2.7.1.1. Virusisolation
Die Virusanzüchtung auf Zellkulturen gelingt auf verschiedenen Schweine-Zelllinien.
Da PCV2 jedoch keinen zytopathogenen Effekt hervorruft, wird der eigentliche
Virusnachweis mit einem immunzytochemischen Verfahren (siehe 2.7.3.), der In-situ-Hybridisation (siehe 2.7.2.2.) oder mittels Elektronenmikroskopie (siehe 2.7.1.2.) durchgeführt (ALLAN et al. 1998).
2.7.1.2. Elektronenmikroskopie
STEVENSON et al. (1999) haben PCV auf porzinen Nierenzellkulturen (PK-15) angezüchtet und anschließend die Ultrastrukturen untersucht. Sie fanden neben einer großen Anzahl von intrazytoplasmatischen Einschlüssen meistens im perinukleären Raum auch vereinzelt runde bis ovale und elektronendichte
intranukleäre Einschlüsse. Es gab zwei Typen; der erste war klein (0,1-0,5 µm) und einige enthielten im Durchmesser 10-14 nm große lockere Aggregate von
ikosahedralen Nukleokapsiden oder kaum geformte parakristalline Bereiche. Der zweite Typ hatte größere (0,5-5 µm) und zahlreichere Einschlüsse, die von einer trilaminaren Membran umrandet waren. Ihre Elektronendichte war größer als die der kleinen Einschlüsse und sie enthielten unterschiedliche Mengen an
Virionenaggregaten. Meistens formierten sich die Virionen zu parakristallinen Bereichen, manchmal auch zu losen Aggregaten. Intranukleäre Einschlüsse waren nicht membrangebunden und oft mit kleinen Nukleoli und Aggregaten von
Heterochromatin assoziiert.
2.7.2. Genomnachweis
2.7.2.1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Die im Moment gebräuchlichste Methode des PCV2-Genomnachweises stellt die PCR dar. Dieses Verfahren wurde von MULLIS et al. (1986) entwickelt und ist durch seine Schnelligkeit, eine hohe Sensitivität und Spezifität gekennzeichnet. Bei dieser Nachweismethode wird ein definiertes Stück DNA von dem gesuchten Virus (oder Bakterium) enzymatisch vervielfältigt. Diese Amplifikationsprodukte werden dann zum Beispiel bei einer Agarose-Gelelektrophorese mittels Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht. Mittels PCR konnte in diversen Organen (Lymphknoten, Lunge, Leber, Milz, Nieren und Pankreas) PCV2 nachgewiesen werden (MOROZOV et al.
1998; MC NEILLY et al. 1999; ROSSEL et al. 1999; TSCHACHTSCHAL 2000). Das Ergebnis ist rein qualitativ, eine quantitative Aussage zum gesuchten Agens kann hier nicht gemacht werden. Nachteilig kann zudem die hohe Sensitivität der Methode sein, da auch sehr geringe Mengen des pathogenen Agens nachgewiesen werden,
die nicht zur klinischen Symptomatik des Tieres geführt haben muss. Auch
Genomfragmente von nicht mehr vermehrungsfähigen Virus können nachgewiesen werden. ALBORALI et al. (2001) haben die Immunhistochemie (ICH),
Immunfluoreszenz (IF) und PCR an demselben Probenmaterial verglichen. Die Ergebnisse von IHC und IF waren identisch, die PCR jedoch stimmte nur zu 70,3%
mit den Ergebnissen der anderen beiden Methoden überein. Einige klinisch unauffällige Bestände, die im IF und IHC negativ waren sind mittels PCR als PCV2-positiv eingestuft worden. Die Autoren sehen einen Grund dafür in der
höheren Sensitivität der Methode. Eine ähnliches Ergebnis erbrachte die Studie von BUFFEREAU et al. (2001). Sie haben Proben gleichzeitig mit PCR und ISH
untersucht, wobei auch hier die PCR die höhere Sensitivität aufwies. Eine gleichzeitige histologische Untersuchung der Proben zeigte, dass es auch
PCR-positive Proben ohne histologische Veränderungen gab. Diese hohe Sensitivität muss bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden.
2.7.2.2. In-situ-Hybridisation (ISH)
Mit der Technik der ISH lässt sich virale oder bakterielle DNA bzw. RNA in formalinfixierten und Paraffin eingebetteten Geweben nachweisen. Mittels einer Sonde aus Nukleinsäure, die komplementär zu der gesuchten Genomsequenz ist, wird die DNA bzw. RNA unter dem Lichtmikroskop durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht. Der Vorteil dieser Nachweismethode liegt darin, dass man das gesuchte infektiöse Agens im Zusammenhang mit dem histopathologischen Bild sieht.
Verschiedene Autoren fanden auf diese Weise bei an PMWS erkrankten Ferkeln PCV in Lymphknoten, Tonsille, Milz, Leber, Lunge, Niere, Pankreas, Herz und Dünn-und Dickdarm. Virale Zielzellen waren besonders Makrophagen Dünn-und mononukleäre Zellen in den lymphatischen Organen; aber auch in Enterozyten, Hepatozyten, Alveolarmakrophagen, renalen Tubuluszellen und in kapillären Endothelien des Herzens konnte PCV nachgewiesen werden (ELLIS et al. 1998; MOROZOV et al.
1998; CHOI u. CHAE 1999; MC NEILLY et al.1999 und ROSELL et al. 1999). In neueren Studien wurde speziell auf PCV Typ 2 untersucht (MORVAN et al. 2001).
Der Autor sieht einen Vorteil in dieser Methode darin, dass retrospektive Studien an archivierten formalinfixierten und in Paraffin gebetteten Geweben durchgeführt werden können und eine Aussage über die Quantität des gesuchten Agens getroffen werden kann.
2.7.3. Antigennachweis
2.7.3.1. Immunhistochemie (IHC)
Bei diesem Verfahren wird das gesuchte Antigen mittels speziell markierter
Antikörper, die an das gesuchte Antigen binden, sichtbar gemacht. SORDEN et al.
(1999) berichten, dass diese Methode billiger und schneller als die ISH sei. Nach MC NEILLY et al. (1999) sind sowohl die IHC als auch die ISH gut geeignet, um asservierte formalinfixierte und in Paraffin gebettete Gewebe retrospektiv zu
untersuchen. Sie benutzten für die IHC polyklonales PCV2-Antiserum von Kaninchen. An diese wurden im zweiten Schritt biotinisierte
Anti-Kaninchen-Antikörper gebunden; der Komplex wurde mittels Streptavidin-Peroxidase-Konjugat sichtbar gemacht.
2.7.3.2. Immunzytochemie
Mit immunzytochemischen Verfahren kann Virusantigen in infizierten Zellen nachgewiesen werden. Dies ist zum Beispiel für den Nachweis von nicht
zytopathogenen Viren in Zellkulturen notwendig oder auch als Schnellmethode für den Nachweis von Virusantigen in Organ-Gefrierschnitten geeignet. Dazu werden an Immunglobuline Fluorochrome (Immunfluoreszenztest / IFT) oder Enzyme
(Immunperoxidasetest / IPT) gekoppelt. Bei einer Bindung zwischen Antikörper und gesuchten Virus-Antigen kann man eine Farbreaktion provozieren und somit die Lokalisation des Antigens sichtbar machen. ALLAN et al. (1998) haben mittels indirektem Immunfluoreszenstest (IIFT) und ISH die Virusanzucht auf Zellkulturen ausgewertet. Im ersten Schritt inokulierten sie die Zellkulturen mit einem
Schweineserum, welches auch Antikörper gegen PCV enthielt. Für den zweiten Schritt benutzten sie Kaninchen-anti-Schwein-Antikörper, an die Fluorescein-Isothiozyanat zur Sichtbarmachung konjugiert war.
2.7.4. Nachweis von Antikörpern
2.7.4.1. Indirekter Immunfluoreszenztest / Indirekter Immunperoxidasetest
Antikörper lassen sich in Analogie zu dem unter 2.7.3.2 beschriebenen IIFT und IIPT nachweisen (ALLAN et al. 1998; ELLIS et al. 1998; MC NEILLY et.al. 1999; ROSELL et al. 1999 und SORDEN et al. 1999). Eine mit PCV2 infizierte Zellkultur wird mit dem zu untersuchenden Serum inkubiert. Im nächsten Schritt wird mit markierten Antikörpern inkubiert, die gegen die ersten Antikörper gerichtet sind. Die bereits oben beschriebene Farbreaktion zeigt letztendlich das Ergebnis. Dieses Verfahren ist jedoch relativ aufwendig und nicht für die Routinediagnostik geeignet.
2.7.4.2. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Mit dem ELISA können allgemein virale Antigene (siehe 2.7.3.) und
virusspezifische Antikörper nachgewiesen werden. Für den Antikörpernachweis benötigt man eine „feste Phase“, zumeist Polysterol-Mikrotiterplatten mit
hochgereinigtem viralem Antigen. Auf die feste Phase wird das zu untersuchende Serum gegeben und inkubiert. Hier kommt es zu einer Bindung der spezifischen Antikörper mit dem vorgegebenen Antigen. Durch Zugabe eines konjugierten Antikörpers gegen die Antikörper der untersuchten Tierart kommt es wiederum zu einer Bindung. Über das Konjugat können dann Farbreaktionen erzeugt werden.
Mehrere Autoren beschreiben die Entwicklung und Erprobung eines kompetitiven ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen PCV2 (HARDING et al. 1999;
WALKER et al. 2000). HARDING et al. (1999) weisen damit den Antikörper-Typ Immunglobulin G (IgG) nach, der spezifisch gegen PCV2 gerichtet ist.
WALKER et al. (2000) postulieren, dass man mit dem von ihnen entwickelten ELISA weltweit und auch mit Seren verschiedener Spezies arbeiten kann.
2.8. Erregerinteraktionen
2.8.1. Erregerinteraktionen mit PRRSV
PRRSV ist ein RNA-Virus aus der Familie der Arteriviridae. Es ist verantwortlich für das weitverbreitete Krankheitsbild des „porcine reproductive and respiratory
syndrome“ (PRRS) (PLONAIT 2001b).
PRRSV wird von mehreren Autoren in Zusammenhang mit dem Krankheitsbild PMWS gebracht. ALLAN et al. (2000a) infizierten Kolostrum-frei aufgezogene Ferkel mit PRRSV oder PCV2 allein und mit PRRSV und PCV2 kombiniert.
Pathomorphologische und -histologische Βefunde zeigten nur Ferkel der kombiniert infizierten Gruppe, PRRSV-Antigen wurde nur geringgradig bei je einem Tier der doppelt und einfach infizierten Gruppe nachgewiesen. PCV2-Antigen konnte bei allen Ferkeln gefunden werden, die auch damit infiziert wurden. Jedoch war die
Antigenmenge im Gewebe bei den doppelt infizierten höher als bei den allein mit PCV2 infizierten. Die Autoren folgern daraus, dass eine Koinfektion mit PRRSV die PCV2-Replikation und auch die Ausprägung der histologischen Läsionen verstärkt (ALLAN et al. 2000a; STEVENSON et al. 2000). Dies ließe sich damit begründen, dass eine Immunsuppression oder Aktivierung von Monozyten / Makrophagen stattfindet (STEVENSON et al. 2000). Viren wie PRRSV oder PPV könnten aber auch die Replikation der Zielzellen von PCV2 induzieren, so dass eine größere Anzahl von Zellen in der S-Phase vorliegt, die PCV2 zur Replikation nutzen kann (STEVENSON et al. 2000).
Einen weiteren Infektionsversuch führten PLANA-DURAN et al. (1999) durch. Sie infizierten sieben Ferkel in einem Alter von drei Wochen intranasal mit einem PCV2-Isolat. Da die Muttersau dieser Ferkel am 90.Trächtigkeitstag mit PRRSV infiziert wurde, hatten die Ferkel zum Zeitpunkt der PCV2-Inokulation eine PRRSV-Virämie.
Die meisten der infizierten Ferkel zeigten nach der PCV2-Infektion Fieber und reduzierte Tageszunahmen. Mikroskopisch konnten deutliche bis mäßige Läsionen, wie sie für PMWS typisch sind, gefunden werden.
In Feldstudien wurde PRRSV in den USA bei etwa 60% der PMWS-Fälle gefunden, in West-Kanada bei 20% (ALLAN u. ELLIS 2000). SEGALES et al. (2000a) konnten in Spanien, wo PRRSV weitverbreitet ist, bei 23,8 % der untersuchten Tiere mit PMWS (n = 277) mittels ISH PRRSV-Antigen in Lunge und Tonsille nachweisen.
Mehrere Autoren berichten von PMWS-Ausbrüchen sowohl in PRRS-positiven als auch PRRS-negativen Herden (HARDING 1996; LE CANN et al. 1997; HARDING et al. 1998).
Aus diesen Gründen schätzt man PRRSV als Hilfsfaktor am PMWS-Geschehen ein, jedoch nicht als kausale Ursache (ELLIS 1999; MADEC et al. 2000).
HARDING et al. (1998) fanden PMWS in klinisch und serologisch PRRSV-freien Beständen. Sie machen in ihrer Publikation deutlich, dass sich das morphologische Bild einer PRRS-Virus-Infektion von PMWS durch verschiedene spezielle
Veränderungen unterscheiden läßt:
Ikterus, Hepathopathien, Depletion von Lymphgewebe und Nierenläsionen sind typisch für PMWS; eine Proliferation des lymphatischen Gewebes und fehlende Leber- und Nierenveränderungen sprechen für eine PRRSV-Infektion (HARDING et al. 1998). In synzytialen Riesenzellen konnte noch nie virale RNA oder Protein von PRRSV nachgewiesen werden, jedoch wurde diese Zellform häufig bei PCV2-infizierten Tieren vorgefunden und zudem Virusstrukturen darin nachgewiesen (ELLIS 1999). Klinisch findet man bei PRRS eine erhöhte Sterblichkeit bei Neugeborenen, jedoch nicht bei abgesetzten Ferkeln (ELLIS 1999).
Nach Auftreten des klinischen Bildes von PDNS suchte man nach einer infektiösen Ursache. PRRSV konnte dabei mehrfach nachgewiesen werden, so dass einige Autoren einen kausalen Zusammenhang zwischen PRRSV und PDNS sahen (DURAN et al. 1997; SEGALES et al. 1998a; THIBAULT et al. 1998). DURAN et al.
(1997) beschreiben PDNS-Symptome in zwei Betrieben; sie fanden bei einem Tier Antikörper gegen PRRSV, konnten jedoch bei keinem Virus bzw. Antigen
nachweisen. THIBAULT et al. (1998) konnten PRRSV-Antigen mittels
immunhistochemischer Verfahren in Makrophagen in der Umgebung der betroffenen nekrotischen Gefäße in Haut und Niere nachweisen. Außerdem fanden sie mittels PCR PRRSV in Lunge und Milz von allen zwölf untersuchten Schweinen. In nachfolgenden Studien wurde auch nach PCV2 gesucht und dies auch in den meisten von PDNS betroffenen Fällen gefunden (SEGALES et al. 1998a; ALLAN et al. 2000b; PERITOGIANNI 2000; ROSELL et al. 2000a). CHOI und CHAE (2001) konnten bei fünf natürlich infizierten PDNS-Tieren PRRSV- und PCV2-Genome in Niere, Lymphknoten und Tonsille nachweisen; in der Haut fanden sie nur PRRSV und in Leber und Lunge nur PCV2.
ALLAN et al. (2000b) berichten von PDNS-Fällen in Nord-Irland zu einer Zeit, als PRRSV dort noch nicht präsent war. Auch MADEC et al. (2000) bezweifeln einen primären kausalen Zusammenhang zwischen PRRSV und PDNS, da sie Tiere mit den für PDNS typischen Hautveränderungen in PRRSV-freien Beständen
vorgefunden haben.
Die proliferative und nekrotisierende Pneumonie (PNP) wurde erstmals Anfang der 1990 er Jahre beschrieben und wurde mit dem Swine Influenzavirus (SIV) (DEA et al. 1992) oder PRRSV (MAGAR et al. 1994) in Verbindung gebracht. Sowohl HINRICHS et al. (1999b) als auch PESCH et al. (2000) untersuchten 18 bzw. 192 solcher PNP-Lungen und konnten mittels PCR bei 14 Lungen (HINRICHS et al.
1999b) oder 85,4% PCV2 und PRRS gemeinsam nachweisen (PESCH et al. 2000).
Umfangreiche epidemiologische Studien zu speziell diesem Krankheitsbild, die Aufschluss über eine mögliche Kausalität einer PRRSV-Infektion bringen würden, liegen bisher nicht vor.
2.8.2. Erregerinteraktionen mit PPV
Das porzine Parvovirus (PPV) ist ein kleines, unbehülltes Virus, das beim Schwein das sogenannte SMEDI-Syndrom verursachen kann. SMEDI steht für stillbirth, mummification, embryonic death und infertility und beschreibt somit verschiedene Fruchtbarkeitsstörungen bei Sauen. PPV ist weitverbreitet, wird jedoch durch eine regelmäßige Immunprophylaxe bekämpft (PLONAIT 2001a).
Mehrere Arbeitsgruppen (ALLAN et al. 1999; ELLIS et al. 1999; KENNEDY et al.
2000; KRAKOWKA et al. 2000) infizierten Gnotobioten bzw. Kolostrum-frei aufgezogenen Ferkel mit PCV2 und / oder PPV. Alle Gruppen berichten von den deutlichsten PMWS-Veränderungen bei den doppelt-infizierten Ferkeln. Infektionen mit PPV alleine liessen die Tiere nicht erkranken und zeigten maximal histologisch eine geringgradige interstitielle Nephritis (KENNEDY et al. 2000). Bei den PCV2 infizierten Ferkeln konnten dieselben Läsionen histologisch gefunden werden, wie bei der PCV2 / PPV-Infektion, nur in abgeschwächter Form (ALLAN et al. 1999;
KENNEDY et al. 2000).
KRAKOWKA et al. (2000) untersuchten neben PCV2 und PPV auch noch PCV1. Sie infizierten Gnotobioten intranasal mit PCV1, PCV2, PPV, PCV1/PCV2, PCV1 / PPV und PCV2 / PPV am ersten Lebenstag. Deutliche klinische und pathomorphologische bzw. -histologische Veränderungen wie bei PMWS zeigte lediglich die PCV2 / PPV-infizierte Gruppe; die Tiere der anderen Gruppen waren klinisch unauffällig. Die Autoren folgerten daraus, dass PCV2 essentiell ist, aber nicht allein ausreicht, um PMWS in gnotobiotischen Ferkeln zu produzieren (KRAKOWKA et al. 2000).
Diese Infektionsversuche zeigen, dass eine Koinfektion mit PPV und PCV2
Schweine für die Entwicklung des Krankheitsbildes PMWS prädisponiert (ALLAN et al. 1999). Da PPV endemisch in der Schweinepopulation ist, kann dieses Virus auch an dem Krankheitsbild von PMWS im Feld beteiligt sein (ALLAN et al. 1999).
So haben CHOI und CHAE (2000) und ELLIS et al. (2000) bei vier von zehn (CHOI u. CHAE 2000) bzw. bei zwölf von 69 (ELLIS et al. 2000) unter Feldbedingungen an PMWS erkrankten Ferkeln PPV-Genom bzw. -Antigen nachweisen können. Somit scheint PPV ein wichtiger Kofaktor in der Pathogenese von einigen PMWS-Fällen darzustellen (ELLIS et al. 2000). Eine mögliche Erklärung für die synergistische Wirkung von PPV und PCV2 könnte eine Induktion der Replikation von PCV2-Zielzellen durch PPV sein, so dass PCV2 mehr geeignete Replikationszellen (S-Phase) vorfindet (STEVENSON et al. 2000).
2.8.3. Erregerinteraktionen mit anderen viralen Erregern
RODRIGUEZ-ARRIOJA et al. (1999) untersuchten drei an PMWS erkrankte Ferkel von einem Betrieb. Sie fanden bei allen PCV2 (mittels ISH), bei zwei Tieren
zusätzlich AK- und bei einem auch PRRSV-Antigen (mittels Immunhistochemie).
BRATANICH et al. (1999) untersuchten, inwieweit Lentiviren am Krankheitsbild von PMWS beteiligt sind, indem sie zuerst die Aktivität der Reversen Transcriptase (RT) maßen und dann mittels PCR nach Lentiviren suchten. Die RT war erhöht, wie bei Lentivirus-Infektionen, aber Lentiviren selber wurden nicht nachgewiesen. Eine
mögliche Koinfektion von PCV2 und dem Hepatitis-E-Virus (HEV) erwähnen ELLIS et
al. (2001). Dafür sprechen Berichte von Betrieben, in denen Tiere mit
HEV-induzierten Leberveränderungen auftraten. Später wurden Reproduktionsprobleme beobachtet, bei denen Hepatitis als Primärläsion und auch PCV2 nachgewiesen wurden.
2.8.4. Erregerinteraktionen mit bakteriellen Erregern
Bei der Untersuchung von Schweinen mit PMWS-Symptomen wird regelmäßig von bakteriellen Sekundärinfektionen berichtet (CLARK u. HARDING 1998; DOMINGO u.
SEGALES 1999; HINRICHS et al. 1999a; TSCHACHTSCHAL 2000). Häufig werden eitrig-katarrhalische Bronchitiden, Serositiden, Arthritiden oder Enteritiden
beschrieben. In diesem Zusammenhang genannte Keime sind: Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis, Actinobacillus spp., Mycoplasmen, enteropathogene Escherichia coli und
Salmonellen (HINRICHS et al. 1999a; STRAUB 1999; TSCHACHTSCHAL 2000).
CLARK (1997) fand bei 5% der Lungen von PMWS-Schweinen Pneumocystis carinii.
CARRASCO et al. (2000) untersuchten zwölf Wochen alte Ferkel aus einem Bestand, die Probleme mit Kümmern, Fieber und gelegentlich blutigen Durchfall hatten. In der Sektion zeigten die Tiere insbesondere vergrößerte
Mesenteriallymphknoten und eine deutliche Verdickung der Darmwand von Jejunum und Ileum. Mittels ISH, licht- und elektronenmikroskopischer Untersuchung von verschiedenen Darmbereichen wurden sowohl Chlamydia spp. als auch PCV gefunden. Die Autoren versuchten die Infektion von Enterozyten mit den nur gering pathogenen Chlamydien zu begründen. Zum einen könnte eine Infektion mit PCV die Enterozyten direkt geschwächt haben, zum anderen begünstigt eine generalisierte Immunsuppression Sekundärinfektionen.
Es wurden diverse bakterielle Erreger in der Literatur beschrieben (Arcanobacterium pyogenes, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Fusobacterium
necrophorum, Bordetella bronchiseptica, Erysipelothrix rhusiopathiae, Salmonella spp., Mycoplasma spp.), die bei Tieren mit PDNS nachgewiesen wurden (DURAN et al. 1997; PERITOGIANNI 2000).
In 15 von 23 untersuchten PDNS-Fällen konnten THOMSON et al. (1998) kulturell Pasteurella multocida in Niere, Leber, Milz, Lymphknoten, Tarsalgelenkssynovia, Lunge oder Tonsille nachweisen. Mittels Elektrophorese fand man bei allen 15 Fällen Pasteurella multocida Typ 01, Kapsel Typ A. Die Autoren halten es für möglich, dass diese Pasteurellen ursächlich mit an diesem Krankheitsbild beteiligt sind.
SIERRA et al. (1997) vermuten einen Zusammenhang zwischen Streptococcus spp.
und der Pathogenese von PDNS, ähnlich der humanen komplexgebundenen
Streptokokkeninfektion. Andere Autoren spekulieren, dass der Gefäßschaden durch die Lipopolysaccharide von gram-negativen Bakterien verursacht wird (DURAN et al.
1997).