4. ERGEBNISSE
4.5 Cdc123 interagiert mit der C-terminalen Domäne von Gcd11
Durch Strukturuntersuchungen des zu eIF2 homologen Faktors aus Archäen ist bekannt, dass Gcd11 aus drei Domänen besteht und dass die N-terminale G-Domäne mit Sui3 interagiert und Domäne II mit Sui2 (Yatime et al., 2006; Yatime et al., 2007). Folglich war es von Interesse zu klären, mit welcher Gcd11-Domäne Cdc123 interagiert.
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4.5.1 Die C-terminale Region von Gcd11 ist hinreichend und notwendig für die Bindung an Cdc123
Einen wichtigen Hinweis auf die Bindungsstelle von Cdc123 lieferte ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screen für Cdc123-Interaktionspartner (vgl. Anhang 9.2.4): Dabei wurde ein Fragment von Gcd11 identifiziert, welches die C-terminalen Aminosäuren 410-527 enthält und sehr stark mit Cdc123 interagiert. In der Folge wurden weitere Gcd11-Fragmente kloniert und im Hefe-Zwei-Hybrid-System auf Interaktion mit Cdc123, Sui2 und Sui3 getestet (Abb. 4.14a).
Das im Screen isolierte C-terminale Fragment 410-527 interagierte mit Cdc123 genauso gut wie wt-Gcd11 (1-527); der C-Terminus von wt-Gcd11 ist also hinreichend für die Interaktion mit Cdc123. Ohne gleichzeitige Expression von LexA-Cdc123 war die Überexpression von AD-Gcd11(410-527) leicht toxisch und bei Co-Expression von LexA-Sui2 oder -Sui3 sogar letal. Ein noch kürzeres C-terminales Fragment (433-527) zeigte keine Interaktion mit Cdc123 (oder Sui2 und Sui3), dies könnte jedoch darauf zurückzuführen sein, dass die Menge dieses Proteins stark reduziert war (Abb. 4.14b). Ein längeres Fragment, welches die Domänen II und III enthält (310-527), zeigte zwar keine Interaktion mit Cdc123, allerdings war die Überexpression dieses Gcd11-Fragments letal und die Zellen konnten durch die Expression von LexA-Cdc123 (nicht aber von LexA-Sui2 oder -Sui3) gerettet werden. Die Toxizität der Gcd11-Fragmente 310-527 und 410-527 lässt sich möglicherweise dadurch erklären, dass sie cytoplasmatisches Cdc123 binden und dadurch dessen Funktion behindern. Die Expression von LexA-Cdc123 rettet die Zellen, weil nun mehr Cdc123 zur Verfügung steht. Warum nur das Fragment 410-527 im Reporterassay eine Interaktion mit LexA-Cdc123 zeigt, das längere Fragment 310-527 jedoch nicht, lässt sich nicht eindeutig klären. Es ist denkbar, dass die Gcd11-Domäne II, welche im Protein 310-527 enthalten ist, durch Interaktion mit cytoplasmatischen Proteinen (z.B.
Sui2) den Kernimport behindert.
Die Bedeutung des Terminus von Gcd11 für die Interaktion mit Cdc123 wurde auch durch die C-terminale Verkürzung von Gcd11 unterstrichen: Selbst eine Verkürzung um nur 13 Aminosäuren (1-514) führt zu einem Verlust der Interaktion mit Cdc123. Außerdem verhindert diese Verkürzung auch die Interaktion mit Sui2 und Sui3. Dies war unerwartet, da Sui3 an die G-Domäne und Sui2 an die Domäne II bindet (Yatime et al., 2006; Yatime et al., 2007), weshalb die Verkürzung 1-514 im folgenden Abschnitt (4.5.2) näher untersucht wurde.
Die anderen untersuchten Verkürzungen (1-309, 310-432 und 1-432) zeigten keine Interaktion mit Cdc123 oder Sui3. Nur 310-432 interagierte sehr schwach mit Sui2, was die Bedeutung von Gcd11-Domäne II für diese Interaktion bestätigt.
Die C-terminale Region von Gcd11 ist also notwendig und hinreichend für die Interaktion mit Cdc123.
In Kombination mit Sui2 und Sui3 zeigte nur Wildtyp-Gcd11, aber keine der Verkürzungen eine starke Interaktion. Ein ähnliches Ergebnis wurde auch in Präzipitationsstudien mit GST-Gcd11 beobachtet
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(Alone und Dever, 2006). Eine mögliche Erklärung ist, dass für eine effiziente Bindung von Sui2 und Sui3 zuvor die Interaktion von Gcd11 mit Cdc123 notwendig ist, weshalb C-terminale Verkürzungen, die nicht mit Cdc123 interagieren, auch keine (oder nur sehr schwache) Interaktion mit Sui2 und Sui3 zeigen können.
Abbildung 4.14: Der C-Terminus von Gcd11 ist wichtig für die Interaktion mit Cdc123.
Der Y2H-Reporter-Stamm W276 wurde mit pJG4-5-Derivaten und den Plasmiden pEG202 (LexA), pWS1463 (LexA-Cdc123), pWS1537 (LexA-Sui2) und pWS1535 (LexA-Sui3) cotransformiert. Bei den pJG4-5-Derivaten handelte es sich um pWS1513, pWS2031, pWS2047, pWS2877, pWS2878, pWS3413, pWS3472 und pWS3473, welche für AD-Fusionen der angegebenen Gcd11-Varianten codieren.
a, Jeweils 4 Transformanden wurden in H2O resuspendiert und auf eine SRG-HT-Platte gestempelt. Nach 3 Tagen bei 25°C wurden die Zellen mit X-Gal-Agar überschichtet und bei 30°C inkubiert, bis die Blaufärbung deutlich sichtbar war.
b, Je ein Transformand mit pWS1463 und den verschiedenen pJG4-5-Derivaten wurde in XYR bei 25°C kultiviert und der GAL-Promotor für 3 h durch Zugabe von 2% Galaktose induziert. Die AD-Gcd11-Fusionen wurden in den Proteinlysaten mittels Western-Blot-Analyse mit 12CA5-Antikörper nachgewiesen.
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4.5.2 Eine C-terminale Verkürzung von Gcd11 führt zu verringerter Interaktion mit Cdc123, reduzierter eIF2-Komplexbildung und Letalität
Im Hefe-Zwei-Hybrid-System bewirkte eine C-terminale Gcd11-Verkürzung um nur 13 Aminosäuren (1-514) den vollständigen Verlust der Interaktion mit Cdc123, Sui2 und Sui3. Die Auswirkung auf die Interaktion mit Cdc123 lässt sich dadurch erklären, dass Cdc123 an die C-terminale Domäne von Gcd11 bindet. Die Reduktion der Interaktion mit Sui2 und Sui3 ist möglicherweise eine Folge der verringerten Interaktion mit Cdc123. Allerdings ist beim Hefe-Zwei-Hybrid-System eine gewisse Vorsicht geboten, da es einige Limitationen aufweist: Erstens kann die Fusion der Interaktionspartner mit DNA-Bindungs- und Transkriptionsaktivierungsdomänen deren Interaktion beeinflussen.
Zweitens muss die Interaktion im Zellkern stattfinden: Wenn eines der beiden Fusionsproteine nicht im Zellkern lokalisiert, ist der Interaktionsnachweis nicht möglich. Drittens ist die Sensitivität des Reporterassays begrenzt, so dass schwache Interaktionen teilweise nicht nachweisbar sind oder keine Unterscheidung zwischen starken und sehr starken Interaktionen möglich ist.
Abbildung 4.15: Die C-terminale Verkürzung von Gcd11 beeinträchtigt die Interaktion mit Cdc123, Sui2 und Sui3 und ist letal.
a, Die heterozygot diploiden Stämme W10266 (GCD11/GCD11-ha3-kanMX6 CDC123/CDC123-myc13-HIS3MX6) und W10267 (GCD11/gcd11Δ514-ha3-kanMX6 CDC123/CDC123-myc13-HIS3MX6) wurden in XYD bei 25°C kultiviert und in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet. Aus den Proteinlysaten wurde Gcd11-ha bzw.
Gcd11Δ514-ha mit 12CA5-Antikörper immunpräzipitiert. Lysate (WCE) und Präzipitate (α-ha IP) wurden im Western Blot mit 12CA5- und 9E10-Antikörpern und spezifischen Antiseren für Sui2 und Sui3 analysiert.
b, Die heterozygot diploiden Stämme W10194 (GCD11/GCD11-ha3-kanMX6) und W10195 (GCD11/gcd11Δ514-ha3-kanMX6) wurden einer Tetradenanalyse auf XYD unterzogen und anschließend bei 25°C inkubiert (Abkürzungen: wt = Wildtyp, h = GCD11-ha3-kanMX6; Sporen mit dem Genotyp gcd11Δ514-ha3-kanMX6 waren nicht lebensfähig).
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Um die Auswirkungen der Gcd11-Verkürzung auf die Interaktion mit Cdc123, Sui2 und Sui3 zu überprüfen, wurde in einem diploiden Stamm eine der beiden GCD11-Kopien am 3‘Ende verkürzt, so dass die Codons für die letzten 13 Aminosäuren fehlen, und mit dem ha-Epitop fusioniert (gcd11Δ514-ha3). Als Kontrolle diente ein Stamm, in dem GCD11 mit dem ha-Epitop fusioniert, aber dabei nicht verkürzt wurde (GCD11-ha3). Außerdem wurde in beiden Stämmen eine der beiden CDC123-Kopien mit einem myc-Epitop markiert. Eine Immunpräzipitation von Gcd11-ha und Gcd11Δ514-ha zeigte eine stark verringerte Interaktion der verkürzten Form mit Cdc123-myc, Sui2 und Sui3 (Abb. 4.15a) und bestätigt damit die Ergebnisse des Hefe-Zwei-Hybrid-Experiments. In der Tetradenanalyse waren Sporen mit dem gcd11Δ514-ha-Allel nicht lebensfähig, während GCD11-ha zu etwas kleineren Kolonien führt als Wildtyp-GCD11 (Abb. 4.15b). Diese Resultate unterstreichen die Bedeutung des C-Terminus von Gcd11 für die Interaktion mit Cdc123 und für die Assemblierung eines funktionalen eIF2-Komplexes. Dies steht in Einklang mit dem Modell, dass Cdc123 die Assemblierung des eIF2-Komplexes bewirkt.