Bakteriologische Untersuchung

Im Labor des Instituts für Lebensmittelqualität und –sicherheit wurde die ITC-Bouillon mit den Kot- und Tonsillenproben homogenisiert und für 48 h bei 25 °C bebrütet.

Danach wurde jeweils eine Impföse des Ansatzes als fraktionierter Ausstrich auf einen Yersinia-Selektivnährboden (CIN-Agar, Fa. Merck, Darmstadt) aufgetragen und für 48 h bei 30 °C bebrütet. Eine Kontrolle der Platten auf Yersinia-enterocolitica-verdächtige Koloniemorphologie („Kuhaugenform“: Kolonien < 1 mm, dunkelrotes Zentrum und schmale, transparente Randzone) fand erstmalig nach 24 h und abschließend nach insgesamt 48stündiger Bebrütung der Platten statt. Verdächtige Kolonien wurden auf einen Standard-I-Agar (Fa. Merck, Darmstadt) überimpft, um

Reinkulturen für weiterführende Untersuchungen zu erhalten.

3.2.1.2 Vordifferenzierung verdächtiger Kolonien

Verdächtige Kolonien wurden 24 h bei 30 °C auf dem unspezifischen Nährboden Standard-I-Agar bebrütet und die so erhaltene jeweilige Reinkultur folgenden Tests zur Vordifferenzierung unterzogen:

Oxidasenachweis

Mit einer Öse wurde Material der Reinkultur auf einem Cytochrom-Oxidase-Teststreifen verrieben. Färbt sich der Cytochrom-Oxidase-Teststreifen dunkelblau, ist in der Probe bakterielle Oxidase vorhanden. Kulturen der Yersinia spp. sind oxidasenegativ.

Wachstum auf Kligler-Eisen-Nährboden

Der Kligler-Eisen-Agar (Fa. Oxoid, Großbritannien), ein Schrägagar, wurde mittels Stichöse und Oberflächenausstrich beimpft und für 18-24 h bei 30 °C bebrütet. Bei positiver Reaktion kommt es, bedingt durch den Abbau des Zuckers unter Säurebildung, zu einem Farbumschlag von rot nach gelb. Kulturen der Yersinia spp.

sind Glucose-positiv und Laktose-negativ, so dass bei ihnen eine Gelbfärbung (Glucose-Verwertung) im Bereich des Stichkanals, jedoch nicht der Schrägfläche, (Laktose-Verwertung) zu beobachten ist.

Ureasenachweis

Zum Nachweis der Ureaseaktivität diente ein Harnstoff-Agar (Fa. Merck, Darmstadt), dessen Oberfläche mit Material der Reinkultur beimpft und für ebenfalls 18-24 h bei 30 °C bebrütet wurde. Ein Farbumschlag des Indikators Phenolrot von gelb nach rot gilt als positive Reaktion und erfolgt durch die Hydrolysierung des im Agar enthaltenen Harnstoffs zu Kohlenstoffdioxid und Ammoniak mittels bakterieller Urease. Kulturen der Yersinia spp. sind, ausgenommen Y. pestis und Y. ruckeri, ureasepositiv.

3.2.1.3 Identifizierung verdächtiger Kolonien

Alle verdächtigen Proben, die in der Vordifferenzierung für Yersinia spp. typische Reaktionen zeigten, wurden zur Identifizierung einer Objektträgerschnellagglutination und einer PCR unterzogen. Hierfür wurden ebenfalls Reinkulturen auf Standard-I-Agar für 24 h bei 30 °C subkultiviert.

Als Testreagenz bei der Objektträgerschnellagglutination dienten kommerziell erhältliche Testseren zum Nachweis von Yersinia-enterocolitica-O-Antigenen (Test Sera Anti-Yersinia Enterocolitica O-monospecific, Fa. Sifin, Berlin). Die serotypspezifischen Agglutinationsseren sowie sterile isotone Kochsalzlösung wurden entsprechend den Angaben des Herstellers als Tropfen auf einem Objektträger vorgelegt. Die Kochsalzlösung diente als Negativkontrolle. In die Tropfen wurde jeweils eine Öse Koloniematerial eingerieben und unter Schwenken auf flockige Agglutinationsbildung untersucht. Hierdurch ist die Zuordnung zu einer O-Gruppe möglich.

Zur weiteren Bestätigung und auch Abklärung der Humanpathogenität wurden die in der Vordifferenzierung positiven Proben einer PCR unterzogen. Bei dieser wurde ein Primer eingesetzt, der das ail-Gen vervielfältigt. Zum Einsatz kam dafür das Primerpaar A1/A2 (Tabelle 6), wodurch ein 425 bp großes DNA-Fragment amplifiziert wird (WANNET et al. 2001).

Tabelle 6: Basensequenz des eingesetzten Primerpaares A1/A2

Primer Primer-Sequenz PCR-Produkt

A1

5´-TTA ATG TGT ACG CTG GGA GTG-3´

A2

5´-GGA GTA TTC ATA TGA AGC GTC-3´

425 bp

Für die molekularbiologische Untersuchung wurde eine Impföse des Koloniematerials in sterilisiertem Aqua dest. in einem Eppendorfgefäß gelöst und die DNA mittels CTAB-Methode aus dieser Bakteriensuspension isoliert.

Die DNA-Extraktion nach der CTAB-Methode wurde wie folgt durchgeführt:

1. 1 ml der Bakteriensuspension abnehmen und in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführen

2. 10 min Zentrifugation bei 10000 g 3. Überstand verwerfen

4. Bakterienpellet in 1 ml CTAB-Puffer aufnehmen und suspendieren

5. 50 μl Lysozymlösung (10 mg/ml) und 50 μl RNAse (20 mg/ml) hinzugeben 6. 1 h bei 37 °C inkubieren

7. 25 μl Proteinase K (20 mg/ml) hinzufügen 8. 1 h bei 65 °C inkubieren

9. 1 Volumenteil Phenolchloroform zugeben 10. 15 min bei 8000 g zentrifugieren

11. Überstand abnehmen und 1 Volumenteil Chloroform hinzugeben 12. 15 min bei 8000 g zentrifugieren

13. Überstand abnehmen

14. 1 Volumenteil Isopropanolol und 0,1 Volumenteil Natriumacetat (3 M) zu dem Überstand geben, schütteln und 30 min bei Raumtemperatur fällen

15. 15 min bei 14000 g zentrifugieren und den Überstand verwerfen

16. 500 μl 75%iges Ethanol zugeben und 2 min zentrifugieren bei 10000 g 17. Überstand verwerfen und Pellet bei 60 °C im Heizblock trockenen 18. Pellet in 100 μl Tris-EDTA aufnehmen und bei -25 °C lagern

Bei der anschließenden PCR wurde ein Mastermix mit folgenden Komponenten je Probe eingesetzt:

16,5 μl Aqua dest.

1 μl desoxy-Nukleinsäuren (25 μmol/μl dNTP, Fa. Roth, Karlruhe) 2,5 μl 10x PCR-Puffer

1 μl MgCl (50 mM)

0,2 μl Taq-Polymerase (HotStartTaq™, Fa. Qiagen GmbH, Hilden) 1 μl Primer A1 (10 pmol/μl)

1 μl Primer A2 (10 pmol/μl)

Dieser Ansatz wurde in die PCR-Reaktionstubes vorgelegt und anschließend je 2 μl Template-DNA zugegeben. Zur Kontrolle der Reaktion wurden parallel eine Positivkontrolle (DSM 11502) und eine no template control (NTC) mitgeführt. Die Amplifikation erfolgte anschließend in einem Thermocycler (Biometra T Basic, Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen). Der zeitliche Ablauf der einzelnen Arbeitschritte ist in Abbildung 2 dargestellt.

Anfangsdenaturierung (3 min bei 95 °C)

Denaturierung der DNA 30 s bei 94 °C Anheftung der Primer an DNA 30 s bei 58 °C

Elongation 1 min bei 72 °C (35 Zyklen)

Endelongation 5 min bei 72 °C Abbildung 2: Schematische Darstellung der DNA-Elongation

Zur Visualisierung wurden die einzelnen Amplifikationsprodukte einer horizontalen Gelelektrophorese unterzogen. Dafür wurden die Proben neben einem Längenstandard (Fa. Cibus Biotech GmbH, Rheda-Wiedenbrück) mit definiertem Bandenmuster (2176 bp, 1788 bp, 1230 bp, 1033 bp, 653 bp, 517 bp, 453 bp, 394 bp, 298 bp, 234 bp, 220 bp, 154 bp) zur Bestimmung und Unterscheidung der Banden, der Positivkontrolle und der NTC in die einzelnen Kavitäten des Gels (1,5%iges Agarose-Gel mit 0,1 μg Ethidiumbromid/ml) geladen und die PCR-Produkte in einer Elektrophoresekammer (Fa. Life Technologies, USA) bei einer angelegten Spannung von 200 Volt für 30 min aufgetrennt.

Das Amplifikationsprodukt der verwendeten Primer hat eine Größe von 425 bp und ist an dieser Position unter ultravioletter Beleuchtung als Bande im Gel sichtbar (siehe Abbildung 3).

Abbildung 3: Amplifikationsprodukte (425 bp) und drei Längenstandards nach Gelelektrophorese unter UV-Licht