Beschreibung der Methoden

3.2.3.1 Blutprobenentnahme

Im Laufe der ersten Probenentnahmewoche wurde jeweils am Montag, Mittwoch und Freitag jeweils um 8:00 Uhr den Tieren Blut entnommen. Diese Uhrzeit wurde ge-wählt, um sicher zu stellen, dass die Tiere bereits einen Großteil der morgendlichen Futterration (Fütterung um 6:00 Uhr) aufgenommen hatten. Die Blutentnahme erfolg-te aus der Vena subcutanea abdominis miterfolg-tels einer Einmalkanüle. Je Tier und Entnahmezeitpunkt wurden eine Lithium-Heparin-Monovette^® (9 ml LH, Fa. Sarstedt) sowie EDTA-Monovette^® (9 ml K3E, Fa. Sarstedt) befüllt und im Anschluss bei

2000 g und 20 °C für 10 Minuten zentrifugiert (Varifuge 3.OR, Fa. Heraeus Sepatech). Im Anschluss wurde das Plasma der Lithium-Heparin-Monovetten^® auf sieben 1,5 ml-Tubes (PLASTIBRAND^®, Micro Tubes, Fa. Brand), das Plasma der EDTA-Monovetten^® auf jeweils drei 1,5 ml-Tubes (PLASTIBRAND^®, Micro Tubes, Fa. Brand) verteilt und bis zur weiteren Bestimmung der Plasmaparameter eingefro-ren.

3.2.3.2 Bestimmung von pansenphysiologischen Parametern

Zur Charakterisierung des Pansenmilieus und zur Bestimmung des Einflusses der Fütterungsstrategien auf die Fermentationsbedingungen im Pansen wurden in der ersten Probenentnahmewoche jeder Versuchsperiode an einem Versuchstag von den Versuchskühen Pansensaftproben entnommen. Die Entnahme erfolgte mittels einer Vakuum-Pumpe aus dem ventralen Pansensack. An dem Entnahmetag wurde von jedem Tier um 5:30, 6:30, 7:00, 7:30, 8:00, 9:00 und 11:00 Uhr jeweils etwa 100 ml Pansensaft gewonnen.

Anschließend erfolgte mittels einer Glaselektrode die pH-Wert-Messung der Probe.

Die Bestimmung der NH3-N-Konzentrationen (Kapitel 3.3.4) erfolgte mittels einer modifizierten CONWAY-Methode (VOIGT & STEGER 1967)^.

Für die Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren wurden die Proben mit den Entnahmezeitpunkten 1 h vor der Fütterung sowie 1 h, 2 h, 3 h, 5 h nach der Fütte-rung herangezogen. Hierzu wurde der Pansensaft 5 Minuten bei 3015 g (Varifuge GL) zentrifugiert und anschließend 10 ml des Überstandes mit 1 ml Schwefelsäure (25%ig) versetzt. Im Folgenden wurden die Proben 20 Minuten bei 3015 g zentrifu-giert. Die Pansensaftprobe wurde schließlich, nach Zusatz eines Tropfens gesättig-ten Quecksilberchlorids (HgCl2), bis zur weiteren gaschromatographischen Bestim-mung der flüchtigen Fettsäuren (Kapitel 3.3.5) tiefgefroren.

3.2.3.3 Ermittlung des Nährstoff-Flusses am Duodenum

3.2.3.3.1 Herstellung und Verabreichung des Chrommarkers

Um die Flussmengen am Duodenum festzustellen, wurde ein Marker aus Chromoxid verwendet. Für dessen Herstellung wurden 32,08 kg handelsübliches Weizenmehl, 8,02 kg Chrom(III)-Oxid (Fa. Merck) und 0,4 kg Aluminiumsulfathydrat (Al2(SO4)3 x H2O; Fa. Merck) intensiv zu einer homogenen Masse vermischt. Nach dem Mischen wurde so viel Wasser dazu gegeben, bis ein zäher Brei entstand (Hefeteigkonsis-tenz). Danach wurde diese Masse bei 60 °C getrocknet und im Anschluss zu einem Granulat mit einer Körnung von 3 mm gemahlen. Die für den Versuch benötigten Applikationsmengen von 25 g und 50 g des Chrommarkers wurden in Rundfiltern eingewogen und mit einem Klebestreifen verschlossen. Um zu gewährleisten, dass zwischen Markerzufuhr und Markerausscheidung bis zur Chymussammelwoche ein Gleichgewicht besteht, wurde bereits 11 Tage vor der Darmsaftsammlung mit der Markerapplikation begonnen. Dazu wurde bei den Versuchstieren zweimal am Tag (5:45 und 17:45 Uhr) je 50 g des Chrommarkers über die Pansenfistel verabreicht und mit Hilfe eines Stabes gut eingemischt. Einen Tag vor Beginn der Darmsaft-sammel-Woche wurden je 25 g Marker pro Tag zu den Zeitpunkten 5:45, 11:45, 17:45 und 23:45 Uhr appliziert, was über die gesamte Dauer der Darmsaftsammel-woche beibehalten wurde. Herstellung, Verabreichung und Bestimmung des Chrommarkers wurden in Anlehnung an die Methode von ROHR et al. (1979) durch-geführt^.

3.2.3.3.2 Gewinnung und Aufbereitung von Chymusproben

Die Darmsaftsammlung erfolgte an fünf aufeinander folgenden Tagen im Abstand von jeweils 2 Stunden, wobei pro Tier und Probenentnahme 4 x 100 ml Darmsaft aus der Duodenalkanüle entnommen wurden. Da nur geringe Unterschiede zur Total-sammlung hinsichtlich der ermittelten Flussmengen auftreten, ist diese Art der Stich-probensammlung zulässig.

Direkt im Anschluss an die Probengewinnung erfolgte mit einer Glaselektrode die pH-Wert-Messung der 4 x 100 ml Darmsaftproben. Da laut ROHR et al. (1979) durch Darmsekrete und rückgestauten Darminhalt Störeffekte bei der späteren Analytik auftreten können, wurde lediglich die Probe mit dem geringsten pH-Wert tierindividu-ell zu einer Tagessammelprobe zusammengefasst und eingefroren. Die restlichen 300 ml Pansensaft wurden verworfen. Durch diesen Ablauf konnten je Periode und Versuchstier fünf Tagessammelproben (ca. 1200 ml) gewonnen werden. Die Tages-sammelproben wurden zur weiteren Aufbereitung im Anschluss aufgetaut und gut durchmischt.

Für die Stickstoffbestimmung nach KJELDAHL wurde von jeder Tagessammelprobe nach dem Auftauen frischer Chymus zurückgehalten. Die Ammoniakbestimmung fand auch im aufgetauten Chymussekret statt. Dafür wurden die Tagessammelpro-ben von Mittwoch auf Donnerstag und Donnerstag auf Freitag genutzt und von die-sen Proben ein Teil des frisch aufgetauten Chymus entnommen. Der restliche Darm-chymus wurde gefriergetrocknet (CHRIST Epsilon 1-15, Martin Christ GmbH und Co KG, Deutschland) und eine Bestimmung der Trockensubstanz vorgenommen. Im Anschluss erfolgte eine Vermahlung auf 1 mm Korngröße. Die gefriergetrockneten Proben wurden nach dem Mahlvorgang bis zur weiteren Analysenutzung im Dunkeln bei 12 °C aufbewahrt.

Als Grundlage zur Berechnung der Trockensubstanz (TS)-Flussmengen je Tier und Tag am Duodenum wurde die Chromkonzentration in den Duodenalsammelproben jedes Tages bestimmt (Kapitel 3.3.7).

Der Trockensubstanzfluss am Duodenum ließ sich danach mit folgenden Formeln berechnen:

ℎ = × ℎ

= ℎ

ℎ /1000

Die Nährstoffflüsse am Duodenum ergeben sich aus dem Fluss der Darmchymustrockenmasse und den entsprechenden Nährstoffgehalten in der Chymustrockenmasse (ROHR et al. 1979).

3.2.3.4 Totalsammlung von Kot und Urin

Während der zweiten Probenentnahmewoche fand von Montagmorgen bis Sams-tagmorgen bei den Versuchstieren eine fünftägige Totalsammlung von Kot und Urin statt. Zu diesem Zweck wurde an den Tieren ein Urinal befestigt, welches die Tren-nung von Harn und Kot ermöglichte. Durch ein Schlauchsystem, welches das Urinal mit einem Behälter verband, wurden die Urinmengen vollständig gesammelt. Der Kot wurde durch den Spaltenboden hindurch in einer Wanne aufgefangen. Morgens um 5:00 Uhr wurde für jedes Tier die Urinmenge durch Wiegen des Urinauffanggefäßes bestimmt und eine Teilprobe aus dem Behälter entnommen (250 ml). Bis zur weite-ren Verarbeitung (Kapitel 3.3.10, 3.3.11) wurde die Probe eingefroweite-ren und der Behäl-ter entleert, so dass eine neue 24-Stunden-Sammlung begann. Der Kot wurde zur weiteren Verarbeitung aus den Auffangwannen entnommen und in einen Kübel ge-füllt.

Nachdem der Kot vollständig entnommen war, wurden die Auffangbehälter gewa-schen, so dass eine neue Kot-Sammlung beginnen konnte. Im Anschluss wurde die Kotmenge aus dem Behälter bestimmt und die Masse mit einem Rührer homogeni-siert, damit danach 1% der Kotmenge von jedem Tier entnommen werden und als Poolprobe der Woche tierindividuell eingefroren werden konnten. Im Anschluss an die Sammelwoche wurden die Poolproben des Kotes aufgetaut, 72 Stunden gefrier-getrocknet (CHRIST Epsilon 1-15, Martin Christ GmbH und Co KG, Deutschland) und eine Bestimmung der Trockensubstanz vorgenommen. Danach erfolgte eine Vermahlung auf 1 mm Korngröße. Die gefriergetrockneten Proben wurden nach dem Mahlvorgang bis zur weiteren Analysenutzung (Kapitel 3.3.10, 3.3.11) im Dunkeln bei 12 °C aufbewahrt.

3.2.3.5 Milchproben

In der zweiten Probenentnahmewoche wurden von jedem Tier an vier Tagen Milch-proben genommen. Die Probenentnahme erfolgte Montagabend und Dienstagmor-gen sowie Donnerstagabend und FreitagmorDienstagmor-gen. Die Proben zur Bestimmung der Milchinhaltsstoffe (Fett, Eiweiß, Laktose, Harnstoff) und der Zellzahl wurden mit

Kaliumdichromat konserviert und zum Milchwirtschaftlichen Kontroll- und Untersu-chungsverband Uelzen E.V. gegeben. Ein anderer Teil der Milchproben (je etwa 250 ml) wurde in Flaschen abgefüllt und bis zur weiteren Calcium-, Phosphor- und Mag-nesiumbestimmung bei -20 °C eingefroren (Kapitel. 3.3.11).