3.2 Material und Methode
3.2.1 Versuchsdurchführung
3.2.1.5 Analytik
3.2.1.5.7 Bestimmung der Nukleobasenkonzentrationen
Die Konzentrationen der folgenden Nukleobasen bakteriellen Ursprungs wurden an einer HPLC-Anlage mit UV-Detektor analysiert (s. Tabelle 3.4):
Pyrimidinbasen: Cytosin, Thymin und Uracil Purinbasen: Guanin und Adenin
Durch Aufbereitung wurde die Bakterienfraktion der Proben erhalten (s. Abbildung 3.5). Im ersten Zentrifugationsschritt wurden Protozoen und Pflanzenteile abgetrennt.
Abb. 3.4: Probenaufbereitung bakterielles Protein, modifiziert nach SMITH und McALLAN (1974)
1Abtrennung Protozoen und Pflanzenteile: Tischzentrifuge UNIVERSAL 1200 (Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland)
2Aufschluss bakterieller Zellwände: Ultraschall-Homogenisator Sonopuls HD 60 (BANDELIN electronic GmbH & Co KG, Berlin, Deutschland)
3Abtrennung bakterieller Zellwand- und Zellorganellfragmente: Standzentrifuge UJ3S (Christ GmbH heute Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode, Deutschland)
54 Eigene Untersuchungen
Die weiteren Zentrifugationen dienten der Konzentrierung der Bakterienfraktion.
Nach der Hydrolyse der Bakterien konnten die gelösten Nukleobasen mit der HPLC bestimmt werden. Die HPLC-Anlage wurde dazu mit einem externen Standard (s.
Kapitel 9.5.1) kalibriert. Die Proben wurden nach dem Auftauen mit einer Spritze manuell in das Rheodyne-7125-Ventil (Rheodyne Inc., Cotati, CA, USA) injiziert und
Abb. 3.5: Probenaufbereitung Nukleobasen
1Tischzentrifuge UNIVERSAL 1200 (Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland)
2Standzentrifuge UJ3S (Christ GmbH heute Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode, Deutschland)
3Wärmeschrank Tv15u (Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Deutschland)
aNatriumchlorid (Art.-Nr. 106404, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
bPerchlorsäure 70 % (Art.-Nr. P/1280/PB17, Fisher Scientific UK Ltd., Loughborough, UK)
cLaborglasflasche SCHOTT Duran® 25 ml (Duran Group GmbH, Mainz, Deutschland)
dRundfilter MN 615, ⌀ 90 mm (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Deutschland)
Eigene Untersuchungen 55
über dieses dem Eluentenfluss zugeführt. Zur Zusammensetzung des Eluenten s.
Kapitel 9.5.2.
Tab. 3.4: Komponenten und Einstellungen der HPLC-Anlage
Pumpe 2150 HPLC Pump (LKB, Stockholm, Schweden)
Flussrate: 1 mℓ/min, isokratisch
Degaser S 7505 Vacuum Degaser (Sykam Vertriebs GmbH, Fürstenfeldbruck, Deutschland)
Säulenofen
CTO-10ASvp Column Oven (Shimadzu, Kyoto, Japan)
Temperatur: 40 °C Vorsäule
ReproSil-Pur ODS-3 (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Deutschland)
Partikelgröße: 5 µm Dimension: 20 x 4,6 mm Säule
ReproSil-Pur ODS-3 (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Deutschland)
Partikelgröße: 5 µm Dimension: 150 x 4,6 mm UV-Detektor
Variable Wavelength Monitor (KNAUER wissen-schaftliche Geräte GmbH, Berlin, Deutschland) Wellenlänge: 260 nm
Integrator Chromatopac C-R4AX (Shimadzu, Kyoto, Japan) 3.2.1.5.8 Bestimmung der Konzentrationen flüchtiger Fettsäuren
Mit Hilfe des Gaschromatographen GC-9AM mit Flammenionisationsdetektor (Shimadzu, Kyoto, Japan) konnten die Konzentrationen der folgenden flüchtigen Fettsäuren in der Inkubationsflüssigkeit ermittelt werden:
Essigsäure
Die Gesamtkonzentration flüchtiger Fettsäuren wurde rechnerisch durch Summation der Einzelkonzentrationen bestimmt.
56 Eigene Untersuchungen
Abb. 3.6: Probenaufbereitung flüchtige Fettsäuren
1Tischzentrifuge UNIVERSAL 1200 (Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland)
ainterner Standard: 100 mℓ konz. Ameisensäure + 1 mℓ 4-Methyl-Valeriansäure (Art.-Nr. 100264 bzw.
8.06088.0050, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
bAutosampler-Vial 32 × 12 mm (Art.-Nr. 27200, LAT GmbH, Garbsen, Deutschland) mit Schraubverschluss und Septum (Art.-Nr. 70666, LAT GmbH, Garbsen, Deutschland)
cReagiergefäß 2mℓ (Art.-Nr.: 72.689.002, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland)
Durch Zugabe von konzentrierter Ameisensäure zur Inkubationsflüssigkeit wurde infolge der Proteinfällung die weitere enzymatische Fermentation in der Probe gestoppt. Als interner Standard für die gaschromatographische Analyse fungierte 4‑Methyl-Valeriansäure. Zur weiteren Probenaufbereitung s. Abbildung 3.6.
Der Gaschromatograph war mit zwei Säulen und einem automatischen Probengeber AOC-9 (Shimadzu, Kyoto, Japan) ausgestattet, der jeweils 1 µℓ Probe injizierte. Die Proben des ersten Versuchs mit der einfachen Klinofeed®-Dosis wurden sämtlich auf der ersten Säule gemessen, die des zweiten Versuchs (doppelte Dosis Klinofeed®) auf der zweiten. Bei den Säulen handelte es sich um Glassäulen (Art.-Nr.
221-14368-21, Shimadzu, Kyoto, Japan), die mit PT 10 % AT – 1200 + 1 % H3PO4
auf Chromosorb WAW, 80/100 [W. C. Grace & Co (vormals Alltech Associates Inc.), Columbia, MD, USA] gefüllt waren.
Eigene Untersuchungen 57
Tab. 3.5: Einstellungen und verwendete Gase am GC-9AM
Injektortemperatur 170 °C
Art.-Nr. P1711L50R2A001, Air Liquide GmbH, Düsseldorf, Deutschland 0,4 kg/cm2
Detektortemperatur 220 °C
Der an den GC angeschlossene Integrator Chromatopac C-R4A (Shimadzu, Kyoto, Japan) wertete die Detektorsignale unter Einbeziehung der bei der Kalibration mit einem externen Standard (s. Kapitel 9.6) ausgewiesenen Eichfaktoren aus.
3.2.1.5.9 Bestimmung der Glucosekonzentration
Die Glucosekonzentration wurde photometrisch mit dem Analyseautomaten Cobas Mira plus (Roche Diagnostics, F. Hoffmann-La Roche AG, Basel, Schweiz) im Klinischen Labor der Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, bestimmt. Hierfür wurden 0,2 mℓ Inkubationsflüssigkeit mit 1 mℓ 0,33 molarer Perchlorsäure (Art.-Nr. 125369, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) versetzt und bei 1750 × g 20 min zentrifugiert, um die Probe zu enteiweißen. Der Überstand wurde in ein Reagiergefäß (Art-Nr. 72.689.001, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland) pipettiert und bis zur Messung bei −18 °C gelagert. Für die Messung am Analyseautomaten mussten nach dem Auftauen 10 µℓ Probe mit 1 mℓ Reaktionslösung (Glucose Hexokinase Fluid 5+1, Art.-Nr. 553-230, mti diagnostics GmbH, Idstein, Deutschland) 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, so dass folgende Reaktionen ablaufen konnten:
Glucose + ATP Hexokinase
Glucose-6-phosphat (G6P) + ADP G6P + NADP+ G6P-Dehydrogenase
Gluconat-6-phosphat + NADPH + H+
Das entstandene NADPH2 war proportional zur Glucosekonzentration und bestimmte die Extinktion der Probe, die bei einer Wellenlänge von 340 nm gegen einen
58 Eigene Untersuchungen
Leerwert gemessen wurde. Diese Differenz aus Probenwert und Blindwert multipliziert mit 15,8 ergab die Glucosekonzentration in mmol/ℓ. (Näheres s.
Methodenbeschreibung mti diagnostics GmbH, Idstein, Deutschland.) 3.2.1.5.10 Bestimmung der Protozoenmotilität
Unter dem Mikroskop (SK 14, PZO Mikroskopy i wyroby optyczne Sp. z o. o., Warschau, Polen) wurde bei 160facher Vergrößerung die Motilität der Protozoen (Bewegung vorwärts bzw. rotierend) anhand des von Irle (2011) entwickelten Scores (s. Tabelle 3.6) beurteilt. Auf einen auf 39 °C vorgeheizten Objektträger wurde ein Tropfen (100µℓ) Inkubationsflüssigkeit gegeben und vorsichtig ein wenig ausgestrichen. Der gesamte Tropfen wurde durch meanderförmige Musterung gescort. Die Beurteilung wurde immer von derselben Person vorgenommen.
Tab. 3.6: Kriterien zur Beurteilung der Protozoenmotilität (Irle 2011)
ProMo-Score-Einheit Motilität
1 Keine Motilität erkennbar.
2 Protozoen zeigen rotierende Bewegungen oder lediglich Strudelbewegungen der Cilien am Vestibulum.
3 Protozoen zeigen rotierende Bewegungen oder bewegen sich so langsam durch den Bildausschnitt, dass man sie mehrere Sekunden beobachten kann.
4 Zwei Drittel der Protozoen zeigen gute Motilität, ein Drittel weist langsamere Bewegungen auf oder verbleibt in Rotation im Bildausschnitt.
5 Protozoen zeigen gute Motilität, eine Verfolgung einzelner Protozoen ist aber möglich.
6 Zwei Drittel der Protozoen zeigen maximale Motilität, ein Drittel erscheint weniger motil.
7 Protozoen zeigen höchste Motilität, eine Verfolgung einzelner Protozoen ist nicht möglich.
Wegen der Heterogenität der Motilität der Protozoen innerhalb einer Probe wurde der Score modifiziert. Die Abstufung des Intervalls zwischen zwei definierten Scorepunkten erfolgte in 0,25er Schritten: Eine Probe, in der mehr Protozoen die Kriterien des niedrigeren Scores erfüllten, erhielt diesen Score plus 0,25 Einheiten.
Eine Probe, in der mehr Protozoen die Kriterien des höheren Scores erfüllten, erhielt den niedrigeren Score plus 0,75 Einheiten. Entsprechend bekam eine Probe den
Eigene Untersuchungen 59
niedrigeren Score plus 0,5 Einheiten, wenn der Anteil der beweglicheren Protozoen sich mit dem Anteil der weniger beweglichen die Waage hielt.
3.2.1.5.11 Bestimmung der Protozoenkonzentrationen differenziert nach Größe Die Differenzierung und Zählung der Pansenprotozoen geschah lichtmikroskopisch unter Zuhilfenahme einer modifizierten Nageotte-Zählkammer (Sonderanfertigung:
Tiefe 0,5 mm, 20reihiges Streifenzählnetz mit einer Kantenlänge von 10 × 0,5 mm, W. Schreck, Hofheim/Taunus, Deutschland). Zu 1 mℓ vorgelegter Fixier- und Färbemischung nach OGIMOTO und IMAI (1981, s. Kapitel 9.7) wurde 1 mℓ Inkubationsflüssigkeit pipettiert. Um die Protozoen nicht zu quetschen, wurden dabei um 8 mm gekürzte Pipettenspitzen (Art.-Nr. 70.762, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland) verwendet. Durch die Färbelösung wurden die Protozoen abgetötet und fixiert und ihr Makronukleus grün angefärbt. Die Röhrchen wurden verschlossen (Reagenz-/Zentrifugengläser, Art.-Nr. 297830055, Micro-Bio-Tec Brand, Gießen, Deutschland; Lamellenstopfen, Art.-Nr. 01.624.0100, Böttger oHG, Bodenmais, Deutschland) und zur sorgfältigen Durchmischung zwei- bis dreimal vorsichtig über Kopf geschwenkt. Bis zur Zählung wurden die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt. Um einen repräsentativen Tropfen Inkubationsflüssigkeit auszuzählen, wurden die Proben vor der Zählung erst 30 s von Hand geschwenkt und anschließend bei einer Frequenz von 150 Auf- und Abbewegungen pro Minute mindestens 10 min auf einem Schüttler (GFL® Typ 3016, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel, Deutschland) durchmischt. Die Proben wurden mit physiologischer Kochsalzlösung (Natriumchlorid, Art.-Nr. 106404, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland, gelöst in A. bidest.) 1:5 verdünnt, so dass ungefähr 100–150 Protozoen in einem Kammervolumen enthalten waren. Die Nageotte-Zählkammer wurde beschickt, indem Probenlösung per Kapillarkraft aus der Pipettenspitze (s. o.) unter das Deckglas gesogen wurde. Unter dem Mikroskop (Telaval 31, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland) konnten bei 200facher Vergrößerung die Protozoen entsprechend ihrer Größe differenziert (klein: <80 µm, mittel: 80–120 µm und groß: >120 µm) und gezählt werden. Die Protozoenkonzentrationen in Anzahl Protozoen pro Milliliter errechneten sich aus den
60 Eigene Untersuchungen
Zählergebnissen multipliziert mit 300 (Kammervolumen 20 µℓ × Verdünnungsfaktor 6).
3.2.1.5.12 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung wurde mithilfe des Programms SAS Enterprise Guide (Version 7.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) unter Verwendung statistischer Routineverfahren durchgeführt (SACHS 1997). Dafür wurden zunächst mit Microsoft Office Excel® 2010 (Microsoft, Redmond, WA, USA) die zwei gleichzeitig erhobenen Messwerte der Kontroll- bzw. der Zulagefermenter als arithmetischer Mittelwert zusammengefasst. Falls es bei der Probengewinnung zu einem Fehler gekommen war und eine Probe verworfen wurde, ging der verbliebene Einzelmesswert in die statistischen Berechnungen ein. Wurden beide Proben eines Messzeitpunkts verworfen, reduzierte sich der Stichprobenumfang von n = 45 (erster Versuch) bzw.
n = 11 (zweiter Versuch) entsprechend. Für die Deskription der Ergebnisse wurde der Median zusammen mit dem unteren und oberen Quartil gewählt, weil sich einerseits im Shapiro-Wilk-Test einige Parameter als nicht normalverteilt herausstellten (zumal bei dem geringen Stichprobenumfang des zweiten Versuchs), zum anderen weil die Parameter zur Protozoenbeurteilung eine Ordinalskala bzw.
distinkte Werte aufwiesen. Die gemittelten Messwerte der Kontroll- und der Zulagefermenter zu einem Probennahmezeitpunkt bzw. einem Inkubationsintervall wurden mittels t-Test für zwei verbundene Stichproben oder bei nicht normal verteilten Daten mittels Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test hinsichtlich eines signifikanten Einflusses von Klinofeed® verglichen. Als Irrtumswahrscheinlichkeit wurde ein p-Wert <0,05 vorgegeben. Für alle Berechnungen wurde die Prozedur UNIVARIATE verwendet.
Ergebnisse 61
4 Ergebnisse
In den Abbildungen dieses Kapitels sind signifikante Unterschiede zwischen den Fermentergruppen (K- vs. Z-Fermenter) folgendermaßen gekennzeichnet:
für p <0,05, für p <0,01 und für p <0,001.
4.1 Redoxpotential
Zu Beginn der Inkubation (erster Versuch, einfache Klinofeed®-Dosis) lag das Redoxpotential in den Kontroll- bzw. Zulagefermentern bei −355 bzw. −365 mV (Abb. 4.1). Innerhalb des ersten Inkubationsintervalls kam es zu einem deutlicheren Abfall des Potentials in den K- als in den Z-Fermentern. Die Fermentergruppen unterschieden sich nach drei Stunden signifikant (−401 mV vs. −388 mV, p = 0,002).
Nach sechsstündiger Inkubation lag das Redoxpotential in den K-Fermentern nahezu unverändert bei −402 mV, in den Z-Fermentern bei −394 mV.
-440 -420 -400 -380 -360 -340 -320 -300
0 h 3 h 6 h
mV
**
Abb. 4.1: Redoxpotentiale (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (einfache Dosis, n = 41).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
62 Ergebnisse
Im zweiten Versuch (doppelte Zeolithdosis) lag das Ausgangspotential bei −359 mV in den unbehandelten Fermentern respektive bei −342 mV in den behandelten (Abb. 4.2). Während der ersten Inkubationshälfte fiel das Potential in den entsprechenden Fermentern mit 12,8 bzw. 14,9 % moderat ab (−405 mV vs.
−393 mV, p = 0,001). In der zweiten Inkubationshälfte sank das Redoxpotential nur noch minimal (−408 bzw. −403 mV in den K- bzw. Z-Fermentern, p = 0,001).
-440 -420 -400 -380 -360 -340 -320 -300
0 h 3 h 6 h
mV
** **
Abb. 4.2: Redoxpotentiale (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (doppelte Dosis, n = 11).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
Ergebnisse 63
Die Potentialänderungen (Differenzen der am Ende und zu Beginn der jeweiligen Inkubationsintervalle gemessenen Redoxpotentiale) in den vier Fermentergruppen der zwei Versuche verliefen ähnlich (Abb. 4.3 und Abb. 4.4). Über die gesamte Inkubationsdauer war ein Abfall zu verzeichnen (einfache Dosis: K-Fermenter:
−33,5 mV, Z-Fermenter: −38,0 mV; doppelte Dosis: K-Fermenter: −54,5 mV, Z-Fermenter: −52,0 mV), der in den ersten drei Stunden deutlich ausfiel (einfache Dosis: K-Fermenter: −35,0 mV, Z-Fermenter: −33,5 mV; doppelte Dosis:
K-Fermenter: −49,5 mV, Z-Fermenter: −45,0 mV), im zweiten Inkubationsintervall hingegen kaum noch nennenswert war (einfache Dosis: K-Fermenter: −1,0 mV, Z-Fermenter: −4,5 mV, p = 0,035; doppelte Dosis: K-Fermenter: −4,0 mV, Z-Fermenter: −7,0 mV).
-90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10
0 - 3 h 3 - 6 h 0 - 6 h
mV
*
Abb. 4.3: Redoxpotentialänderungen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (einfache Dosis, n = 41).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
64 Ergebnisse
-90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10
0 - 3 h 3 - 6 h 0 - 6 h
mV
Abb. 4.4: Redoxpotentialänderungen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (doppelte Dosis, n = 11).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
Ergebnisse 65
4.2 pH-Wert
Zu Versuchsbeginn (erster Versuch) unterschieden sich die pH-Werte der K- und Z-Fermenter mit 6,34 zu 6,28 geringfügig (p = 0,0022, Abb. 4.5). Nach drei Stunden lag der pH-Wert in den K-Fermentern nahezu auf Ausgangsniveau bei 6,33 und fiel dann in der zweiten Inkubationshälfte auf 6,17 ab. Im Gegensatz dazu stieg der pH-Wert in den Z-Fermentern zunächst auf 6,32 an, um im Verlauf der weiteren Inkubation mit 6,26 fast auf seinen Ausgangswert zurückzukehren, so dass der Unterschied zwischen den Fermentergruppen wieder signifikant war (p = 0,0075).
5,90 6,00 6,10 6,20 6,30 6,40 6,50 6,60
0 h 3 h 6 h
pH-Wert
**
**
Abb. 4.5: pH-Werte (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (einfache Dosis, n = 42).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
66 Ergebnisse
Für die pH-Wertänderungen (erster Versuch) als Differenzen der zu den einzelnen Zeitpunkten gemessenen pH-Werte ergaben sich entsprechend unterschiedliche Verläufe (Abb. 4.6). In den unbehandelten Fermentern war ein in beiden Inkubationshälften beinahe identischer Abfall um 0,07 bzw. 0,08 Einheiten zu verzeichnen. Anders in den behandelten Fermentern, in denen es zunächst zu einem Anstieg um 0,05 Einheiten kam, während in der zweiten Inkubationshälfte ein Absinken um 0,09 Einheiten zu verzeichnen war (Unterschied zu den K-Fermentern signifikant, p = 0,049). Innerhalb der sechsstündigen Inkubation sank der pH-Wert in den Kontrollfermentern um 0,16 Einheiten. Die Netto-Abnahme in den Z-Fermentern fiel mit 0,05 Einheiten deutlich geringer aus (p = 0,0017).
-0,50 -0,40 -0,30 -0,20 -0,10 0,00 0,10 0,20 0,30
0 - 3 h 3 - 6 h 0 - 6 h
pH
**
*
Abb. 4.6: pH-Wertänderungen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (einfache Dosis, n = 42).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
Ergebnisse 67
Im zweiten Versuch starteten die pH-Werte der K- und Z-Fermenter auf einem geringgradig niedrigeren Niveau als im ersten Versuch und lagen mit 6,22 bzw. 6,24 nah beieinander (Abb. 4.7). Die K-Fermenter verhielten sich analog zu den unbehandelten Fermentern im ersten Versuch; nach drei Stunden war der pH-Wert stabil geblieben und nahm erst im zweiten Inkubationsintervall auf 6,08 ab. Der Verlauf in den Z-Fermentern war ähnlich und damit anders als im Versuch mit der einfachen Dosis; statt anzusteigen war der pH-Wert am Ende der ersten Inkubationshälfte geringfügig auf 6,21 gesunken. Es folgte ein weiterer Rückgang auf 6,14 zum Ende der Inkubation, so dass das pH-Niveau geringfügig über dem der K-Fermenter lag (p = 0,043).
5,90 6,00 6,10 6,20 6,30 6,40 6,50 6,60
0 h 3 h 6 h
pH-Wert *
Abb. 4.7: pH-Werte (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (doppelte Dosis, n = 11).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
68 Ergebnisse
Innerhalb der ersten drei Stunden der Inkubation (zweiter Versuch) änderten sich die pH-Werte so minimal, dass die Differenz der pH-Werte zu diesen Messzeitpunkten für die K-Fermenter lediglich einer Abnahme um 0,02 Einheiten entsprach und gleichzeitig für die Z-Fermenter gar keine pH-Wertänderung ermittelt wurde (Abb.
4.8). Die zweite Inkubationshälfte zeigte Rückgänge um 0,09 und 0,08 Einheiten in den unbehandelten bzw. den behandelten Fermentern, die sich mit denen aus dem ersten Versuch deckten. Über die gesamte Inkubationsdauer sanken die pH-Werte um durchschnittlich 0,12 bzw. 0,09 Einheiten in den K- und Z-Fermentern.
-0,50 -0,40 -0,30 -0,20 -0,10 0,00 0,10 0,20 0,30
0 - 3 h 3 - 6 h 0 - 6 h
pH
Abb. 4.8: pH-Wertänderungen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (doppelte Dosis, n = 10).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
Ergebnisse 69
4.3 Glucose
Die als Nährstoff zugesetzte Glucose wurde durchweg innerhalb der ersten Inku-bationshälfte weitgehend abgebaut (≥95 %). Deshalb wurde auf die Bestimmung der Glucosekonzentration nach sechsstündiger Inkubation verzichtet. Ausgehend von ca.
30 mmol/ℓ waren nach drei Stunden nur noch 1,50 bzw. 1,11 mmol/ℓ Glucose in den K-Fermentern und 1,16 bzw. 0,81 mmol/ℓ in den Z-Fermentern enthalten (erster bzw.
zweiter Versuch, Abb. 4.9 und Abb. 4.10). Diese Konzentrationsabnahmen entsprachen einem Glucoseabbau (Differenz der Konzentrationen zweier Messzeitpunkte multipliziert mit dem Volumen der Inkubationssuspension) von 11,3 mmol sowohl in den unbehandelten als auch in den behandelten Fermentern des ersten Versuchs und einer vergleichbaren Nutzung von 11,5 bzw. 11,4 mmol Glucose in den K- und Z-Fermentern im Versuch mit der erhöhten Klinofeed®-Dosis (Abb. 4.11).
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0
0 h 3 h
mmol/l
Abb. 4.9: Glucosekonzentrationen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während dreistündiger Inkubation in vitro (einfache Dosis, n = 42).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
70 Ergebnisse
Abb. 4.10: Glucosekonzentrationen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während dreistündiger Inkubation in vitro (doppelte Dosis, n = 11).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
5,0
Abb. 4.11: Glucoseabbau (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während dreistündiger Inkubation in vitro (n = 39 bzw. n = 11).
– ohne Klinofeed®-Zulage – mit Klinofeed®-Zulage (einfache Dosis) – ohne Klinofeed®-Zulage – mit Klinofeed®-Zulage (doppelte Dosis)
, , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
Ergebnisse 71
4.4 Flüchtige Fettsäuren 4.4.1 Essigsäure
An den Versuchstagen mit einfacher Zulage stieg die Essigsäurekonzentration in den Fermentern ausgehend von 37,0 mmol/ℓ (unbehandelt) bzw. 37,1 mmol/ℓ (behandelt) über die gesamte Inkubationsdauer um insgesamt 25,4 bzw. 23,2 % an (Abb. 4.12).
Die bedeutendere Zunahme vollzog sich in den ersten drei Stunden (+15,7 bzw.
+16,2 %). Nach dieser Zeitspanne wurden 42,8 mmol/ℓ Essigsäure in den K-Fermentern und 43,1 mmol/ℓ in den Z-Fermentern gemessen (p = 0,0037). Dieser geringgradige Konzentrationsunterschied kehrte sich nach weiteren drei Stunden um (K-Fermenter: 46,4 mmol/ℓ, Z-Fermenter: 45,7 mmol/ℓ).
30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0
0 h 3 h 6 h
mmol/l
**
Abb. 4.12: Essigsäurekonzentrationen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (einfache Dosis, n = 42).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
72 Ergebnisse
Die berechnete Essigsäureproduktion unterschied sich bei einfacher Dosierung des Zeoliths zwischen K- und Z-Fermentern deutlich (Abb. 4.13). Während in den unbehandelten Fermentern innerhalb des ersten Inkubationsintervalls 2,55 mmol Essigsäure produziert wurden, entstanden in den Z-Fermentern 2,22 mmol (p = 0,0098). Das entsprach einem Minus von 12,9 %. In den zweiten drei Stunden der Inkubation wurden in den K-Fermentern noch 0,9 mmol der Säure produziert. In diesem Zeitraum lag die Produktionsrate in den Z-Fermentern um 34,4 % höher bei 1,21 mmol. Auf die Gesamtinkubation gesehen entstanden 3,50 bzw. 3,25 mmol Essigsäure in den unbehandelten bzw. behandelten Fermentern. Die Differenz der beiden Gruppen belief sich auf 7,1 %.
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00
0 - 3 h 3 - 6 h 0 - 6 h
mmol
**
Abb. 4.13: Essigsäureproduktionen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (einfache Dosis, n = 42).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
Ergebnisse 73
Bei doppelter Klinofeed®-Dosis entwickelten sich die Essigsäurekonzentrationen prinzipiell wie im ersten Versuch (Abb. 4.14). Die Ausgangskonzentrationen in den K- und den Z-Fermentern lagen bei 39,6 und 38,5 mmol/ℓ (p = 0,0137) und damit geringfügig höher als im ersten Versuch. Im Verlauf der Inkubation nahmen die Konzentrationen insgesamt um 24,7 % (unbehandelt) und 27,8 % (behandelt) auf 49,4 bzw. 49,2 mmol/ℓ zu. Wiederum fiel der höhere Konzentrationsanstieg in die erste Inkubationshälfte; 45,1 mmol/ℓ in den unbehandelten Fermentern entsprachen 13,9 % mehr Essigsäure als zu Beginn, 45,8 mmol/ℓ in den Zulagefermentern ergaben sogar einen Anstieg um 19,0 %.
30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0
0 h 3 h 6 h
mmol/l
*
Abb. 4.14: Essigsäurekonzentrationen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (doppelte Dosis, n = 11).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
74 Ergebnisse
Im zweiten Versuch resultierte in den ersten drei Stunden in den K-Fermentern rechnerisch eine Produktion von 2,53 mmol Essigsäure, eine mit dem Ergebnis der K-Fermenter im ersten Versuch vergleichbare Menge (Abb. 4.15). In den Z-Fermentern wurden im selben Zeitraum 20,9 % mehr Essigsäure produziert (3,06 mmol). In der zweiten Inkubationshälfte zeigten beide Fermentergruppen mit 1,43 mmol (Kontrolle) und 1,49 mmol (Zeolith) eine ausgeglichenere Produktionsleistung. Der Produktionsunterschied der ersten drei Stunden spiegelte sich im Ergebnis der kompletten Inkubationsdauer wider: 3,67 mmol in den unbehandelten Fermentern standen 4,38 mmol in den behandelten Fermentern gegenüber (+19,3 %, p = 0,0137).
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00
0 - 3 h 3 - 6 h 0 - 6 h
mmol
*
Abb. 4.15: Essigsäureproduktionen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (doppelte Dosis, n = 11).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
Ergebnisse 75
4.4.2 Propionsäure
Bei einfacher Zeolithdosis lagen die Propionsäurekonzentrationen in den unbehandelten und den behandelten Fermentern dicht beieinander (Abb. 4.16). Von anfänglich 10,9 bzw. 10,7 mmol/ℓ in den K- bzw. Z-Fermentern stieg der Gehalt mit zunehmender Inkubationsdauer auf 14,2 respektive 14,1 mmol/ℓ nach drei Stunden und weiter auf 16,2 mmol/ℓ in beiden Fermentergruppen am Ende der Inkubation.
Wie bei der Essigsäure war der größere Konzentrationsanstieg mit 30,3 bzw. 31,8 % in der ersten Inkubationshälfte zu verzeichnen. Insgesamt kam es zu einer Erhöhung der Propionsäurekonzentration um 48,6 % in den K-Fermentern und um 51,4 % in den Z-Fermentern.
10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0 22,0
0 h 3 h 6 h
mmol/l
Abb. 4.16: Propionsäurekonzentrationen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (einfache Dosis, n = 42).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
76 Ergebnisse
Die berechneten Produktionsmengen der Propionsäure (erster Versuch) unterschieden sich zwischen K- und Z-Fermentern kaum (Abb. 4.17). Innerhalb des ersten Inkubationsintervalls wurden 1,29 bzw. 1,27 mmol produziert. Im zweiten Intervall wurden in den unbehandelten Fermentern weitere 0,69 mmol produziert, in den behandelten 0,77 mmol. Auf die gesamte Inkubationsdauer gesehen entstanden in den K-Fermentern 2,00 mmol Propionsäure, in den Z-Fermentern 5,50 % mehr (2,11 mmol).
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00
0 - 3 h 3 - 6 h 0 - 6 h
mmol
Abb. 4.17: Propionsäureproduktionen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (einfache Dosis, n = 42).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
Ergebnisse 77
Im zweiten Versuch wurden zu Inkubationsbeginn geringfügig unterschiedliche Propionsäurekonzentrationen in den K- und Z-Fermentern gemessen (13,0 zu 12,6 mmol/ℓ, p = 0,0049, Abb. 4.18). Wie schon bei der einfachen Dosis nahm die Konzentration in der ersten Inkubationshälfte stärker zu (+28,5 bzw. +28,6 % auf 16,7 bzw. 16,2 mmol/ℓ in den K- bzw. Z-Fermentern) als in der zweiten Hälfte. Nach sechs Stunden belief sich der Propionsäuregehalt der unbehandelten Fermenter auf 19,7 mmol/ℓ, was einen Anstieg um 51,5 % bezogen auf den Ausgangsgehalt darstellte. Im selben Zeitraum stieg der Gehalt in den behandelten Fermentern um 57,1 % auf 19,8 mmol/ℓ.
10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0 22,0
0 h 3 h 6 h
mmol/l
**
Abb. 4.18: Propionsäurekonzentrationen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (doppelte Dosis, n = 11).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
78 Ergebnisse
Im zweiten Versuch ergaben sich für die berechneten Propionsäureproduktionen größere prozentuale Unterschiede zwischen den Fermentergruppen als im ersten Versuch (Abb. 4.19). Die ersten drei Inkubationsstunden erbrachten 1,54 mmol Propionsäure in den unbehandelten Fermentern. Gleichzeitig wurden in den behandelten Fermentern 1,88 mmol produziert, das entsprach 22,1 % mehr. In den folgenden drei Stunden entstand unbehandelt 1,00 mmol der Säure, während unter Zulage 1,06 mmol anfielen. Als Gesamtmenge standen 2,68 mmol Propionsäure der K-Fermenter 2,91 mmol der Z-Fermenter gegenüber (+8,58 %, p = 0,042).
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00
0 - 3 h 3 - 6 h 0 - 6 h
mmol
*
Abb. 4.19: Propionsäureproduktionen (Mediane und Interquartilsabstände) im Pansensaft während sechsstündiger Inkubation in vitro (doppelte Dosis, n = 11).
– ohne Klinofeed®-Zulage
– mit Klinofeed®-Zulage; , , : sign. Gruppenunterschied (p <0,05, p <0,01 bzw. p <0,001)
Ergebnisse 79
4.4.3 n-Buttersäure
Die Ausgangskonzentrationen für n-Buttersäure wichen bei einfacher Dosis des Zeoliths nur geringfügig voneinander ab (6,22 zu 6,13 mmol/ℓ in den K- bzw.
Z-Fermentern, Abb. 4.20). In den ersten drei Stunden stieg die Konzentration in den unbehandelten Fermentern um 38,7 % auf 8,63 mmol/ℓ an. In den behandelten
Z-Fermentern, Abb. 4.20). In den ersten drei Stunden stieg die Konzentration in den unbehandelten Fermentern um 38,7 % auf 8,63 mmol/ℓ an. In den behandelten