terminale myc-Epitop erfolgten, handelt es sich bei den nachgewiesenen Degradationsformen wahrscheinlich um N-terminal verkürzte Proteine. Die N-terminale G-Domäne von Gcd11 ist jedoch wichtig für die Interaktion mit Sui3 (Yatime et al., 2007), während Sui2 an Domäne II bindet (Yatime et al., 2006) und Cdc123 an Domäne III (vgl. 4.5). Demnach könnte die N-terminal verkürzte Form von Gcd11-myc mit Sui2 und Cdc123 interagieren, aber hinsichtlich der Interaktion mit Sui3 beeinträchtigt sein, was zu einer verringerten Co-Präzipitation von Sui3 führen würde. Die verringerte Co-Präzipitation von Sui3 bei Depletion von Sui2, Cdc123 oder ha-Gcd11 im Vergleich zur Depletion von Cdc33 lässt sich jedoch nicht auf die verstärkte Degradation von Gcd11-myc zurückführen, da die präzipitierte Menge an vollständigem Gcd11-myc in allen Stämmen ähnlich ist.

Auch bei weiteren Versuchen zur Immunpräzipitation von Sui2-myc oder flag-Sui3 aus Depletionsstämmen traten Unterschiede hinsichtlich der Proteinstabilität und der Entstehung von Degradationsformen auf und erschwerten eine eindeutige Aussage (Daten nicht gezeigt). Trotzdem lässt sich folgern, dass die bei der Depletion von Cdc123 beobachtete Abnahme der Interaktion aller drei eIF2-Untereinheiten keine generelle Konsequenz einer beeinträchtigten Translationsinitiation ist, sondern die spezifische Folge fehlender Cdc123-Funktion.

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