Bearbeitung des Probenmaterials

3.6.1. Genomnachweis von PCV2 mittels PCR aus Gewebeproben und Nasentupfer

Die bei der Sektion entnommenen und dann bei -20° C gelagerten Gewebeproben (inguinaler Lymphknoten) und die Nasentupfer wurden mittels Polymerase-Chain-Reaction (PCR) auf Genomfragmente von PCV2 untersucht.

Zur DNA-Extraktion aus Organgewebe wurde der Nucleospin C+T-Extraktionskit (Macherey-Nagel, Düren) verwendet. Dazu wurden 25mg Gewebe einer Probe mittels einer sterilen Skapellklinge vorzerkleinert und in ein 1,5ml safe-locked

Eppendorf-Gefäß gegeben. Hierzu wurde 180µl T-Lysispuffer und 25µl Proteinase-K-Lösung pipetiert und dies dann für 3 bis 12 Stunden bei 56°C unter ständigen

Schütteln bis zur Lysis inkubiert. Die Zugabe von 200µl Puffer B3 setzt die

Nukleinsäuren frei. Nach dem Schütteln der Probe wurde diese für 10 Minuten bei 70°C inkubiert. Anschließend führt die Zugabe von 210µl Ethanol (96%) zur

Präzipitation der DNA. Der Inhalt des Cup wurde dann in den Filtereinsatz der

Extraktionskolumnen überführt und dies dann bei 6000g für eine Minute zentrifugiert.

Der Filter, der die genomische DNA adsorbiert hat, wurde anschließend zweimal mit jeweils 500µl Puffer B5 gewaschen. Dazu wurde die Probe jeweils bei 6000g für eine Minute zentrifugiert und das Filtrat jeweils verworfen. Zur Beseitigung von

Waschpufferresten wurde abschließend die Probe nochmals für zwei Minuten bei 6000g zentrifugiert und dann der Filtereinsatz in ein 1,5ml safe-locked Cup gegeben.

Abschließend wurden 100µl des 70°C warmen Elutionspuffers BE auf den

Filtereinsatz gegeben und dieses für eine Minute bei 70°C inkubiert, damit die DNA aus dem Filter in die Lösung überführt wird. Die Zentrifugation bei 6000g für eine Minute beschleunigte diesen Vorgang.

Die Reagenzien zur Extraktion aus Nasentupfern wurden selbst angesetzt. Die genaue Zusammensetzung von Verdaupuffer und Proteinase-K-Stammlösung ist im Anhang aufgeführt. Die Nasentupfer wurden über Nacht zusammen mit 160 µl Verdaupuffer und 40 µl Proteinase-K-Stammlösung bei 56°C inkubiert. 100 µl dieser Lösung wurden für 10 Minuten auf 95°C erhitzt, um die Proteinase K zu inaktivieren.

Die Weiterverarbeitung dieser Proben war analog zu den Gewebeproben.

Anschließend wurde der Master-Mix unter sterilen Bedingungen mit dem Taq Core Kit (Quiagen GmbH, Hilden) und den nach MOROZOV et al. (1998)

PCV2-spezifischen Primern

PCV75 (GGG TGT TCA CGC TGA ATA ATC CTT CGG) und

PCV1073 (CCA GGA CTA CAA TAT CCG TGT AAC C) (MWG-Biotech AG, Ebersbach) hergestellt. 45 µl Mastermix enthalten folgende Substanzen:

5 µl 10 fach Taq Puffer 5 µl MgCl 2

0,5 µl DNTP Mix 25mM

1 µl Primer PCV 75 10 pm / µl 1 µl Primer PCV 1073 10 pm / µl 0,5 µl Taq Polymerase 5u / µl 32 µl Wasser

Für die Polymerase Chain Reaktion (PCR) wurde diese Lösung zur Template-DNA hinzugefügt und dann in den Thermocycler GeneAmp PCR System 9700 der Firma PE Applied Biosystems (Norwalk, USA) verbracht. Für 20 Sekunden erfolgte eine Denaturierung bei 94°C, Annealing für 20 Sekunden bei 62°C und Extension für 45 Sekunden bei 72°C. Nach 30 Zyklen (Gewebe) bzw. 40 Zyklen (Nasentupfer) folgte eine Extension von 7 Minuten. Die Auswertung erfolgte über Gelelektrophorese mit anschließender Photodokumentation. Dabei wurde die Bande mit der DNA-Leiter (DNA Molecular Weight Marker No. 6; 0,15-2,1 kbp / Boehringer, Mannheim) verglichen. Eine Bande von circa 1020 Basenpaare (bp) zeigte den Nachweis des gesuchten Genomfragments an (TSCHACHTSCHAL 2000).

3.6.2. Methodik des Antikörpernachweises

Alle serologischen Untersuchungen der Verlaufsstudie wurden vom Labor der Firma Intervet (Boxmeer, Niederlande) durchgeführt.

3.6.2.1. Methode des Antikörpernachweises gegen PCV2

Die Proben der Verlaufsuntersuchung wurden auf Antikörper gegen PCV2 mit Hilfe eines Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) untersucht. Dazu wurden die Vertiefungen einer Polystyrol Mikrotiter-Platte mit monoklonalen Antikörpern

beschichtet, die spezifisch gegen porzines Circovirus Typ 2 (PCV2) gerichtet waren.

Mögliche zusätzliche Bindungen wurden mit Kasein-Puffer blockiert und es wurde PCV2-Antigen (in Baculovirus exprimiert) zugegeben. Das System wurde mit aufsteigenden Verdünnungsstufen der zu untersuchenden Seren inkubiert. Danach wurde ein Biotin-markierter monoklonaler Antikörper gegen PCV2 auf das System gegeben und eine Bindung mittels Peroxidase konjugierten Avidin visualisiert. Der Cut-off wurde als eine Extinktion von 50% gemessen an den positiven und negativen Referenzen definiert.

Die Antikörperkonzentrationen von den untersuchten Proben wurden ermittelt als reziproker Wert (dargestellt als log2) der höchsten Serumverdünnung mit einer Extinktion unterhalb des Cut-off.

3.6.2.2. Methode des Antikörpernachweises gegen PRRSV

Die Proben der Verlaufsuntersuchung wurden auf Antikörper gegen PRRSV mit Hilfe eines Immunfluoreszenstests (IFT) untersucht. Die Seren wurden zu Beginn der Untersuchung durch eine 30 minütige Erhitzung auf 56°C inaktiviert. Sämtliche Seren wurden in serienmäßigen Zweifachverdünnungen auf Mikrotiterplatten pipettiert, die mit PRRSV (EU-Stamm bzw. US-Stamm) infizierten MA 104 Zellen beschichtet waren. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C wurden die Platten gewaschen.

Die Antikörper wurden durch eine spezifische Fluoreszensreaktion sichtbar gemacht, nachdem Anti-Schwein-Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Konjugat hinzugegeben wurde.

Den Wert der Antikörperkonzentration wurde als log2 des reziproken Werts der höchsten Serumverdünnungsstufe angegeben, in der eine spezifische Fluoreszenz sichtbar war.

3.6.2.3. Methode des Antikörpernachweises gegen PPV

Der Nachweis der Antikörper gegen PPV wurde nach den üblichen Methoden des Hämagglutination-Hemmungs-Test (HAHT) durchgeführt.

Der Wert der Antikörperkonzentration des Serums wurde als reziproker Wert der höchsten Verdünnungsstufe angegeben, die eine komplette Hemmung der Hämagglutination verusachte.

3.6.2.4. Methode des Antikörpernachweises gegen SIV

Der Antikörpernachweis gegen SIV, Subtyp H1N1 erfolgte nach den üblichen Methoden des Hämagglutinations-Hemmungs-Test (HAHT).

Der Wert der Antikörperkonzentration des Serums wurde als log2 der höchsten Verdünnungsstufe angegeben, die eine komplette Hemmung der Hämagglutination verursachte.

Die Antikörperkonzentrationen gegen SIV, Subtyp H3N2 wurde mit Hilfe eines ELISA ermittelt. Der Wert der Antikörperkonzentration des Serums wurde als reziproker Wert der höchsten Serumverdünnungsstufe berechnet mit einer Extinktion unterhalb des berechneten Cut-off Werts. Ausgedrückt wurde dieser als log2.

3.6.3. Bakteriologische Untersuchungen

Die bakteriologische Untersuchung wurde im Rahmen der Routinediagnostik in der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule in Bakum durchgeführt.

Bei Hinweisen auf das Vorliegen von bakteriellen Infektionen in der Sektion wurden gegebenenfalls Tupfer- und Organproben entnommen. Diese sind standardgemäß auf vier Fertignährböden, nämlich

1. Schokoladenagar mit Vitox (PO 5090 A)

2. Columbia-Agar mit Schafblut Plus (PB 5039 A) 3. Columbia-CNA Nährboden (PB 5049 A)

4. Gassner-Nährboden (PO 5021 A)

der Firma Oxoid (Wesel) ausgestrichen und für 16 bis 18 (aerob) bzw. für 48

Stunden (Schokoladenagar mikroaerophil) bei 37°C bebrütet worden. Anschließend fand eine Keimbestimmung nach den üblichen biochemischen und serologischen Methoden statt.

Bei vielen Tieren wurde routinemäßig eine Untersuchung auf Salmonellen mittels Anreicherungsverfahren (nach ISO 6579 modifiziert) durchgeführt. Dazu wurden die entnommenen Organteile (Gallenblase, Leber und mesenterialer Lymphknoten) von einem oder mehreren Tieren (wenn aus einem Bestand) zur Voranreicherung für 16 bis 18 Stunden in einer Verdünnung von 1:10 in gepuffertes Peptonwasser (CM 05099 B, Oxoid, Wesel) angesetzt. Danach wurde die Selektivbouillon Rappaport-Vassiliadis (CM 0866 B, Oxoid, Wesel) im Verhältnis 1:100 mit dem Peptonwasser beimpft und 16 bis 18 Stunden bei 42°C inkubiert. Diese Lösung wurde auf die Selektivnährböden RAMBACH-Agar (1.13108.0001; Merck, Darmstadt) und Xylose-Laktose-Dextrose-Agar (PO 5057 A, Oxoid, Wesel) abgeimpft und bei 37°C bis zu 48 Stunden bebrütet. Anschließend fand eine Keimdifferenzierung nach den üblichen serologischen und biochemischen Methoden statt.

3.6.4. Histologische Untersuchungen

In einigen wenigen Fällen wurde eine histologische Untersuchung nach den in der Routinediagnostik üblichen Methoden an der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule durchgeführt.